不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建

【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和mCherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和mCherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。

RNA m^(1)A和m^(5)C甲基化修饰在拟轮枝镰孢伏马毒素生物合成中的作用

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是一种危害严重的植物病原真菌,极大降低了粮食产量,还产生2B类致癌物伏马毒素,威胁人畜健康。探究RNA甲基化修饰与伏马毒素之间的联系,解析RNA修饰甲基化转移酶在伏马毒素合成中的作用。【方法】利用HPLC检测了不同地区的拟轮枝镰孢菌株的伏马毒素合成能力,采用QuEChERS前处理结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术建立了m^(6)A、m^(1)A、m^(5)C、Gm、m^(7)G和Um等6种RNA甲基化修饰检测方法,继而对不同产毒菌株的RNA甲基化修饰进行了检测,并采用生物信息学和RT-qPCR方法确定了与伏马毒素合成相关的RNA甲基化修饰基因。【结果】不同地区的拟轮枝镰孢菌株伏马毒素合成能力具有显著差异,成功建立了RNA甲基化修饰检测方法,并确定m^(1)A和m^(5)CRNA甲基化修饰与伏马毒素合成负相关,RT-qPCR发现Fvalyref基因负调控伏马毒素生物合成。【结论】RNA m^(5)C甲基化修饰与伏马毒素生物合成呈负相关且其Reader基因Fvalyref负调控伏马毒素生物合成。

联合全基因组关联和转录组分析筛选玉米拟轮枝镰孢穗腐病的抗性候选基因

玉米是我国第一大粮食作物,实现玉米的高产稳产对于我国粮食安全、农业稳定有重要意义。穗腐病是一种严重危害全球玉米的真菌性病害,会造成玉米大幅减产和品质劣变。本研究选用我国玉米穗腐病的优势致病菌拟轮枝镰孢(Fusariumverticillioides),对241份来源广泛的玉米自交系进行2年田间人工接种抗性鉴定,同时利用20,586个高质量SNP标记通过全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,GWAS),鉴定拟轮枝镰孢穗腐病抗性显著关联的SNP位点;在此基础上选取对拟轮枝镰孢穗腐病表现高抗和高感的玉米自交系各1份,其籽粒在室内接种拟轮枝镰孢,通过对3个不同侵染时间的籽粒进行转录组测序(RNA-seq),分析抗感材料差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)及其富集情况;结合GWAS和RNA-seq结果,共同定位筛选抗病候选基因。主要研究结果如下:(1)综合2年田间抗性鉴定结果,筛选到4份抗拟轮枝镰孢穗腐病的玉米自交系,其中含有热带血缘的玉米种质对拟轮枝镰孢穗腐病表现出更好的抗性。(2)2年GWAS分析共检测到26个与拟轮枝镰孢穗腐病抗性显著关联的SNP位点,其中有18个位点位于前人定位到的QTL范围内。(3) RNA-seq结果表明,抗感材料对病原菌的响应基因不同。与感病材料相比,抗病材料均显示出更多的DEGs,且都有更多的上调基因;在抗感材料特异性DEGs共同富集的GO条目和KEGG通路中,抗病材料中富集到的DEGs占比显著多于感病材料;一些与植物防御病原菌相关的条目和通路也仅在抗病材料中被特异富集。(4)在GWAS检测到的显著关联位点上下游100 kb范围内筛选与转录组DEGs共同定位到的候选基因,结果 16个基因被GWAS和RNA-seq同时检测到;根据这些基因的蛋白功能及相关文献报道,从中预测到6个与拟轮枝镰孢穗腐病抗性相关的候选基因。综上所述,本研究筛选出4份抗拟轮枝镰孢穗腐病的玉米自交系,来自热带、亚热带的玉米种质可以作为抗逆性品种选育的研究重点;对抗感玉米自交系响应拟轮枝镰孢侵染的DEGs及其相关抗病机制进行了初步解析,联合GWAS和RNA-seq共定位到6个与拟轮枝镰孢穗腐病抗性相关的候选基因,研究结果为玉米穗腐病抗性基因的克隆验证与抗性品种的培育提供了一定的理论依据。

