LC-MS/MS法研究Cocktail探针药物咖啡因、右美沙芬、奥美拉唑、咪达唑仑及其代谢产物在大鼠血浆中的药代动力学

目的建立灵敏、快速、稳定的测定大鼠血浆中CYP450探针药物/代谢产物,咖啡因/副黄嘌呤、奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑、右美沙芬/右啡烷、咪达唑仑/1'-羟基咪达唑仑的LC-MS/MS方法,并用于其在大鼠体内的药代动力学研究。方法 100μL血浆样品加入内标地西泮及乙酸铵溶液,乙酸乙酯进行液液萃取,离心取上清挥干复溶,LC-MS/MS检测。选用Agilent Eclipse Plus-C_(18)色谱柱(50 mm×2.1mm,3.5μm),乙腈和0.01%甲酸(1 mmol·L^(-1)甲酸铵)作为流动相,梯度洗脱,流速为0.3 m L·min^(-1),进样量10μL。采用电喷雾电离源(ESI),扫描方式为多反应正离子监测模式(MRM+),咖啡因m/z:195.0/138.1;副黄嘌呤m/z:181.1/124.1;奥美拉唑m/z:346.1/198.1;5-羟基奥美拉唑m/z:362.1/214.1;右美沙芬m/z:272.2/147.1;右啡烷m/z:258.1/157.1;咪达唑仑m/z:326.1/291.1;1'-羟基咪达唑仑m/z:342.1/324.1;内标地西泮m/z:285.1/154.0。结果咖啡因、副黄嘌呤、奥美拉唑、5-羟基奥美拉唑、右美沙芬、右啡烷、咪达唑仑和1'-羟基咪达唑仑的线性范围分别为1.95~2 000、0.98~250、0.48~2 000、0.98~250、0.98~2 000、0.48~125、1.95~2 000和1.95~250μg·L^(-1)。RSD<15%且无基质效应。结论该方法快速、灵敏、重现性好,可用于血浆中上述探针药物/代谢产物浓度的测定,便于深入进行代谢酶CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的代谢相关研究。

Cocktail探针药物同时评价连翘对肝细胞色素P450的影响

目的 用Cocktail探针药物法 ,研究连翘对大鼠肝CYP4 5 0的影响。方法 将SD♂大鼠随机分组 ,给予连翘的水提物 ,以生理盐水组为空白对照 ,通过HPLC检测Cocktail探针药物的代谢率来评价各组CYP4 5 0。结果 给予连翘组的大鼠CYP1A2的水平显著低于对照组 ,CYP3A4的水平显著高于对照组 ,CYP2E1的水平没有显著变化。结论 连翘对大鼠CYP1A2有抑制作用 ,对大鼠CYP3A4有诱导作用 ,但对大鼠CYP2E1的影响不显著。

Cocktail探针药物法用于评价细胞色素P450同工酶影响的研究进展

目的综述Cocktail探针药物法用于评价药物对细胞色素P450同工酶影响的方法可行性及研究概况,为此方面的研究工作提供参考。方法查阅、总结和归纳近年来国内外有关文献。结果与结论Cocktail探针药物法已被设计用来证实药物-药物相互作用的体外预测,评估某种药物对细胞色素P450同工酶的诱导和抑制作用,用于表型分析及比较不同个体中酶活性的差异,在药动学研究和临床合理用药方面有重大意义。

探针药物法评价半夏生姜配伍对细胞色素P_(450)酶的影响

目的运用探针药物法分析半夏生姜配伍对大鼠细胞色素P450(CYP)酶的影响,为揭示相畏相杀配伍的科学内涵提供依据。方法将SD雄性大鼠随机分为四组,分别给予半夏、生姜的水提物及半夏-生姜合煎剂,以0.9%氯化钠溶液作为空白对照组,尾静脉注射丙米嗪探针药物,于给药后10,20,30,40,50和60min,眼眶取静脉血0.5mL,经提取、处理后,通过高效液相色谱(HPLC)法检测探针药物丙米嗪的药物浓度。结果半夏组、生姜组及配伍组丙米嗪浓度均低于对照组,各组CYP水平均明显升高;配伍组在10min处丙米嗪浓度低于半夏组,即配伍后CYP水平高于半夏组。结论半夏、生姜及半夏-生姜配伍均可诱导CYP酶;同时半夏-生姜配伍运用较之半夏单用,配伍运用对CYP酶具有诱导作用,可抵消半夏单用对CYP酶的抑制作用。

