鸡新城疫病因与防控

鸡新城疫是一种由禽腺病毒引起的高度传染性疾病,主要影响鸡、鸭等禽类,该病症状以神经系统症状为主,如发抖、颈部下垂、瘫痪等,其严重程度取决于感染禽类的年龄和免疫状态。鸡新城疫在全球范围内广泛存在,并对养禽业造成了巨大的经济损失。因此,加强对鸡新城疫病因及防控的研究具有非常重要的现实意义。

鸡新城疫病的诊断与防治

鸡新城疫(ND)是被毒性很强的新城疫病毒(NDV)感染导致的鸡群急性高度接触性传染病。本病一年四季均可发生,但以春秋季多发,常呈地方性流行,易感鸡群一旦感染速发型新城疫病毒,可迅速传播,发病率和病死率可达90%以上。若鸡场在养殖过程中爆发该疫病,短时间内会致大量鸡死亡,甚至还会使疫情在当地大面积扩散,给养殖场造成巨大经济损失。本文对鸡新城病进行概述,主要分析了鸡新城病的病因、临床症状、诊断及防治措施,为养殖人员提供参考。

肉鸡新城疫病的临床症状及预防和治疗措施

肉鸡养殖是现代畜牧业中的重要分支,但随着养殖规模的扩大和密度的增加,新城疫病这种高度传染性的病毒性疾病对肉鸡养殖业的发展造成了严重影响。新城疫病会导致肉鸡的生长性能下降,增加养殖场的投入成本和经济损失。因此,深入了解新城疫病的发生、防治及研究进展对保障肉鸡养殖业的可持续发展具有重要意义。

鸡新城疫病的诊断与防治

新城疫是由新城疫病毒引起的一种禽类高度接触性、急性传染病，是严重影响养鸡业健康发展的重要疫病之一，也是我国国内检疫的一类动物疫病，可造成产蛋鸡产蛋量下降，育成鸡死亡率增加，给鸡场造成重大损失。近期我所在的某种鸡场产蛋种鸡暴发新城疫病，现在结合本次诊治情况及养鸡场存在的问题，谈一下鸡新城疫病的诊断与防治措施。

鸡新城疫病免疫失败的原因分析及防治

鸡新城疫（newcastle disease，ND），又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，是国家规定的一类动物疫病，具有很高的发病率和病死率，是养鸡业主重点防范的主要传染病之一。

新城疫病毒TS09耐热株在BHK细胞上的传代培养

以新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)TS09耐热株为研究对象,研究了该毒株在幼仓鼠肾传代细胞(BHK细胞)上的培养适应性。通过培养条件的优化、连续传代培养和极限稀释法纯化,获得了一株新的、纯化的、适应BHK细胞的NDV耐热株,命名为TS09-C株。TS09-C株的生物学特性测定结果表明,TS09-C株在BHK细胞中的增殖滴度为107.9TCID50/mL,平均鸡胚致死时间(MDT)大于120 h,脑内致病指数(ICPI)为0。与亲本株TS09株相比,TS09-C株的基因序列发生了较为明显的改变,但TS09-C株与亲本株仍保持着较近的遗传进化关系。

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆及序列分析

参照GenBank中NDV的核酸序列设计一对引物，利用RT-PCR扩增F基因并得到长约1．7kb的全基因片段，并将其构建到pMD-19T载体上。核苷酸序列测定结果表明：该基因片段全长1662bp，编码553个氨基酸，与GenBank下载的13株参考毒株F基因比较，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97．2％。99．2％和96．9％。98．7％；但与LaSota、F48E9及B1等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为88．6％～91．5％。NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序苑为112R．R-Q—K—R—F—I—G119，属于基因ⅦNDV。