利用非同源末端连接缺陷构建拟轮枝镰孢菌的高效基因敲除方法

拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)是引起玉米茎基腐病和穗粒腐病的主要病原菌之一,严重威胁玉米的产量和品质。为了深入研究拟轮枝镰孢菌致病基因的功能,对该菌中非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径中的2个关键基因FvKu70和FvKu80分别进行了基因敲除以创制高效的基因敲除菌株,并比较了野生型菌株和突变体菌株在营养生长速率、菌落形态、产孢量、对玉米的致病力和基因敲除效率等方面的差异。研究结果表明,FvKu70和FvKu80的基因缺失突变体与野生型FvLNF15-11相比,在PDA平板上的形态特征(如菌丝形态、生长速率、菌落直径、产孢量)没有明显差异,对玉米茎秆的致病力也类似。此外,选择尿嘧啶生物合成相关基因FvpyrG作为敲除的靶基因,分析了FvKu70或FvKu80缺失突变体菌株的同源重组效率,结果显示突变体菌株均显著高于野生型,其中ΔFvKu70的同源重组效率最高。综上所述,FvKu70或FvKu80基因缺失突变体可以快速又高效地实现拟轮枝镰孢菌的基因敲除,为进一步研究该菌的功能基因提供了技术支持。

玉米种质资源对拟轮枝镰孢与禾谷镰孢穗腐病的抗性精准鉴定与分析

穗腐病是我国玉米生产上的重要病害,严重影响玉米的产量和品质。利用抗病品种是控制穗腐病的安全有效措施。抗性资源是开展抗病育种的物质基础。本研究优化和完善了玉米种质抗镰孢穗腐病精准鉴定的方法,比较分析了花丝通道注射接种和果穗注射(创伤)接种鉴定的穗腐病抗性,发现2种方法鉴定出的抗性结果具有高度的一致性(相关系数r≥0.90)。2018—2020年,在北京昌平和四川西昌,利用花丝通道注射接种法,对690份代表性玉米种质进行了抗拟轮枝镰孢穗腐病的精准鉴定与评价,筛选出H446、YCF、辽2309、吉资1055、Y1723、XF8-3、铁97085等35份具有稳定抗性的种质,占比为5.07%。6个环境下玉米对拟轮枝镰孢穗腐病抗性的相关系数为0~0.48,同一年度(2018、2019和2020年)2个鉴定点穗腐病抗性值之间的r值分别为0.03、0.20和0.15,3个年度间穗腐病综合抗性的相关系数为0.20、0.30和0.35,表明在不同环境下玉米对拟轮枝镰孢穗腐病的抗性反应存在较大差异。在辽宁沈阳和四川西昌共6个环境下,对690份种质进行了抗禾谷镰孢穗腐病精准鉴定,6个环境下玉米种质抗性的相关系数为0~0.39,2018、2019和2020年2个鉴定点之间的r值分别为0.05、0.25和0.29,表明环境因素对玉米抗禾谷镰孢穗腐病的表型存在较大影响;3个年度间镰孢穗腐病综合抗性的r值为0.14、0.20和0.13,显示年度间综合抗性差异较大。共鉴定出17份对禾谷镰孢穗腐病具有稳定抗性的种质(H446、MC7528、Y1632、Y1679、吉资1055、铁97085等)。690份种质对上述2种穗腐病抗性的相关系数为0.52,表明其对2种穗腐病的抗性存在中等水平的相关性。H446、吉资1055、铁97085三份种质在所有鉴定环境中均对2种穗腐病表现出稳定抗性,是玉米抗穗腐病育种和品种抗性改良的宝贵资源。