反相高效液相色谱法同时检测3种探针药物

用反相高效液相色谱同时测定血清中咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗探针药物的质量浓度,以乙腈 磷酸盐缓冲体系(含0 02mol/L的磷酸二氢钾和0 02mol/L的三乙胺,pH6 5)(体积比为25∶75)为流动相,以安替比林为内标,经C18柱(250mm×4 6mmi d ,5 0μm)分离,紫外检测器检测,使3种探针药物得到较好的分离,并且在有效血药浓度范围内线性良好。该法简便、快速,能够为临床安全有效的用药提供科学的依据。

Cocktail探针药物法评价生、制黄柏对CYP450酶亚型的影响

目的:用Cocktail探针药物法,研究黄柏不同炮制品对大鼠细胞色素P450酶(CYP450)4种亚型活性的影响并进行比较,探讨黄柏的炮制原理。方法:将SD大鼠随机分组,生、酒、盐黄柏组分别灌胃生、酒、盐黄柏水煎液(3.24 g/kg),空白对照组灌胃生理盐水,灌胃1 w,于第8天给予由茶碱、氨苯砜、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲组成的混合探针药物,在不同时间点采集血样,利用HPLC检测探针药物在大鼠体内的代谢情况,通过DAS3.0软件计算各探针药物的药动学参数并进行统计分析,以评价生、制黄柏对CYP450酶的影响。结果:与空白对照组比较,生品组和盐品组茶碱的t_(1/2)均显著增加,生品组和酒品组的CL/F均显著降低,AUC_(0-t)、AUC_(0-∞)均显著增加;生品组、酒品组和盐品组氨苯砜的t_(1/2)、AUC_(0-t)、AUC_(0-∞)均显著降低,CL/F显著增加;生品组和盐品组氯唑沙宗的AUC_(0-t)显著增加,酒品组氯唑沙宗的t_(1/2)、AUC_(0-∞)、AUC_(0-t)均显著降低,CL/F显著增加;生品组、酒品组和盐品组甲苯磺丁脲的AUC0-t均显著降低。结论:生黄柏对CYP1A2具有抑制作用,对CYP3A4具有诱导作用,对CYP2C9、CYP2E1活性的影响有待进一步的研究,而经炮制成为酒黄柏和盐黄柏后可改变药物代谢酶的活性;酒黄柏可降低对CYP1A2的抑制作用和增强对CYP3A4的诱导作用,该研究可为解释酒制黄柏能缓和药性提供参考依据。

“cocktail”探针药物法及其在研究中药对细胞色素P450影响中的应用进展

"cocktail"(鸡尾酒)探针药物法作为一种快速、高通量的研究方法,目前已广泛应用于药物对细胞色素P450(CYP450)活性影响评估、药物代谢途径确认、药物-药物相互作用预测、药物代谢表型分析、临床用药方案优化等诸多研究方向。此方法具有独特的优势和广阔的应用前景。本文主要从CYP450同工酶的特性、"cocktail"探针药物法的特点、探针药物选择依据、"cocktail"探针药物法在中药对CYP450代谢酶影响中的应用进行综述。旨在较为系统地梳理相关研究进展,并为此方面的深入研究工作提供参考。

“Cocktail”探针药物法的研究进展

“Cocktail”(鸡尾酒)探针药物法是一次给予两种或多种的探针药物的方法。本文主要介绍“Cocktail”探针药物法在测定药物代谢酶活性以评价药物间相互作用、研究药物代谢酶活性与疾病之间关系、研究遗传或非遗传因素对代谢酶活性影响的应用。简要介绍了“Cocktail”探针药物法在临床研究中的应用,并且对体内药物代谢酶活性测定的“Cocktail”探针等方面进行较全面的综述。

Cocktail探针药物法在中药细胞色素P_(450)酶代谢研究中的应用

细胞色素P450酶是人体内最重要的药物代谢酶,中药可抑制或诱导某个或某些细胞色素P450亚酶,从而影响合用药物的代谢,导致药物相互作用发生。中药代谢研究是中药现代化研究的重要方面,可提高中药使用的有效性和安全性,促进临床合理用药。Cocktail探针药物法能全面、真实地反映药物代谢的过程,其优点在于多个代谢途径的信息可在单个实验过程获得,并将个体间影响降至最低,此法省时、经济。Cocktail探针药物法用于中药的代谢研究是一个比较新的研究领域,近几年开始有文献报道。该文介绍了Cocktail法在中药细胞色素P450酶代谢研究中的国内外应用进展,以期系统了解并指导该领域的研究。

