α-乳白蛋白单克隆抗体的制备及斑点印迹定性检测方法的建立

以α-乳白蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗α-乳白蛋白单克隆抗体;采用碳二亚胺法,并通过工艺优化,将单抗与量子点高效偶联;在此基础上,建立了基于斑点印迹技术定性检测乳制品中过敏原α-乳白蛋白的方法。结果表明:采用杂交瘤技术制备的单克隆抗体特异性好,与牛奶中其他蛋白无交叉反应;当量子点、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、单抗摩尔比为1∶10∶6∶4时,量子点与单抗有较好的偶联效果;以量子点标记单抗建立的斑点印迹方法可直观、快速的定性分析乳制品中过敏原α-乳白蛋白。因此,该方法具有一定的实用价值。

Western斑点印迹法检测致病性副溶血弧菌

目的:对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法:用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用棋盘方法确定免疫血清最佳工作浓度,并对致病性与非致病性副溶血弧菌分别进行特异性测定。结果:最佳免疫血清最佳工作浓度为1:3200;检测致病性副溶血弧菌为阳性,非致病性副溶血弧菌属呈阴性。结论:Western斑点印迹法技术可以特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单,可用肉眼判定结果。

RNA斑点印迹法检测人食管癌DNA聚合酶β的基因表达

目的 :探讨人食管癌组织DNA聚合酶 β(polβ)RNA水平的表达。 方法 :提取 5 1例食管癌患者的手术标本组织 ,包括 :17例癌灶组织 ,17例癌旁组织 ,17例“正常”组织细胞总RNA ,以生物素标记的polβcDNA探针进行RNA斑点印迹。结果 :DNApolβRNA水平的表达癌组织高于癌旁组织 (P <0 .0 5 ) ,癌旁组织高于“正常”组织 (P <0 .0 5 ) ,癌组织高于“正常”组织 (P <0 .0 1)。结论 :人食管癌组织及癌旁组织的DNApolβ基因RNA水平表达显著高于“正常”组织 ,提示DNApolβ的过表达可能在食管癌的发生、发展中起 作用。

用Y染色体特异性探针作斑点印迹法检测人血痕的性别

血痕的性别检查是法医学检案中一个重要内容。过去常用的方法是检查血痕里残存有核细胞中的x和y小体，也有试图测定血痕中性激素(主要是睾丸酮)含量的办法来达到鉴定性别的目的。但都因方法比较繁琐且结果不大可靠，或男女性别判断的界线不够清楚，或受澎响的因素太多而不能令人满意。

免疫组织化学与完整细胞原位蛋白质斑点印迹联合应用的探讨

免疫组织化学与完整细胞原位蛋白质斑点印迹联合应用的探讨郑乃刚１）吴景兰２）陈奎生２）丁一２）王一菱２）１）河南省临床检验中心郑州４５００５２２）河南医科大学分子细胞生物学研究中心郑州４５００５２关键词斑点印迹；免疫组织化学；技术与方法玻片上细胞标本的...

DIFA检测非放射性斑点印迹技术的探讨

为提高分子生物学的实验效率和节省昂贵的试剂，将核酸分子或蛋白质分子预先结合于硝酸纤维素膜（ＮＣＭ）上，应用自制的ＤＩＦＡ装置检测非放射性斑点印迹。结果表明：此技术可快速检测生物活性试剂的效价及工作浓度；选择研究样本及试验条件；鉴定探针灵敏度等。