拟轮枝镰孢对多菌灵的敏感性及抗性菌株生物学性状和交互抗性

为评价玉米穗腐病主要致病菌拟轮枝镰孢Fusarium verticillioides对多菌灵的敏感性,采用菌丝生长速率法测定了采自山东、河北、河南、四川、甘肃、辽宁及宁夏7省(自治区)的168株玉米穗腐病拟轮枝镰孢对多菌灵的敏感性,并对经药剂驯化获得的拟轮枝镰孢抗多菌灵菌株主要生物学性状和交互抗性进行了研究。结果表明:多菌灵抑制拟轮枝镰孢菌丝生长的EC50值在0.0132~0.7740 mg/L之间,平均EC50值为(0.2208±0.1437)mg/L。敏感性频率分布显示,供试病原菌群体中已出现对多菌灵敏感性下降的亚群体,但其中仍有35.71%的菌株对多菌灵的敏感性频率呈正态分布,因此可将此部分菌株的平均EC50值(0.0814±0.0289)mg/L作为拟轮枝镰孢对多菌灵的相对敏感基线。药剂驯化共获得6株抗性菌株,抗性倍数在5.05~12.22之间。抗性菌株的菌丝生长速率及菌丝干重均低于亲本菌株,表明其抗性菌株的生物适合度有所降低,同时发现其抗药性均不能稳定遗传。室内交互抗性测定结果表明,拟轮枝镰孢对多菌灵的抗性与咪鲜胺、戊唑醇、三唑酮及吡唑醚菌酯之间均不存在交互抗性关系。

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL^(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL^(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。

LAMP快速诊断由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病

[目的]水稻恶苗病是为害水稻生长发育的重要病害,在我国的分布非常广泛,经常会造成严重的损失。拟轮枝镰孢是引起水稻恶苗病的重要病原菌,本研究意在建立由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的快速诊断技术。[方法]基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglyceric phosphokinase)基因Pgk为靶标,设计筛选LAMP特异性引物。[结果]建立了可直接从水稻恶苗病植株中检测拟轮枝镰孢并诊断由该病原菌引起的水稻恶苗病的LAMP检测技术(FvPgk-LAMP)。该检测技术可以从田间发病的水稻植株中直接对病原菌进行检测,反应条件为62℃、70 min。由于反应前在反应管内加入了羟基萘酚蓝(HNB),反应结束后可对结果进行直接判定,阳性反应呈天蓝色,阴性反应则仍然为紫色。该体系的最低检出限为目标菌纯DNA的100pg·μL^(-1)。应用该技术我们已成功且快速地对来自江苏南京和镇江的水稻恶苗病样本进行了病害诊断。[结论]本研究为拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的诊断提供了快速且有效的新技术。

拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米种子发芽及幼苗生长的影响

为建立玉米杂交种和自交系利用拟轮枝镰孢菌毒素抗性筛选的试验方法,制备拟轮枝镰孢菌毒素粗提液,测定不同稀释倍数毒素粗提液对2个玉米杂交种和4个玉米自交系处理4和6d后的种子发芽抑制率、胚根生长抑制率以及幼苗致萎效果,分析不同抗性玉米种质、毒素稀释倍数和处理时间对玉米种子发芽、胚根和幼苗生长的影响。结果表明,易感杂交种豫玉22与抗性杂交种农大108的种子发芽抑制率和胚根生长抑制率均存在极显著差异(P<0.01);在处理后4、6d时,前者的种子发芽抑制率、胚根生长抑制率分别比后者高7.2%、11.3%、12.7%、11.8%。在对玉米杂交种幼苗致萎蔫试验中,用稀释2倍和5倍的毒素粗提液处理,豫玉22与农大108杂交种幼苗间的萎蔫程度也存在显著差异(P<0.05)。拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对不同抗性玉米种质种子发芽、幼苗生长的影响存在显著差异,为利用拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米品种进行苗枯病抗性鉴定和筛选提供理论依据。

一种用玉米拟轮枝镰孢穗腐病病粒制备接种体的简易方法

制备接种体是玉米穗腐病抗性鉴定中的一个重要环节,本研究提出了一种用玉米拟轮枝镰孢穗腐病病粒制备接种体的简易方法,即将上年的拟轮枝镰孢穗腐病带菌病粒按一定重量加入无菌水洗脱制成接种体。田间接种试验结果表明,采用本方法简易制备的接种体接种后可获得与常规制备接种体相当的接种效果,且在-18℃冻存15 d仍可达到新鲜的常规制备接种体接种后的水平。使用简易制备接种体对33个玉米品种进行了田间穗腐病抗性鉴定,21个品种表现为感病或高感。与实验室常规培养制备接种体的方法相比,本制备方法简便易操作,用时短,成本低,无需专业仪器设备,能够一次制备大量接种体,可广泛用于玉米种质材料和新品种的拟轮枝镰孢穗腐病田间抗性鉴定及抗性材料筛选等。

