tRNA抑制子对转录因子NKX2.5提前终止密码子的通读

人类NKX2.5基因（NK2 homeobox 5，NKX2.5）提前终止密码子（Premature termination codon，PTC）突变会引起房间隔缺损、房室传导阻滞等先天性心脏病。目前，已报道的NKX2.5 PTC突变有8个（E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X）。为了检测tRNA抑制子是否对PTC突变诱导通读产生有功能的全长蛋白，文章将8个NKX2.5 PTC突变克隆到pcDNA3.1（-）载体，将NKX2.5全长和E109X、Q149X及C264X克隆到pEGFP-N1载体，形成NKX2.5-EGFP融合质粒。将NKX2.5-EGFP与对应的tRNA抑制子质粒分别或共转染后观察绿色荧光数量定性判断tRNA抑制子是否诱导通读。Western blotting检测通读后全长蛋白和截短蛋白表达并计算通读效率。Real-time PCR检测NKX2.5下游重要调控基因Cx43 mRNA的表达判断通读后蛋白功能。结果表明，文章成功构建了8个基于pcDNA3.1（-）的NKX2.5表达质粒、4个基于pEGFP-N1的质粒；tRNA抑制子tRNA am能有效通读Q149X、Q170X、Q187X和Q198X，且对后三者的通读效率均在50%以上；tRNA op能有效通读C264X，通读效率约50%左右；tRNA oc不能通读NKX2.5 PTC突变；各通读后样本Cx43 mRNA相对表达量增加7%~41.7%；tRNA am和tRNA op能有效通读NKX2.5 PTC突变，产生具有功能的全长蛋白，但tRNA抑制子对细胞的其他影响还不明确，有待于进一步观察。

NMD作用的顺式调控元件

真核生物利用无义介导的mRNA降解 (nonsense mediatedmRNAdecay ,NMD) ,对含有提前终止密码子(prematureterminationcodons ,PTC)的异常转录产物进行快速清除 ,防止毒害性截短蛋白 (truncatedproteins)的产生 ,是真核生物重要的mRNA监视机制。NMD作用的启动与多种顺式调控元件有关 ,它们包括 :提前终止密码子的标识 ;PTC下游特定位置的序列元件 ,在酵母细胞称为DSE (downstreamsequenceelement,DSE) ,在哺乳动物细胞主要为内含子剪接依赖性序列元件 (exon exonjunction ,EEJ) ;稳定作用元件 (stabilizerelements ,STE)对NMD作用的阻抑调节 ;以及其他与NMD作用相关的序列 ,如 poly(A)延长、5′ UTR的uORF(upstreamopenreadingframe ,uORF)和程序化核糖体移码 (programmed 1ribosomalframeshift, 1PRF)信号序列等。

Hepatology Communications|CRISPR介导的单碱基编辑可高效沉默HBV S基因

HBV感染是肝硬化和肝细胞癌的主要危险因素之一。聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已被用于精确编辑HBV基因组,并通过双链断裂(DSB)的非同源末端连接修复清除HBV。然而,CRISPR/Cas9介导的DSB引发宿主基因组的不稳定性,编辑基因组的效率较低,限制了其应用。CRISPR胞苷碱基编辑器(CBE)可以通过产生提前终止密码子来沉默基因。吉林大学第一医院和明尼苏达大学开展的一项联合研究开发了一种CRISPR碱基编辑器来精确编辑HBV基因组内的单核苷酸,从而沉默HBV基因的表达。HBsAg由HBV S基因编码。

真核细胞中无义介导的mRNA降解

无义介导的mRNA降解(NMD)作为一种有效的细胞监控机制,主要监测细胞转录产物的提前终止密码子(PTC),并使得含有PTC的mRNA被迅速降解,从而防止其被翻译成为缺陷性的蛋白质。尽管NMD具有一定的保守性,但在酵母、哺乳动物以及后来的果蝇细胞中都发现有所不同。目前对于NMD的研究已进入了结构领域并发现它与端粒调控和RNAi等机制相互关联。

无义介导的mRNA降解与肿瘤

无义介导的mRNA降解(nonsense-m ed iated mRNA decay,NMD)能够选择性降解含有翻译提前终止密码子(prem ature translation term ination condon,PTC)的mRNA,从而防止对机体有害的截短蛋白(truncated pro-te ins)的产生,它是真核生物中广泛存在的一种高度保守的有效的监督机制。NMD与肿瘤发生发展过程中的基因突变有密切关系。