斑点印迹法检测抗-Jo-1抗体的临床研究

目的建立简便可靠的检测抗-Jo-1抗体的方法。方法用丙酮沉淀兔胸腺中的总蛋白制成兔胸腺丙酮粉,从兔胸腺丙酮粉中提取可提取性核抗原(ENA),ENA经亲和色谱纯化出Jo-1抗原,将纯化的Jo-1抗原制备成斑点印迹(DB)试剂盒,用该试剂盒检测多种风湿免疫性疾病和正常血清中的抗-Jo-1抗体,探讨各种血清中抗-Jo-1抗体的阳性率。结果 DB试剂盒共检测92份血清中的抗-Jo-1抗体。各种风湿性疾病血清69份,其中多发性肌炎(DM)20份,阳性6份(30%);其他风湿性疾病49份,无阳性。健康对照23份,无阳性。该试剂盒对诊断DM的敏感度为30%,特异度为100%。结论 DB试剂盒检测抗-Jo-1抗体方法简便,结果可靠,具有较大的临床开发应用价值。

利用反向mRNA斑点印迹从抑制消减杂交阳性克隆中筛选差异表达基因

目的 :建立一种从抑制消减杂交阳性克隆中筛选差异表达基因的方法。方法 :以阵列方式将抑制消减杂交阳性克隆的PCR产物点加于尼龙膜上 ,以标记 polyA+ RNA为探针进行反向杂交 ,化学发光法检测 ,在图象分析仪上进行光密度扫描 ,计量平均单位面积光密度 ,扣除背景 ,计算两个阵列各对应点之间光密度值的比值R(ratio)。差异表达基因的阳性判定标准为R值大于或等于 2 .0 0。结果 :通过反向mRNA斑点印迹技术可以从抑制消减杂交阳性克隆中把差异表达基因有效地筛选出来。结论 :反向mRNA斑点印迹技术是一种筛选抑制消减杂交差异表达基因的有效方法。

定量斑点印迹分析技术在高通量样品蛋白表达水平检测中的应用

目的检测定量斑点印迹(QDB analysis)技术在高通量组织样品和细胞样品蛋白表达水平定量检测中的应用情况。方法采用QDB analysis技术检测87只小鼠的前列腺组织中tubulin的相对表达水平,以及8种人细胞系中tubulin的绝对表达水平(即蛋白真正表达水平)。结果通过QDB analysis技术发现小鼠前列腺组织中tubulin蛋白的表达水平根据小鼠周龄不同而有所不同;8种人细胞系中tubulin蛋白的绝对表达水平在90~140 fmol/μg之间。结论QDB技术可适用于高通量组织样品和细胞样品中蛋白表达水平的相对定量和绝对定量检测。

用斑点印迹分析检测斑节对虾白斑综合征病毒

用2步PCR、位点杂交和斑点印迹分析测试了1997年7—8月从2个有白斑病养殖场采集21尾斑节对虾中存在的白斑综合征杆状病毒(WSBV)。还测试了健康对照和试验感染虾。位点杂交和2步PCR的结果一致并用作比较的标准。除一个低量的假阴性外,用鳃、腹足。

用斑点印迹免疫检测技术快速鉴定牛分枝杆菌

本文介绍一种快速鉴定牛分枝杆菌的免疫检测技术,用牛分枝杆菌单克隆抗体,以硝酸纤维素膜作固相载体只需4小时就可与其它分枝杆菌进行区别,而用常规试验则需3周。

斑点免疫印迹法快速测定水蛭炮制品中水蛭素水解产物含量

目的:测定4批次水蛭炮制品水蛭素水解产物含量,建立斑点免疫印迹法评价相应生药材药效成分明确的中药炮制品质量新方法。方法:以鼠抗水蛭素单抗为一抗,应用斑点免疫印迹法对水蛭炮制品中水蛭素水解产物作定性检测,杂交信号应用Quantity one软件作定量分析。结果:4批次水蛭炮制品所含水蛭素水解产物的质量分数分别为296.51,165.47,95.58,298.05μg.g-1。结论:不同批次水蛭炮制品之间水蛭素水解产物含量差异显著,斑点免疫印迹法简便快捷,结果准确,无需大型设备,可用于水蛭与类似中药材炮制品的品质评价。

