金属抗菌肽SIF_(4)对大肠杆菌拓扑异构酶活性及胞内核酸合成的影响

为系统阐明金属抗菌肽SIF_(4)基于DNA拓扑异构酶靶点的非细胞质膜抑菌机理,以大肠杆菌为模式菌株,研究了金属抗菌肽SIF_(4)与基因组DNA的结合方式、对DNA拓扑异构酶I/II活性以及胞内核酸生物合成的影响机理。研究发现,金属抗菌肽SIF_(4)可能以类似溴化乙锭嵌插方式与基因组DNA结合,对拓扑异构酶I有较强抑制活性,但对拓扑异构酶II影响较小,可通过影响DNA负超螺旋解链和RNA聚合酶结合催化RNA转录过程发挥抑菌活性。研究还发现,经金属抗菌肽SIF_(4)处理12 h后,大肠杆菌胞内总DNA和总RNA生物合成量均受到不同程度的抑制,且呈现良好的量-效关系,1/2最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)组与对照组(0 MIC)相比,胞内DNA和RNA生物量差异不显著(P>0.05),MIC和2 MIC组与对照组相比,胞内DNA和RNA生物量差异显著(P<0.05)。实验结果可为金抗肽SIF_(4)在食源性大肠杆菌生物防控中的应用提供理论支持。

肾上腺嗜铬细胞瘤患者组织葡萄糖转运蛋白1和拓扑异构酶ⅡA表达与临床特征及预后的相关性分析

目的探讨葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和拓扑异构酶ⅡA(TOP2A)在肾上腺嗜铬细胞瘤(PPGL)患者组织中的表达与临床特征及预后的相关性。方法选取2014年3月至2020年6月于新疆维吾尔自治区人民医院行手术切除的120例PPGL组织作为实验组。另收集同期行手术切除的100例无功能肾上腺腺瘤的肾上腺组织作为对照组。采用免疫组织化学染色法检测组织中GLUT1和TOP2A表达情况。通过Cox回归分析PPGL患者预后的影响因素。结果实验组中GLUT1的低表达率和TOP2A的高表达率均高于对照组[51.7%(62/120)比14.0%(14/100)、52.5%(63/120)比19.0%(19/100)],差异均有统计学意义(χ^(2)=34.225、31.829,均P<0.001)。GLUT1、TOP2A表达水平与镜下组织浸润和Ki-67有关(均P<0.05)。预后良好组中GLUT1高表达和TOP2A低表达比例均高于预后不良组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。单因素分析结果显示,患者镜下组织浸润、Ki-67、GLUT1、TOP2A均是影响预后的因素(均P<0.001)。Cox多因素回归分析显示TOP2A、镜下组织浸润及Ki-67均是导致PPGL患者预后不良的危险因素,GLUT1为保护因素(均P<0.001)。结论GLUT1在PPGL组织中呈低表达,TOP2A呈高表达,与患者预后不良有关。

2种喜树碱类拓扑异构酶1抑制剂ADE信号的挖掘与分析

目的对2种喜树碱类拓扑异构酶1抑制剂伊立替康和托泊替康的药物不良事件(ADE)信号进行挖掘与分析,为临床安全用药提供参考。方法基于美国FDA不良事件报告系统(FAERS)数据库,提取2004年1月1日至2023年3月31日上述2种药物的ADE报告数据。对数据进行处理后,采用报告比值比法联合贝叶斯置信传播神经网络法进行信号挖掘,并进行分析。结果共筛选出相关ADE报告14738份,其中伊立替康11483份,托泊替康3255份。伊立替康的ADE报告性别以男性为主,托泊替康以女性为主;两药的使用患者年龄均主要集中于45~<75岁。共检测出847个信号,累及24个系统器官分类(SOC)。其中,伊立替康检测出565个信号,累及24个SOC,主要集中于胃肠系统疾病、全身性疾病及给药部位各种反应、血液及淋巴系统疾病等;报告频数最多的ADE为腹泻,信号强度最大的ADE为胆碱能综合征。托泊替康检测出282个信号,累及22个SOC,主要集中于全身性疾病及给药部位各种反应、各类检查、血液及淋巴系统疾病、胃肠系统疾病等;报告频数较多的ADE为死亡和贫血,信号强度最大的ADE为发热性骨髓再生障碍。伊立替康的转移性结肠直肠癌、外周感觉神经病、脂肪性肝炎等ADE和托泊替康的虹膜萎缩、视网膜变性、玻璃体积血等ADE均未在各自说明书中提及。结论伊立替康和托泊替康的ADE主要累及消化系统和血液系统,临床上应重点监测;伊立替康所引起的胆碱能综合征应引起关注。除此之外,使用伊立替康的患者还应关注转移性结肠直肠癌、外周感觉神经病、脂肪性肝炎、蛋白尿等ADE,使用托泊替康的患者应加强眼器官疾病的监测,以确保用药安全。