化学防控玉米蛀穗害虫对减轻拟轮枝镰孢穗腐病及伏马毒素的作用

【背景】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的穗腐病严重影响玉米产量和品质,其产生的伏马毒素威胁食品安全。亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和桃蛀螟(Conogethes punctiferalis)等穗期害虫危害可导致玉米严重减产,并加重玉米穗腐病的发生。【目的】评估2种杀虫剂(甲维盐和氯虫苯甲酰胺)、3种杀菌剂(氰烯菌酯、戊唑醇和苯醚甲环唑)对玉米穗期病虫害的防治效果以及对玉米产量和籽粒中伏马毒素含量的影响;明确施用杀虫剂后接菌对穗腐病发病的影响,探究防治玉米穗期病虫害的有效方案,为玉米安全生产提供技术支撑。【方法】以郑单958为供试玉米,在2019年春、夏两季于河北廊坊进行田间试验。玉米大量吐丝后5 d和20 d两次施药,接菌处理于吐丝后7 d进行。在玉米完熟期调查虫害级别、穗腐病发病率和病情指数、果穗穗长、行粒数、穗重和百粒重,计算防治效果和增产情况,并用高效液相色谱-串联质谱法分析籽粒中伏马毒素B1、B2的含量。【结果】与对照相比,施用甲维盐和氯虫苯甲酰胺均可显著降低平均虫害级别、穗腐病发病率、病情指数、伏马毒素含量。与单独施用杀虫剂相比,施用杀虫剂与杀菌剂的混剂未显著降低平均虫害级别、穗腐病发病率、病情指数、伏马毒素含量,也未显著提高产量和对上述病虫害的防治效果。与仅接菌的处理相比,施用氯虫苯甲酰胺后接菌处理在穗腐病发病率、病情指数和伏马毒素含量方面均显著下降。在春玉米和夏玉米试验中,25 g·hm^(-2)氯虫苯甲酰胺及其与杀菌剂的混剂对穗部螟虫的防治效果分别达82.1%—92.7%、94.2%—95.0%,而30 g·hm^(-2)甲维盐及其与杀菌剂的混剂对穗部螟虫的防治效果显著低于25 g·hm^(-2)氯虫苯甲酰胺,仅为57.8%—78.0%、83.1%—89.9%。2种杀虫剂对穗腐病的防治效果无显著差异,春玉米防治效果均>60%,夏玉米防治效果均>88%。对于产量而言,各处理均对果穗穗长和行粒数无显著影响,药剂处理后的果穗穗重均显著高于对照,且各处理间无显著差异。施用杀虫剂后接菌对产量无显著影响。分别施用2种杀虫剂单剂或其与杀菌剂的混剂后,春玉米可增产5.49%—13.49%,夏玉米可增产9.20%—13.95%,玉米籽粒中伏马毒素含量均低于500μg·kg^(-1),而对照玉米中伏马毒素含量达2817μg·kg^(-1)。喷雾接菌处理的玉米中伏马毒素含量高达8710μg·kg^(-1),而接菌前施用杀虫剂可将伏马毒素含量降至1500μg·kg^(-1)以下。【结论】施用25 g·hm^(-2)氯虫苯甲酰胺和30 g·hm^(-2)甲维盐均可通过显著降低玉米蛀穗害虫的危害,从而减轻穗腐病的发生并降低籽粒中伏马毒素含量,提高玉米产量和品质,而杀虫剂/杀菌剂混用与杀虫剂单用对虫害防控效果差异不显著;穗期害虫对果穗的伤害在穗腐病的发生过程中起决定性作用。综合各方面因素,25 g·hm^(-2)的氯虫苯甲酰胺是防治穗期玉米害虫、减轻穗腐病较为理想的药剂。