斑点免疫印迹法快速测定地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物

目的测定参环毛蚓、秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓和天锡杜拉蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物,建立斑点免疫印迹法评价相应生药材药效成分明确的中药炮制品质量新方法。方法以兔抗蚓激酶单抗为一抗,应用斑点免疫印迹法对地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物作定性检测,杂交信号应用Quantity One软件作定量分析。结果现行中药材参环毛蚓与山东产地方品种:秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓、天锡杜拉蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物的质量分数分别为125.23、118.34、81.05、72.13μg/g。结论秉氏环毛蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物与现行地龙炮制品参环毛蚓无显著差异,理论上可作为广地龙的替代品。斑点免疫印迹法简便快捷,结果准确,无需大型设备,可用于地龙与类似中药材炮制品的品质评价。

斑点免疫印迹法快速测定4品种家蚕蛾下颚溶茧酶含量

目的:测定4品种家蚕蛾下颚溶茧酶含量,并建立斑点免疫印迹法在中药材药效成分含量的测定方法。方法:以兔抗溶茧酶多抗为一抗,应用斑点免疫印迹法对4品种家蚕蛾下颚溶茧酶含量作定性检测,杂交信号应用Quantity one软件作定量分析。结果:4品种家蚕蛾下颚的个体溶茧酶平均含量分别为6.41、8.09、7.62、1.88μg/头。结论:不同品种家蚕蛾间下颚溶茧酶含量差异显著。斑点免疫印迹法简便快捷,结果准确,无需大型设备,可用于类似中药材药效物质的含量测定与品质评价。

大麦BYDV抗性的印迹杂交分析

大麦抗黄矮病毒 (BYDV)育种面临的主要困难之一 ,就是常规生物学抗性检测技术不能准确地进行抗性检测和抗性基因筛选。本文在前人的基础上 ,以大麦黄矮病毒 PAV株系和 RPV株系基因组中的特异核酸序列为探针 ,应用斑点印迹杂交分析技术 ,建立了一套简单、快速、有效的 BYDV抗性检测方法和抗性基因 (Yd2 )的筛选方法 ;同时也建立了一套适用于大麦 BYDV抗性检测的较为有效的带毒蚜虫饲养和管理方法。选用了 12个已知抗性和基因型的大麦品种 (系 )进行抗性检测 ,结果证实了这一抗性检测技术体系的可靠性与有效性。

RNA点印迹探测碱性成纤维细胞生长因子在激光损伤后视网膜中的表达

目的 观察激光损伤家兔视网膜后碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)表达时相的变化 ,探讨bFGF在视网膜激光损伤后修复过程中的地位和作用。方法 用不同剂量的YAG倍频激光 (5 32nm)致伤有色家兔视网膜 ,于伤后 1、3、7、14d取眼底视网膜 脉络膜组织 ,提取细胞总RNA进行RNA斑点印迹 ,用地高辛标记的bFGFcDNA探针进行核酸杂交 ,检测bFGFmRNA的表达水平。结果 激光损伤后眼底组织中bFGFmRNA的表达水平明显提高 ,且随激光致伤量的加大 ,bFGFmRNA的表达水平亦呈进行性增加。结论 激光损伤后眼底组织中bFGFmRNA的表达明显增加 。

一种快速筛选巴氏毕赤酵母高表达克隆的新方法

目的:为了准确、快捷地筛选到高表达的毕赤酵母工程菌株。方法:利用毕赤酵母的生理特点和免疫印迹的特异性,将转化子接种到MM板上至形成克隆,贴上NC膜,待NC膜被分泌产物湿润后,揭下NC膜,进行ELISA-dot鉴定,选出高表达克隆进行扩增、培养,并作SDS-PAGE和Westernblotting进一步确定。结果:该法的筛选结果与SDS-PAGE和Westernblotting相符。结论:与传统方法相比,该法具有高通量,快速,简便的优点,适合毕赤酵母工程菌株的筛选。