共刺激分子B7H3通过调控DNA拓扑异构酶Ⅱα的表达对乳腺癌多柔比星化疗的影响

目的探讨共刺激分子B7H3(costimulatory molecule B7H3,B7H3)通过调控DNA拓扑异构酶Ⅱα(DNA topoisom eraseⅡalpha,TOP2A)的表达对乳腺癌多柔比星化疗敏感性的影响。方法收集临床标本,采用免疫组织化学染色验证B7H3表达与多柔比星化疗敏感性的相关性。采用成簇规律间隔短回文重复/Cas9基因编辑技术敲除B7H3,通过蛋白质印迹法和流式细胞术验证敲除结果。采用半抑制浓度值分析、集落形成、蛋白质印迹法检测凋亡蛋白、荧光双染色检测凋亡细胞以及细胞周期测定等方法验证B7H3表达与多柔比星作用的敏感性。小干扰TOP2A及其过表达TOP2A回复实验检测细胞凋亡。构建小鼠皮下成瘤模型验证体内B7H3表达与多柔比星化疗的作用。结果高表达B7H3的肿瘤组织对多柔比星治疗更加敏感。成功构建B7H3敲除的乳腺癌细胞。B7H3高表达的乳腺癌细胞对多柔比星作用更敏感。B7H3通过激活核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)途径促进TOP2A的表达,进而增加乳腺癌细胞对多柔比星作用的敏感性。小鼠体内实验证明,B7H3高表达可增加乳腺癌对多柔比星化疗的敏感性。结论B7H3通过激活NF-κB通路调控TOP2A的表达使乳腺癌对多柔比星化疗更敏感。

拓扑异构酶1及其喜树碱类抑制剂的临床研究进展

DNA拓扑异构酶1(Top 1)是一种重要的核酶,在DNA复制、转录、重组、修复、染色质组装和染色体分离等细胞代谢过程中,控制和修饰DNA拓扑结构。而且,Top1在多种肿瘤细胞中均过度表达。Top 1作为抗肿瘤药物靶点的确认,促进了新型抗肿瘤药物的发展。目前,研究最多的Top 1抑制剂主要是喜树碱类,已有3个喜树碱类药物上市(拓扑替康、伊立替康和贝洛替康)。本文对Top 1结构和功能的最新研究结果及其喜树碱类抑制剂的近期临床研究进展进行综述。

DNA拓扑异构酶在卵巢癌细胞拓扑替康耐药中的作用

目的探讨DNA拓扑异构酶(Topoisomerase,Topo)在卵巢癌拓扑替康(TPT)耐药细胞A2780/TPT中的作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测该细胞株对TPT、米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、阿霉素(ADM)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、顺铂(cDDP)的耐药指数。Western blot法检测TopoⅠ及TopoⅡ的蛋白含量,超螺旋DNA松解法检测TopoⅠ的酶活性。结果A2780/TPT细胞对TopoⅠ抑制剂TPT及CPT的耐药指数分别为25.1及3.1,对MX的耐药指数为19.0,对cDDP及TopoⅡ抑制剂ADM、VP-16仍保持敏感。耐药株的TopoⅠ含量约为亲本细胞的40%,且TopoⅠ活性下降(P<0.05),而TopoⅡ含量约为亲本细胞的2.2倍(P<0.05)。结论TopoⅠ含量的下降及TopoⅡ含量的增加是卵巢癌TPT耐药细胞对TopoⅠ抑制剂及TopoⅡ抑制剂产生不同药敏情况的原因。