东北地区玉米穗腐镰孢菌种类鉴定及拟轮枝镰孢菌遗传多样性

为明确东北地区玉米穗腐病致病镰孢菌的种类及拟轮枝镰孢菌的多样性,于2015~2016年在东北4个省30个区县进行玉米穗腐病样品的采集,通过形态学及分子生物学方法对分离获得的镰孢菌的种类进行鉴定,并用ISSR分子标记技术对40株拟轮枝镰孢菌进行遗传多样性分析。结果表明:在获得的122株镰孢菌分离物中鉴定出包括禾谷镰孢菌、层出镰孢菌、亚粘团镰孢菌和拟轮枝镰孢菌共4个种,其分离频率分别为4.92%、7.38%、10.66%和77.05%。从区域分布来看,拟轮枝镰孢菌的分布最广,在所有采样县区均有分布。在30个县区采集的玉米穗腐病样品中,有7个县区分离到亚粘团镰孢菌,有5个县区分离到层出镰孢菌,有2个县区分离到禾谷镰孢菌,分别占采集县区样本的23.33%、16.67%和6.67%,说明拟轮枝镰孢菌是东北地区玉米穗腐病的优势致病菌。ISSR-PCR结果表明,筛选出的8条ISSR引物共扩增出45条清晰条带,其中27条为多态性条带,不同引物对供试菌株扩增的条带数不同,引物842扩增的条带最多,引物873扩增的条带最少,多态性条带的比例分别是66.7%和50%。聚类分析结果表明,供试菌株间的遗传相似系数为0.75~1.00,当遗传相似系数为0.97时,供试菌株被全部分开。拟轮枝镰孢菌ISSR类群的划分与其地理来源没有明显的相关性。

玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病抗性基因的挖掘

玉米穗腐病是一种严重危害玉米生产的真菌性病害,而目前在世界范围内玉米育种上应用的大多数自交系缺少对穗腐病的抗性。玉米穗腐病抗性位点的挖掘和抗病基因的克隆,对玉米穗腐病的遗传改良至关重要。本研究旨在通过转录组测序和全基因组关联分析的方法进行玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病抗性位点的挖掘并初步确定候选基因。抗病自交系法A和感病自交系掖81162的转录组测序结果表明,人工接种拟轮枝镰孢菌后7 d两个自交系的差异表达基因有10,761个。通过全基因组关联分析共检测到5个与穗腐病抗性显著相关的SNP,这些SNP分布在1号和9号染色体上。通过比对B73 RefGen_v3并注释,发现SNP位点附近涉及的基因包括酰基激活酶1过氧化物酶体、蛋白磷酸酶2C 48、镁转运蛋白、受体蛋白激酶CRINKLY4和锌指CCCH域蛋白19。将在转录组测序中获得差异表达基因和全基因组选择中关联到的基因进行比对,发现全基因组关联分析中关联到的锌指CCCH域蛋白19同时也是转录组测序中获得的差异表达基因,表明锌指CCCH域蛋白19可能与玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病的抗性相关。本研究结果不仅能为抗病基因的克隆和玉米的抗病分子育种提供一定的理论依据和重要的遗传资源,而且能为玉米和病原菌的相互作用机理的解析奠定基础。