探针药物评价藤黄酸对肝细胞色素P450酶亚型的影响

目的用Cocktail探针药物法,研究藤黄酸对大鼠肝细胞色素P450(CYP450)的影响。方法将SD大鼠随机分组,藤黄酸组给予藤黄酸0.5%CMC-Na溶液(2mg·mL-1),以0.5%CMC-Na为空白对照,在一定的时间点采集血样,通过HPLC检测探针药物在大鼠体内的代谢情况,以评价藤黄酸对肝细胞色素P450酶的影响。结果藤黄酸组中咖啡因和氨苯砜的代谢情况与空白组没有显著性差异,但氯唑沙宗的代谢加快,t1/2缩短。结论藤黄酸对代谢酶CYP1A2及CYP3A4的影响不明显,但对代谢酶CYP2E1具有诱导作用。

“Cocktail”探针药物法的研究思路与应用

近年来关于细胞色素P450(CYP450)及其同工酶在药物代谢、毒理学、肿瘤生化、临床合理用药和新药研发等方面的研究都取得了很大进展。"Cocktail"探针药物法作为一种快速、有效的评价药物对CYP450酶活性影响的方法,有着不可替代的优势和广阔的应用前景。为此文章通过总结归纳近年来国内外的相关文献,介绍了"Cocktail"探针药物法的概念、优势和基本研究思路,并对其方法学的验证与优化,探讨药物间的相互作用,评价肝、肾功能,优化给药剂量等方面进行了综述。

细胞色素P450 2D6氧化酶研究的表型分析及探针药物

近年来细胞色素P450酶(CYP450)的多态性已成为研究热点,而作为研究手段的表型分析及探针药物直接关系到研究的价值和意义。现综述CYP450 2D6氧化酶多态性研究的表型分析的影响因素及优缺点,并介绍几种探针药物,包括右美沙芬、美托洛尔、普罗帕酮、可待因、异喹胍、司巴丁的特点及其检测方法。

探针药物法评价氟尼辛葡甲铵对猪肝CYP450酶的影响

采用Cocktail探针药物法探讨氟尼辛葡甲铵对猪肝CYP450酶是否具有诱导或抑制作用。将12头健康猪随机均分为2组,公母各半。试验组每天肌肉注射氟尼辛葡甲铵1次(11 mg/kg),对照组给予相同体积的生理盐水,连续给药10 d。通过HPLC检测探针药物的代谢率,来评价各组CYP450水平。结果显示,试验组的氨苯砜代谢减慢,t1/2延长;而氯唑沙宗代谢加快,t1/2缩短。这说明氟尼辛葡甲铵对猪CYP3A4具有抑制作用,而对CYP2E1存在诱导效应。