二去水卫矛醇对肺癌NCI-H460细胞DNA拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用

目的评价二去水卫矛醇(dianhydrogalactitol,DAG)在肺癌NCI-H460细胞上的抗肿瘤作用,探讨其抗肿瘤作用机制。方法采用CCK-8法、细胞克隆形成实验,评价DAG对NCI-H460细胞的增殖抑制作用。显微拍照观察细胞形态改变;Hoechst 33342检测细胞核染色质的变化。Real time PCR法检测拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)mRNA的表达水平。Western blot法检测TopoⅡ蛋白表达水平。另外,应用计算机模拟分子对接技术来预测DAG与TopoⅡ的相互作用。结果 CCK-8法检测结果显示,DAG对NCI-H460细胞的体外抗肿瘤活性明显。细胞克隆形成实验结果表明,DAG能持续抑制肿瘤细胞的增殖。Hoechst 33342检测细胞凋亡发现细胞核染色质发生明显改变。Real time PCR和Western blot检测结果显示TopoⅡ mRNA和蛋白表达量降低。计算机模拟分子对接显示DAG与TopoⅡ有相互结合作用。结论DAG能明显抑制NCI-H460细胞的增值,作用机制研究表明DAG能降低TopoⅡ mRNA和蛋白水平,并与TopoⅡ结合,最终可能导致DNA双链断裂,引起细胞死亡。

波形蛋白与DNA拓扑异构酶Ⅱ在病理性瘢痕中的表达及意义

目的：比较波形蛋白及DNA拓扑异构酶Ⅱα（TopoⅡα）、β（TopoⅡβ）在病理性瘢痕、成熟瘢痕和正常皮肤中的表达情况，探讨它们与成纤维细胞生物学特征的关系及在瘢痕形成中的作用。方法：应用免疫组织化学检测病理性瘢痕、成熟瘢痕和正常皮肤各10例，了解其中波形蛋白、TopoⅡα、8的表达水平，测定光密度值，并分析其相关性。结果：波形蛋白在病理性瘢痕和成熟瘢痕真皮层大量表达；TopoⅡα蛋白在病理性瘢痕表皮基底层表达明显低于正常皮肤和成熟瘢痕，但是在真皮层血管周围有阳性表达；TopoⅡβ蛋白在病理性瘢痕表皮层表达明显低于正常皮肤和成熟瘢痕，但是在真皮层胶原纤维增生区域大量表达。各组光密度值差异有统计学意义。结论：TopoⅡα、β在病理性瘢痕真皮层表达增强，与波形蛋白的表达一致，提示其可能与病理性瘢痕的形成有关。

新型非喹诺酮类细菌ⅡA型拓扑异构酶抑制剂抗菌药物研究进展

自1962年第一代喹诺酮类药物萘啶酮酸发明以来,成百上千种可分为四代的喹诺酮衍生物已经被成功合成,并且细菌ⅡA型拓扑异构酶(DNA旋转酶和拓扑异构酶IV)已经被确认为该类抗菌药物的作用靶点。先前研究表明:细菌DNA复制过程对菌体生长与存活至关重要,而这一过程需要DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的共同作用。在过去50多年中,喹诺酮类药物的广泛使用也说明这一药物作用靶点在临床治疗上的重要性;但是由于对喹诺酮类药物不恰当的使用乃至滥用,导致细菌耐药性的逐步上升,为确保这一行之有效的抗菌药物作用靶点继续发挥其良好的治疗效果,研发作用于该靶点的非喹诺酮类抗菌药物来克服现有的喹诺酮耐药迫在眉睫。