玉米种质抗拟轮枝镰孢与禾谷镰孢穗腐病鉴定及抗性多样性分析

穗腐病是玉米生产上最重要的病害之一,严重影响其产量和品质,威胁人畜健康。选育和利用优良的抗穗腐病品种,是防治玉米穗腐病最为经济有效的措施。利用花丝通道注射法,在北京昌平和海南三亚2个试验点,对346份玉米自交系进行了抗拟轮枝镰孢与禾谷镰孢穗腐病的鉴定与评价。综合分析2个试验点的抗性鉴定数据表明,对拟轮枝镰孢穗腐病表现高抗、抗病、中抗、感病和高感的材料分别为1、43、106、147和49份,占总鉴定材料的0.3%、12.4%、30.6%、42.5%和14.2%;对禾谷镰孢穗腐病表现高抗、抗病、中抗、感病和高感的材料分别为10、32、55、79和170份,占比分别为2.9%、9.3%、15.9%、22.8%和49.1%。对2种镰孢穗腐病同时表现中抗以上水平的种质共45份,其中1份(15-TL-1224)高抗2种穗腐病、2份(PT351-1、18-QTL-25)对禾谷镰孢和拟轮枝镰孢穗腐病表现高抗和抗病,18-QTL-04、18-YJY-18、18-YJY-02、18-HDY-14种质同时表现抗病,是难得的抗穗腐病资源。对上述45份抗病种质和144份感病材料进行的2种穗腐病抗性相关性分析表明,45份抗病种质对2种穗腐病的抗性相关系数为0.24,144份感病材料对2种穗腐病抗性的相关性系数为-0.16。40对多态性SSR引物对其中41份抗性材料中扩增出183个等位基因,多态性位点百分率为100.00%,平均等位基因数和有效等位基因数分别为3.7556、7.6923,平均Nei′s基因多样性、Shannon′s信息指数分别为0.6596、1.4458,平均多态信息含量为0.326,变幅为0.0513~1.0000。通过UPGMA聚类分析,41份抗病材料被划分为7个类群,分别是美国现代杂交种中B群种质(PB)、兰卡斯特(Lan)、未知类群、美国现代杂交种中A群种质(PA)、旅大红骨(LRC)、衣阿华坚秆综合种(BSSS)和塘四平头(TSPT),表现出较高的遗传多样性,其中PA类群和PB类群包含的抗病种质最多。研究结果将为玉米穗腐病抗病育种中抗源的选择和利用提供参考。

基于图像分析的玉米抗拟轮枝镰孢穗腐病的QTL定位

【目的】玉米穗腐病是一种在全世界广泛发生且危害严重的真菌性病害,其中,拟轮枝镰孢引起的穗腐病(Fusarium ear rot,FER)在中国发生最为普遍。通过图像分析方法进行FER抗病QTL定位,并对前期通过病害评级方法定位的FER抗病QTL进行验证,探索一种新的玉米穗腐病的病害鉴定方法,为玉米穗腐病的遗传改良提供依据。【方法】利用高感FER的自交系(ZW18)分别与3个高抗自交系(承351、丹598和吉V203)构建F_(2)群体(F_(2)-C、F_(2)-D和F_(2)-J)和相应的F_(2)﹕3家系,通过图像分析的方法获得每个F_(2)﹕3家系的果穗病斑百分比,进而定位玉米FER抗病QTL。【结果】3个群体共定位到18个FER抗病QTL,其中,分别位于2.02-2.03 bins、4.06-4.07 bins和8.06 bin上的3个QTL(qRf2、qRf3和qRf4)可解释的表型变异率分别高达21.80%、25.80%和27.40%。F_(2)-J群体的qRf11与F_(2)-C群体的qRf1和F_(2)-D群体的qRf6在第1染色体均有重叠区间,可解释的表型变异率达到16.50%。来自F_(2)-D群体的qRf9与F_(2)-J群体的qRf16在第8染色体8.05 bin有重叠区间,且抗性基因均来源于抗性亲本。F_(2)-C群体的qRf3与F_(2)-J群体的qRf15在第4染色体4.06-4.07 bins有重叠区间。另外,与之前通过病害评级方法定位的结果相比,qRf1、qRf6和qRf11在1.06-1.07 bins与评级方法定位的抗病位点qRfer13重合,qRf3和qRf15在4.06-4.07 bins与评级方法定位的抗病位点qRfer3和qRfer17重叠,qRf7与qRfer6在2.04 bin的定位区间完全重合,qRf17与qRfer20在S2重复中定位到9.03-9.05 bins的重叠区间,且来源于相同的抗源。【结论】定位到18个FER抗性位点,其中,位于1.04-1.07 bins、4.06-4.07 bins和8.05 bin上的抗病位点在不同群体中均可以被检测到,位于2.04 bin和9.03-9.05 bins上的抗病位点用不同的检测方法可以被检测到,表明在这些区间可能存在FER的抗性位点。QTL的定位区间在不同群体中的重叠性在一定程度上验证了定位区间的真实性,不同方法之间定位到重叠区间,说明利用图像分析方法定位FER抗病QTL具有一定的准确性。