采用特异性探针药物法测定双峰驼CYP3A酶活性

【目的】探究双峰驼CYP3A酶体外活性及其对外源性药物代谢的影响。【方法】将双峰驼禁食过夜12 h,颈静脉放血处死后,立即于肝门静脉处采集块状肝脏组织,洗去血污称重匀浆后,采用Ca2+沉淀法制备双峰驼肝微粒体,并通过BCA法测定其蛋白含量。同时优化双峰驼肝微粒孵育体系,取不同浓度的双峰驼肝微粒体蛋白悬液(0.016、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg·m L-1)、不同浓度的探针药物咪达唑仑(MDZ)(7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000μg·m L-1)分别加入到孵育体系中,37℃预孵育5 min后,加入NADPH溶液后再孵育不同时间(0、2、5、10、15、20、25、30 min)。待反应完全后加入冰冷的甲醇和地西泮(DZP)溶液,涡旋混匀,800μL全部混合液体经14 500 r/min离心20 min后,取20μL上清液进行高效液相色谱紫外检测(HPLC-UV),确定最适底物浓度、最适酶浓度以及最适孵育时间。分别取浓度为7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000μg·m L-1 MDZ探针药物溶液20μL与双峰驼肝微粒体共同孵育15 min后,以混有内标DZP的冰冷甲醇终止反应,采用高效液相色谱紫外检测法测定反应产物1'-羟基咪达唑仑(1'-OHMDZ)的动态含量,计算出部分药物动力学参数。色谱条件:Sigma-Aldrich/Supelco Discovery C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相为V(乙腈)﹕V(0.01 mol·L-1 PBS缓冲液)=40﹕60;等浓度洗脱20 min;检测波长为254 nm;流速为0.8 m L·min-1;柱温为30℃;进样量为20μL。【结果】使用Ca2+沉淀法制备的双峰驼肝微粒体保持了酶的良好活性,能满足后续体外药物代谢试验的基本要求,经BCA法测定其蛋白含量为(1.936±0.052)mg·m L-1。双峰驼肝微粒体蛋白悬液、探针药物MDZ、PBS缓冲液、Mg Cl2溶液以及NADPH溶液构成双峰驼肝微粒体孵育体系,随着孵育时间的延长,酶和底物进一步反应,当MDZ浓度为125μg·m L-1(终浓度为7.073 nmol·m L-1),肝微粒体浓度为2.000 mg·m L-1(终浓度为0.050 mg·m L-1)时,孵育15 min,酶和底物的结合最紧密,并呈现出饱和的状态,故确定其终浓度和时间为最适浓度和最佳孵育时间。经HPLC-UV法测定,1'-OHMDZ、MDZ和DZP的出峰保留时间分别为6.710、11.383和15.263 min,各成分色谱峰分离良好,且不受肝微粒体孵育体系中其他干扰峰的影响。HPLC检测方法的精密度、稳定性及回收率的试验结果均符合色谱测定的基本要求,即成功建立了准确、灵敏、可靠、重现性好的双峰驼CYP3A酶特异性探针药物的检测方法。以底物MDZ浓度和反应产物1'-OHMDZ生成速率进行Lineweaver-Burk双倒数作图,分别计算出最大反应速度Vmax和米氏常数Km。经Origin Pro8.6软件进行线性回归分析得到最大反应速度Vmax为(0.380±0.028)nmol·mg-1·min-1,米氏常数Km为(9.603±3.229)nmol·m L-1,以此体现酶和底物的反应情况,并对双峰驼CYP3A酶的活性进行了间接测定。【结论】成功建立了跟踪检测CYP3A酶的特异性探针药物MDZ及其代谢产物浓度的高效液相色谱紫外检测方法。MDZ在体内经CYP3A酶的特异性氧化代谢后主要生成1'-OHMDZ,本文以MDZ的代谢产物1'-OHMDZ的生成速率为检测指标,首次对双峰驼CYP3A酶的体外活性及酶与底物的相互作用特点进行了研究。

Cocktail探针药物法评价辣椒素对大鼠CYP450亚型的影响

目的:采用cocktail探针药物法研究辣椒素在体外对大鼠肝微粒体CYP 450四种亚型的影响。方法:分为试验组和对照组,试验组采用大鼠肝微粒体孵育体系、探针药物和系列浓度的辣椒素(对照组仅加入缓冲液)共同孵育20 min,反应终止后用HPLC方法检测代谢产物的生成量以代表酶的活性。采用Graphpad prism 5.0计算辣椒素对各亚型的IC50值。将辣椒素与大鼠肝微粒体分别预孵育0,5,10,15,20,30 min,计算不同预孵育时间下各亚型的相对活性百分比。结果:辣椒素对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP2C11、CYP2E1和CYP3A2的IC50值分别为36.21,17.19,51.64,18.86 μmol·L-1。预孵育没有增强辣椒素对CYP450的抑制作用。结论:辣椒素在体外对大鼠肝微粒CYP1A2、CYP2C11、CYP2E1和CYP3A2具有抑制作用,且未呈现出预孵育时间依赖性。

CYP3A22稳定表达HepG_2细胞株的建立及其探针药物代谢活性鉴定

目的建立稳定表达Bama小型猪细胞色素CYP3A22的HepG2细胞株。方法通过从Bama小型猪肝组织中提取tRNA、经RT-PCR得到Bama小型猪CYP3A22的基因,并将此基因克隆至亚克隆载体pMD18-T上得到重组质粒pMD-3A22;以测序确定的重组质粒pMD-3A22为模板,采用PCR扩增CYP3A22基因并在其3′添加组氨酸标签,扩增产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,将带有组氨酸标签的CYP3A22基因定向克隆至pcDNA3.1(+)中,测序表明,CYP3A22基因真核表达载体正确构建;将测序正确的CYP3A22基因通过脂质体转染至HepG2细胞,G418筛选10代,RT-PCR及Western blot分析,并用探针药物硝苯地平对重组细胞进行进行活性鉴定。结果与HepG2相比,HepG2-CYP3A22细胞株具有极显著的硝苯地平氧化活性。结论成功建立了稳定表达CYP3A22的HepG2细胞株,可用于相关的药物代谢研究。