氧化还原对铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的调控

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ(E.coli TopA)属于I型拓扑异构酶,在DNA复制、转录、重组和基因表达调控等过程中发挥关键作用。E.coli TopA不仅能结合锌,还可以结合铁。细胞内过量铁可与锌竞争,通过与锌指结构域结合减弱其DNA结合能力和改变蛋白质空间构象,从而抑制TopA拓扑异构酶活性。然而,铁结合形式TopA的氧化还原特性以及氧化还原条件对其活性的影响仍不清楚。本研究通过紫外分光光谱和体外DNA拓扑异构酶活性分析,发现体外纯化得到的铁结合形式的TopA呈氧化状态,能够被二硫苏糖醇和连二亚硫酸钠还原,原本氧化状态下无活性的TopA在还原条件下,可恢复其拓扑异构酶活性。当还原剂被去除后,铁结合的TopA在空气中能够重新被氧化,且其活性重新受到抑制。这说明,氧化还原条件对铁结合的TopA功能具有可逆调节作用。通过金属-蛋白体外结合实验进一步发现,无金属结合的TopA蛋白(apo-TopA)在无氧条件下,与Fe^(2+)和Fe^(3+)均能结合,但与Fe^(2+)结合能力较弱,并且TopA结合的Fe^(3+)被还原成Fe^(2+)后,结合力显著下降,能够被铁螯合指示剂菲咯嗪快速捕获。此外,蛋白质内源性荧光光谱分析实验表明,铁结合的TopA在氧化还原的不同状态时,其在330 nm左右的荧光值有显著差异。这提示,氧化还原条件可能通过影响铁离子与TopA的结合状态,引起蛋白质空间构象改变,从而对TopA的拓扑异构酶活性进行调节。此研究表明,铁结合TopA的拓扑异构酶活性会受到细胞内氧化还原信号的可逆调控,也提示I型拓扑异构酶可能是细胞铁超载通过氧化损伤引起细胞功能障碍(或铁死亡)的靶点之一。

鸦胆子油乳具有多药耐药逆转和拓扑异构酶Ⅱ抑制作用

目的 研究鸦胆子油乳体外对多药耐药细胞株的作用和对拓扑异构酶 (topoisomerase ,TOPO)活性的影响。 方法 MTT法测定鸦胆子油乳体外对敏感和耐药细胞株的杀伤作用 ;TOPOⅠ介导的负超螺旋 pBR3 2 2解旋反应和TOPOⅡ介导的kDNA去连环反应检测鸦胆子油乳对TOPOⅠ和TOPOⅡ催化活性的影响。结果 鸦胆子油乳浓度为 0 0 2 5g·L-1时能在一定程度上逆转K5 62 /A0 2、MCF 7/ADM和KB/VCR等细胞的耐药性。鸦胆子油乳能抑制TOPOⅡ介导的kDNA去连环作用 ,浓度为 0 3 1g·L-1时鸦胆子油乳可部分抑制TOPOⅡ酶活力 ,浓度为 2 5g·L-1则完全抑制TOPOⅡ酶活力 ;对TOPOⅠ介导的pBR3 2 2解旋作用无影响 ,对DNA也无直接作用。结论 鸦胆子油乳对多药耐药有一定的逆转作用 ,并能明显抑制TOPOⅡ的活性。

DNA拓扑异构酶Ⅰ结构、功能及喜树碱类抗癌药物研究进展

目的 DNA拓扑异构酶I是生物体内极其重要的细胞核内酶 ,参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的核内过程。该酶已成为重要的抗癌药物研究新靶点。讨论了该酶迄今最特异性抑制剂喜树碱类化合物研究近况。方法 以近年来国外发表的论文为基础 ,介绍拓扑异构酶Ⅰ结构、功能研究的最新成果 ,特别是药物作用模式研究方面的研究成果。结果与结论 这将为新型抑制剂的合理药物设计打下坚实基础。