拟轮枝镰孢与玉米籽粒互作的差异基因筛选及代谢通路分析

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一,论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异,为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的样品进行转录组测序,之后采用生物信息学分析,分别以玉米和拟轮枝镰孢基因组为参考,以|log_(2)FC|≥1,P-adjust<0.05为阈值筛选互作过程中玉米和拟轮枝镰孢的差异表达基因,利用GO和KEGG对其进行功能注释及富集分析。Goatools软件分析植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导通路相关差异基因的表达变化,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对测序差异基因进行验证。【结果】在互作4、12和72 h后拟轮枝镰孢分别有140、400和1945个基因上调表达,有9、302和1784个基因下调表达;玉米分别有293、692和1426个基因上调表达,320、482和153个基因下调表达。GO和KEGG富集分析显示,侵染早期拟轮枝镰孢在细胞间隙生长,差异基因主要富集在RNA生物合成、细胞壁结构成分、脂肪酸生物合成、蛋白质代谢、碳水化合物代谢、生物过程和代谢过程等通路中。拟轮枝镰孢早期侵染触发了玉米活性氧(ROS)爆发,差异基因主要富集在对活性氧、过氧化氢的反应,几丁质酶、单加氧酶活性,木质素代谢过程等相关通路中。侵染后期拟轮枝镰孢继续在籽粒中定殖及扩展,差异基因主要富集在碳水化合物和细胞壁多糖分解代谢过程、跨膜转运、氧化还原酶活性等功能通路中。玉米主要通过苯丙素、木质素、类黄酮生物合成,MAPK信号通路、植物-病原互作和植物激素信号转导等途径差异基因大量表达响应病原菌侵染。随机选取6个玉米和6个拟轮枝镰孢的差异表达基因进行qRT-PCR分析,基因表达规律与转录组测序结果一致,证实了RNA-seq的准确性。【结论】在病原菌侵染早期,拟轮枝镰孢在细胞间隙生长,触发玉米活性氧爆发,相关通路差异基因表达;侵染中后期,病原菌以淀粉为营养素,继续在籽粒中定殖及扩展,玉米通过苯丙素、木质素及几丁质酶的生物合成等方面的相关基因表达响应拟轮枝镰孢侵染,同时植物-病原互作、MAPK途径和激素信号转导等途径参与抗拟轮枝镰孢侵染。

拟轮枝镰孢二氢乳清酸氧化酶对伏马毒素合成的影响

拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是玉米穗腐病的主要病原菌之一,其产生的伏马毒素是一种有毒次级代谢产物,严重降低玉米品质,威胁食品安全。DHOD基因编码二氢乳清酸氧化酶(DHOD),主要通过参与生命体中的嘧啶合成途径来影响机体的DNA、RNA合成,进而调控次生物质代谢等过程。为明确DHOD基因在拟轮枝镰孢伏马毒素生物合成中的作用,首先分析拟轮枝镰孢DHOD的系统发育关系,然后通过同源重组法创制拟轮枝镰孢DHOD基因敲除突变体,采用高效液相色谱法(HPLC)检测拟轮枝镰孢野生型与DHOD基因敲除突变体伏马毒素产生量的差异,并利用RT-qPCR技术分析DHOD基因及伏马毒素合成相关基因的表达量。系统发育分析及序列同源比对结果表明,DHOD基因在镰孢菌中较保守;PCR和RT-qPCR分析表明,采用同源重组法获得了拟轮枝镰孢DHOD基因敲除突变体;HPLC分析显示,DHOD基因敲除突变体的毒素产量较野生型显著下降88.32%~93.56%;RT-qPCR检测结果表明,拟轮枝镰孢DHOD基因敲除突变体中fum1、fum6、fum8和fum13基因表达量较野生型均显著下降。综上所述,拟轮枝镰孢中DHOD基因表达量与伏马毒素的产量呈正相关。

玉米种子内部拟轮枝镰孢菌抗性的QTL定位

为探究玉米种子内部对拟轮枝镰孢菌的抗性,利用由抗病自交系BT-1与感病自交系N6构建的RIL群体为材料,进行4个环境的联合QTL分析.结果表明,6个控制种子内部对拟轮枝镰孢菌抗性的QTL分布在第1、3、4、9、10染色体上,表型贡献率介于1.32%~7.62%.其中,表型贡献率最高的QTL qSIR3-1位于第3染色体,解释7.62%的表型贡献率,抗病效应来自于抗病亲本BT-1.6个QTL中的1个与已知种子外部抗性QTL一致,表明玉米种子内部对拟轮枝镰孢菌的抗性是独立的性状.