一种HPLC同时测定大鼠血浆中CYP450五种同工酶探针药物浓度的新方法

目的:建立HPLC法同时测定大鼠血浆中5种同工酶探针药物浓度的方法。方法采用氯仿提取五种探针药物,Topsil C18色谱柱(250mm×4.6mm 5μm),流动相以甲醇-磷酸氢二铵缓冲液(pH值3.4)梯度洗脱。检测波长230nm,流速1.0mL·min^-1,柱温35℃。结果:5种探针药物在0.2~50μg·m L^-1范围内线性关系良好,方法提取回收率咖啡因98.08%~98.25%,美托洛尔97.81%~101.61%,氯唑沙宗99.92%~102.53%,甲苯磺丁脲98.83%~105.82%,咪达唑仑96.58%~101.47%.结论:该方法样品处理简便,专属性好,快速、准确、经济,可应用于五种同工酶探针药物的同时测定,适合进行药物对CYP450酶同工酶(CYP1A2、2D4、2E1、2C11和3A2)活性的影响及药物相互作用研究。

Cocktail探针药物法在中药研究中的应用

早在20世纪80年代末,Breimer和Schellens等[1]就首次提出同时使用多个探针药物（Cocktail法）来评价多个细胞色素P450（CYP450）亚型酶的活性,并对其可行性和用途作了充分的阐述。目前Cocktail法主要用于西药的药物代谢研究,

探针药物法评价黄草乌酒对大鼠肝脏CYP1A2、CYP3A1和CYP2E1的影响

目的探讨黄草乌酒对大鼠CYP450亚型(CYP1A2、CYP3A1、CYP2E1)的代谢活性的影响。方法采用Cocktail探针法(咖啡因、咪达唑仑和氯唑沙宗),利用超高效液相色谱—串联质谱(UPLC-MS/MS)测定黄草乌酒对大鼠CYP450亚型活性影响。将大鼠随机分为5组,分别为空白对照组、白酒组、单草乌组、低草乌酒组和高草乌酒组,各组动物连续灌胃给药14 d,于第15 d腹腔注射Cocktail探针药液,并于腹腔注射探针药液前后不同时间点断尾采血。使用UPLC-MS/MS测定各探针药物的血药浓度,评价CYP450亚型的代谢活性。结果氯唑沙宗的半衰期(T1/2)均低于空白对照组(P<0.05),表明酒精、黄草乌和黄草乌酒对CYP2E1均有明显的诱导作用。与空白对照组相比,酒精对CYP1A2和CYP3A1的诱导不明显。与白酒组相比,黄草乌酒对CYP3A1和CYP2E1的诱导以及对CYP1A2的抑制作用均无显著性差异。结论黄草乌与酒精合用后可诱导CYP2E1的活性,发生药物间相互作用,增加黄草乌对大鼠的肝毒性。

HPLC法测定大鼠血浆中CYP450不同亚型探针药物浓度

目的:建立同时测定细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450)亚型CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1活性的Cocktail探针药物溶液的高效液相色谱(HPLC)检测方法.方法:分别选择茶碱、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗作为CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的特异性探针药物,根据其理化特点配制成Cocktail组合探针溶液.使用HPLC梯度洗脱法同时测定3种探针药物的血药浓度,并对其方法学进行验证.结果:本研究建立的HPLC法可以同时测定大鼠血浆中3种探针药物的浓度,各探针药物的吸收峰分离完全,无杂峰干扰;线性关系良好,线性范围为0.02~50μg/mL,最低检测限为0.02μg/mL.日内、日间精密度均小于10%,回收率在87.74%~ 112.39%之间,稳定性高,室温放置、-20℃冷冻1周和3周的RSD均小于10%.将该方法应用于研究大鼠体内此3种酶的活性,证明其具有较好的灵敏度.结论:经方法学验证,此法可同时测定3种探针药物茶碱、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗的血浆浓度.