铜绿假单胞菌环丙沙星耐药株Ⅱ类拓扑异构酶基因突变的研究

用PCR方法 ,扩增 2 6株临床分离铜绿假单胞菌环丙沙星耐药株、4株环丙沙星敏感菌株和PA0 1菌株的Ⅱ类拓扑异构酶 gyrA、gyrB、parC和 parE基因的喹诺酮类药物耐药决定区 (QRDR)基因片断 ;并对铜绿假单胞菌II类拓扑异构酶基因突变与耐药性关系进行研究。结果表明 90 %以上的铜绿假单胞菌耐药株表现出Ⅱ类拓扑异构酶基因突变 (2 6株中有 2 4株 )。突变主要发生在 gyrA基因 (2 2株 )和 parC基因 (14株 )上 ,其中 gyrA基因的第 83位氨基酸密码子表现出高频突变 (2 2株中有 2 1株 ,ACC→ATC ,占 90 % ) ,parC基因第 80位氨基酸密码子也表现出较高的突变率 (14株中有 12株 ,TCG→TTG ,占 60 % ) ,4株耐药株的 gyrB和 3株耐药株的 parE基因发生单点突变 ,2株耐药株II类拓扑异构酶基因未检测到突变。用二倍稀释法 ,测定部分喹诺酮和 β 内酰胺类药物对耐药突变株的体外抗菌活性。表明铜绿假单胞菌Ⅱ类拓扑异构酶基因突变株对诺氟沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、头孢他啶和亚胺培南表现出不同的敏感性。试验所用 2 4株突变株对诺氟沙星呈现 10 0 %的耐药 ;对左氧氟沙星 65 %的耐药 ;40 %的菌株对哌拉西林表现出耐药 ;3 0 %的菌株对头孢他啶耐药 ;75

骆驼蓬种子提取物及其β咔保啉生物碱对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制作用

目的探讨去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱、骆驼蓬总碱及哈尔满碱(止咳药用植物)对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制作用。方法从体外培养的Q3肝癌细胞中,提取分离DNA拓扑异构酶Ⅱ;以阿霉素为阳性对照,用琼脂糖凝胶电泳法检测药物对DNA拓扑异构酶Ⅱ的作用。结果骆驼蓬总碱、去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱及哈尔满碱对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性均有一定的抑制作用。结论对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制作用是骆驼蓬总碱、去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱等生物碱抗癌作用和细胞毒作用的机制之一。

拓扑异构酶Ⅰ抑制剂对K562细胞的杀伤与诱导凋亡作用

背景与目的:近年发现,拓扑异构酶Ⅰ抑制剂对加速期或急变期的慢性髓细胞白血病有较好疗效。为了深入理解拓扑异构酶Ⅰ抑制剂这一新的药理作用,本研究采用具有慢性髓细胞白血病特征性异常染色体犤t(9;22)犦的K562细胞株为实验对象,进一步探讨拓扑异构酶Ⅰ抑制剂拓扑替康(topotecan)对靶细胞的杀伤与诱导凋亡活性。方法:采用MTT法测定拓扑替康对K562细胞的杀伤作用;通过形态学与AnnexinVFITC染色,研究拓扑替康对靶细胞的促凋亡活性;采用caspase-8特异性抑制剂IETD-fmk,分析拓扑替康介导的细胞杀伤或凋亡和caspase活化的关系。结果:经0.15μmol/L拓扑替康处理至12、24、48及72h时,K562细胞的存活率与对照相比,逐渐降至(92±36)%犤P>0.05vs(94±27)%犦、(68±21)%犤P<0.05vs(119±13)%犦、(54±15)%犤P<0.05vs(132±31)%犦及(21±10)%犤P<0.01vs(114±19)%犦;同时,靶细胞出现磷脂酰丝氨酸外翻、细胞固缩、染色质边集、核碎裂,最终解离为大量凋亡小体;经caspase-8抑制剂与拓扑替康联合处理至24、48h时,K562细胞的存活率依然维持在(95±29)%与(87±11)%,后者显著高于单用拓扑替康者犤P<0.05vs(54±15)%犦,且无明确的凋亡小体形成。