拟轮枝镰孢荧光标记与侵染结构观察

【目的】以玉米穗腐病优势病原菌和伏马毒素主要产毒菌拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)为研究对象,构建组成型表达绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白DsRED、过氧化物酶体靶向标记蛋白DsRED-PTS1和细胞骨架F-actin结合蛋白LifeAct-GFP的荧光菌株,观察拟轮枝镰孢侵染玉米须表皮的穿透结构,明确拟轮枝镰孢侵染结构形成的调控机制和影响因素。【方法】通过农杆菌介导的遗传转化方法将荧光表达载体pCOM-GFP、pCOM-DsRED、pCOM-DsRED-PTS1和pCOM-LifeAct-GFP分别导入拟轮枝镰孢野生型菌株D85-2中,PCR鉴定含有目标基因的转化子,激光共聚焦显微镜观察各荧光蛋白的表达和分布;接种玉米须观察侵染结构;赛璐酚膜模拟植物表皮穿透试验,观察穿透结构和F-actin的动态组装;使用F-actin聚合抑制剂Latrunculin A、三环唑和活性氧抑制剂DPI(diphenyleneiodonium chloride)检测穿透结构形成的影响因素。【结果】建立了以遗传霉素G418为抗性标记的遗传转化方法;FV-GFP和FV-DsRED菌株分别具有清晰、明亮的绿色荧光和红色荧光,FV-DsRED-PTS1菌株中红色荧光呈圆点状分布,符合真菌中过氧化物酶体的分布特征,FV-LifeAct-GFP菌株孢子和菌丝内部具有丝絮状绿色荧光,符合真菌中F-actin蛋白的分布特征;玉米须表皮侵染过程中观察到菌丝顶端膨大类似附着枝侵染结构;赛璐酚膜模拟穿透试验观察到穿透结构中F-actin蛋白的成环组装;药物胁迫试验表明,穿透结构的形成受F-actin蛋白聚合和活性氧调控。同时,三环唑能够抑制穿透。【结论】构建了4种荧光标记菌株,细胞定位清晰,具有正常的生长表型和致病力,能够满足致病机制相关研究需求;明确了拟轮枝镰孢在侵染玉米时能够形成一种菌丝顶端膨大的类似附着枝状的侵染结构;确定了F-actin成环聚集、细胞骨架组装和活性氧调控是影响拟轮枝镰孢侵染结构形成的关键因素。

鲜食甜、糯玉米自交系对拟轮枝镰孢菌穗粒腐病的抗性鉴定

以形态学和分子生物学为基础,对鲜食甜、糯玉米穗粒腐病样品中致病菌拟轮枝镰孢菌进行分离鉴定。针对37份不同来源的鲜食甜、糯玉米自交系种质材料,采用针刺注射果穗接种法进行人工接种拟轮枝镰孢菌,并对其抗性进行鉴定。结果表明:不同鲜食玉米自交系种质的抗病性差异较大,Hw53、Hw71、Hw175、Ht219和Ht253共5份自交系对拟轮枝镰孢菌表现为高抗,而Hw61、Hw144、Hw145等10份自交系对该致病菌表现为高感。在22份糯玉米自交系种质中,对拟轮枝镰孢菌表现感病的种质有8份,占参试糯玉米自交系种质总数的36.36%;在15份甜玉米自交系种质中,对拟轮枝镰孢菌表现感病的种质有7份,占参试甜玉米自交系种质总数的46.67%,甜玉米相对糯玉米更易感染穗粒腐病。该研究结果可为鲜食甜、糯玉米穗粒腐病的综合绿色防治及抗性品种选育提供一定的理论依据。