无义介导的mRNA降解机制及其在单基因遗传病中的作用

无义介导的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是一种广泛存在于真核生物细胞中的mRNA质量监控机制。该机制通过识别和降解含有提前终止密码子(Premature translational-termination codon,PTC)的转录产物防止有潜在毒性的截短蛋白的产生。据估计,约1/3的遗传性疾病是由提前终止密码子引起的,而NMD作用通常会改变某些遗传病的临床症状或遗传方式。文章主要综述了人体细胞中NMD对底物的识别及其作用机制,并以几种单基因遗传病为例探讨其对这些疾病表型的影响,表明NMD作用机制的进一步揭示将有助于单基因遗传病发病机制的阐明及治疗方法的改进。

无义介导的mRNA降解

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作为真核细胞中重要RNA监控机制,识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的mRNA,以避免因截短的蛋白产物积累对细胞造成毒害.NMD还调控正常生理基因的表达,暗示其在真核细胞中扮演重要角色.NMD途径的关键是PTC的识别.本文通过3种模型来分别阐述发现于哺乳动物、酵母等不同有机体的识别机制.通常由NMD因子UPF1(up-frameshift)等被招募至含PTC的mRNA上,借助这些因子组装形成"功能复合体"并激活降解.但目前对于PTC识别后的过程仍认识有限,本文通过综述NMD途径的分子机制以更好地理解其生物学意义.

NMD逃逸机制及其在疾病治疗中的应用

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是指在病理或正常生理情况下mRNA上出现了提前终止密码子(premature termination codon, PTC),从而导致mRNA降解。它是一种广泛存在的mRNA质量监控机制。近年来,在多种疾病中发现某些PTC并未触发NMD,这种现象被称为NMD逃逸(NMD escape),然而其确切机制尚不十分清楚。目前公认的两个学说为:(1) PTC通读,即蛋白的翻译可以顺利通过PTC直至正常的终止密码子,产生全长蛋白;(2)翻译的重新启动,即蛋白翻译在PTC下游的潜在起始点重新开始直至终止密码子,产生N端截短蛋白。目前,通过利用PTC通读,越来越多的药物或小分子已被成功用于无义变异相关疾病的治疗。本文主要综述了NMD逃逸的机制及其在疾病治疗中的应用和进展,以期为进一步了解NMD逃逸及其相关应用概况提供参考。

mRNA的无义介导降解

无义介导的mRNA衰变(NMD)选择性地迅速降解含有提前终止密码子的mRNA,保护机体免于截短蛋白质产生的有害效应,是真核细胞广泛存在的保守的mRNA监视机制,有重要生物学意义。关于其基本机制目前提出了一些模型。

无义突变通读活性检测方法的研究进展

研究发现,30%人类致病基因突变属无义突变,基因编码区发生的无义突变可致蛋白翻译在无义突变位点提前终止,导致蛋白功能缺失,引起包括遗传病、肿瘤在内的众多疾病。少数化合物具有无义突变通读作用,可诱导全长蛋白翻译而恢复部分功能,是一种前景广阔的潜在治疗药物。筛选新型无义突变通读剂至关重要,这些工作有赖于通读活性检测方法的发展和完善。目前通读剂活性检测方法主要包括两大类型,原理都是基于蛋白截断试验(protein truncation test,PTT)或报告基因系统。本文较全面地回顾了无义突变通读活性检测方法的发展及最新进展,为高通量筛选方法的建立提供参考,从而进一步推动新型通读剂的筛选工作,发现具有临床药物潜力的候选化合物,用以治疗无义突变所致众多疾病。

一种新的Srrm1/SRm160可变剪接体经历无义突变介导的mRNA降解

目的:研究基因Srrm1/SRm160的可变剪接。方法:应用RT-PCR研究Srrm1/SRm160的可变剪接,通过蛋白质的翻译抑制和RNA干扰研究剪接异构体是否经历无义突变介导的mRNA降解(NMD)过程。结果:获得Srrm1/SRm160新的可变剪接异构体,该异构体产生提前终止密码子,翻译抑制和RNA干扰证实含有提前终止密码子的剪接体经过NMD而降解。结论:Srrm1/SRm160通过可变剪接和NMD调节自身的表达水平,作为剪接因子进一步调节其他基因的可变剪接。

凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达

本研究以含有fⅨ cDNA的pcDNA3.1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS-7细胞中的表达。采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨ mRNA在各组的相对表达水平。结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功。实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA。结论:采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FⅨ功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础。

无义突变通读诱导剂研究进展

随着大量新化学物的合成,以及各种工业废物的排放,人类接触环境化学致突变物的机会越来越多。化学致突变物可在人体内诱导各种基因突变,包括无义突变[1]。在人类所有致病基因的突变类型中,30%的突变属于无义突变[2]。

无义突变型荧光素酶稳定表达细胞株的建立

目的:建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株,用以筛选新的无义突变通读剂。方法:酶切质粒p GL4-WT和p GL4-MUT,得到野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,分别插入到慢病毒载体p LVX-IRES-Neo多克隆位点。酶切及PCR鉴定后,将重组载体包装成慢病毒颗粒,感染HEK 293细胞,单克隆细胞抗性筛选获得稳定细胞株,提取总RNA,经逆转录PCR方法验证荧光素酶m RNA表达。最后用已知阳性无义突变通读剂G 418处理细胞,Western blot方法检测处理前后荧光素酶蛋白表达水平,同时分析荧光素酶活性。结果:经酶切获得2.7 kb长野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,与p LVX-IRES-Neo连接获得重组慢病毒载体p LVX-WT、p LVX-MUT,EcoRⅠ单酶切、NheⅠ与BamHⅠ双酶切结果证明序列正确插入,PCR也扩增出目的片段;稳定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT细胞经逆转录PCR方法成功检测到荧光素酶m RNA表达;阳性通读剂G 418处理细胞后发现,HEK293WT细胞在处理前后均表达荧光素酶蛋白,荧光素酶活性也基本相同,而HEK293MUT细胞在处理前不表达荧光素酶蛋白,无荧光素酶活性,处理后恢复了部分荧光素酶蛋白表达,其荧光素酶活性相当于HEK293WT细胞的20%。结论:成功建立了稳定表达无义突变荧光素酶的细胞株,可用于筛选新的无义突变通读剂。

无义突变通读药物研发进展

无义突变与众多疾病发生有关,包括肿瘤和遗传病。某些化合物如氨基糖苷类抗生素、非氨基糖苷类抗生素及其他小分子化合物能诱导无义突变通读,从而翻译出有功能的全长蛋白。化合物诱导的无义突变通读对于遗传病及肿瘤治疗是一个非常有潜力的治疗策略,但目前没有几种化合物显示出确切的临床疗效。因此,急需筛选新型、更具药物特性的化合物,推动通读治疗走向临床。本文详细介绍了无义突变通读药物的研究现状,为新药开发提供参考。

基因治疗药物无义突变通读活性检测方法的研究进展

30%人类致病基因突变属无义突变,无义突变可导致众多疾病。无义突变通读剂具有无义突变通读活性,可诱导基因恢复其功能,属于基因治疗药物。基因编码区发生的无义突变可致蛋白翻译在无义突变位点提前终止,导致蛋白功能缺失,引起包括遗传病、肿瘤在内的众多疾病。少数化合物具有无义突变通读作用,可诱导全长蛋白翻译,是一种潜在的治疗药物。目前通读剂活性检测方法主要包括蛋白质截短试验和报告基因系统两大类型。本文回顾了无义突变通读活性检测方法的发展及最新进展,为药物高通量筛选方法的建立提供参考。

无义介导的mRNA降解在胚胎发育中的作用及机制的研究进展

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)最初被认为是一种广泛存在的mRNA质量监控机制,可迅速降解含有提前终止密码子的异常mRNA,避免有害的、截短的蛋白产物积累而对细胞造成损害。最近研究显示,NMD也可以调控执行重要细胞生理功能的正常基因转录物的降解过程,因此被认为是真核生物中高度保守的转录后调节机制。NMD直接或间接调控从酵母到人的3%～20%的转录组,对于细胞稳态、应激反应、增殖、分化等多种生理活动都是必不可少的。研究表明,NMD可以调节与发育相关的转录物的水平,NMD因子敲除大多具有胚胎致死效应。NMD在胚胎干细胞的自我更新、分化与胚胎发育的过程中发挥重要作用。本文将对NMD在胚胎发育中的作用及机制的最新研究进展进行综述,以期为胚胎发育的研究和胚胎发育相关疾病的治疗提供新的思路。