螺旋藻提取物对DNA拓扑异构酶活性的抑制及对DNA的直接影响

探讨螺旋藻提取物对DNA拓扑异构酶活性的影响以及对DNA的直接作用。方法 :TOPOI介导的负超螺旋 pBR322解旋反应检测对TOPOI酶活力的影响 ;TOPOII介导的kDNA去连环作用检测对TOPOII活力的影响 ;采用负超螺旋pBR322和kDNA检测对DNA的直接作用。结果 :螺旋藻提取物的水溶性成分和DMSO可溶性成分在浓度分别为3 2μg/ml和80μg/ml时,能完全抑制TOPOI介导的负超螺旋 pBR322解旋反应;两者对TOPOII介导的kDNA去连环作用完全抑制的浓度分别为16μg/ml和2000μg/ml。此外 ,螺旋藻提取物水溶性成分在高浓度时可直接引起DNA的双链断裂。结论 :TOPO酶 ,主要是TOPOI 。

灵芝提取物对DNA拓扑异构酶的抑制作用及诱导K562细胞凋亡

目的 :研究中华灵芝宝的抗肿瘤作用机理。方法 :DNA超螺旋解旋法检测中华灵芝宝对拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ (TOPOⅠ、Ⅱ )活性的影响 ;琼脂糖凝胶电泳检测其对DNA的直接打断作用及诱导K5 6 2细胞凋亡的能力。结果 :中华灵芝宝能抑制TOPOⅠ、Ⅱ的活性 ,促进DNA的解旋、断裂 ;同时还能直接打断质粒和大分子DNA ;作用于K5 6 2细胞后电泳显示有凋亡细胞特有的“梯状”条带。结论 :中华灵芝宝能同时抑制TOPOⅠ、Ⅱ活性 ,直接打断质粒和大分子DNA ,并能诱导K5 6 2细胞凋亡。

原花青素对MNNG致DNA损伤及拓扑异构酶Ⅱ的影响

目的 观察原花青素对DNA损伤的保护作用及对黑色素瘤细胞中拓扑异构酶的影响 ,探讨原花青素癌化学预防的作用机制。方法 单细胞电泳法检测羟自由基对L92 9细胞DNA损伤的尾迹 ,用 [H3]TdR参入细胞DNA中进行标记 ,测定上清液中的放射强度来判定MNNG对DNA损伤 ;从黑色素瘤肿瘤细胞中提取拓扑异构酶 ,用琼脂糖凝胶电泳测定活性。结果 原花青素可以减轻DNA损伤尾迹及MNNG对DNA的损伤。但对黑色素瘤肿瘤细胞中拓扑异构酶无抑制作用。结论 原花青素对羟自由基及致癌剂MNNG引起的细胞DNA损伤有一定的保护作用。

Santamarin的抗肿瘤活性及对DNA拓扑异构酶的影响

目的研究Santamarin的体内外抗肿瘤活性及对DNA拓扑异构酶（TOPO）活性的影响。方法以7株人肿瘤细胞株为模型，采用改良MTT法检测Santamarin对肿瘤细胞增殖的影响；以小鼠移植性肉瘤S180和小鼠移植性肝癌H22为模型，检测Santamarin对在体肿瘤生长的影响；以pBR322DNA为底物，采用琼脂糖凝胶电泳检测Santamarin对TOPO介导的pBR322DNA解旋反应的影响，以及对pBR322DNA是否具有直接断裂作用。结果Santamarin对7株人肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC50）在0．99～3．61mg·L^-1之间；Santamarin30、90和270mg·kg^-1剂量对S180生长的抑制率分别为51．44％、63．60％和56．37％；对H22生长的抑制率分别为40．77％、39．47％和46．73％。Santamarin在2g·L^-1时完全抑制TOPOⅠ、Ⅱ的活性，但对DNA无直接断裂作用。结论Santamarin具有较为明显的体内外抗肿瘤活性，对DNATOPO活性的抑制可能是其作用机制之一。