新城疫病毒Ⅳ系活疫苗辅助治疗鼻咽癌患者的临床效果观察研究

目的:考察鸡新城疫病毒Ⅳ系(NewcastlediseasevirusⅣ,NDVⅣ)活疫苗作为辅助治疗手段用于人类鼻咽癌患者的安全性、免疫学效应和临床效果。方法:以NDVLaSota株制备活疫苗,以喷雾吸入途径接种于家兔,得到了安全、有效的结果之后,再以相同途径接种于放射治疗后的鼻咽癌患者,观察其安全性、免疫学效果和辅助治疗的临床效果。结果:该疫苗接种于实验动物和肿瘤患者的近期毒副发应都属轻微,未见严重肝肾功能损害;血清均可测出相应的抗体,其几何平均滴度随接种程序的推进而相应升高;鼻咽癌患者接种该疫苗之后,3年复发率低于对照组(4·00%vs26·00%),差异有统计学意义;5年复发率亦低于对照组(14·00%vs28·00%),但差异无统计学意义。结论:鸡新城疫病毒Ⅳ系活疫苗接种于实验动物(家兔)和人,都具有良好的安全性;都能产生明显的免疫学效应;用于放射治疗后的鼻咽癌患者,能明显减少其治疗后3年复发率;因而,适宜作为一种辅助治疗手段,在临床上推广应用。5年或更长期的效果,尚待研究。

单抗标记检测新城疫病毒免疫胶体金试纸条的研制

利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒标记单克隆抗体4E8,用兔抗鼠二抗喷洒在硝酸纤维素膜上作为对照线,用另一株单抗5E6作为检测线,制备成胶体金试纸条。用试纸条检测120份泄殖腔样品,结果与病毒增殖后HA法测得的结果符合率为95.8%,HA效价在1∶2以上,试纸条均能检测为阳性,与其他病毒的阳性血清没有交叉反应,且室温下可有效保存6个月。试纸条应用方便、快速,适合临床推广以及流行病学调查。

新城疫病毒和禽流感病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的制备

为了建立一种简便、快速而且能同时检测新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)的方法,本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,分别标记NDV单克隆抗体6C4和AIV单克隆抗体制备免疫检测探针。在硝酸纤维素膜上,用微定量喷头喷好2条病毒检测线(T线)和1条羊抗鼠抗体质控线(C线),制备复合型免疫层析检测试纸条。结果在10 min内,可同时检测出两种病毒。试纸条检测NDV的灵敏度比HA试验结果提高8倍;AIV重组抗原的检测灵敏度为1.7μg/mL。两种病毒互相测试,未出现交叉反应。用缓冲液对照测试结果为阴性。在密封、干燥、低温的条件下,试纸条的灵敏性与特异性没有明显变化。说明本研究建立的NDV和AIV免疫层析检测法具有特异、灵敏、稳定、操作简单等特点,符合现场快速检测的要求。

新城疫病毒F和HN蛋白的原核表达

目的:高水平表达新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)标准强毒F48E8株的F基因和HN基因。方法:利用PCR方法扩增出新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)标准强毒F48E8株的去掉N端信号肽和C端跨膜区的F基因和HN基因并将其克隆到原核表达载pET30a上,得到重组质粒rpET30a-NDV/F和rpET30a-NDV/HN,转化到受体菌Rosetta-gamiTM2感受态细胞中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测。结果:表达的F蛋白大小约为40kD,HN蛋白大小约为51kD左右,符合预期结果。Western blot分析表明,能与抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应。结论:重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达。说明了去除F和HN基因N端信号肽和C端跨膜区的必要性。

人工感染鸭源新城疫病毒对绍鸭β-防御素和细胞因子基因表达的影响

试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对绍鸭β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组(27只)和对照组(18只),攻毒组采用滴鼻点眼的途径(108.38 EID50)接种鸭源NDV强毒株(Md/CH/LGD/1/2005),对照组接种磷酸盐缓冲液。在攻毒后24和48h,从对照组及攻毒组各随机取6只鸭屠宰,分别采集肾脏、肺脏、气管、腺胃、骨髓、脾脏、盲肠扁桃体、哈德氏腺、法氏囊9个组织,运用实时荧光定量PCR法检测组织样品中9种AvBDs和细胞因子的表达量;剩余鸭每天持续观察,每隔4d采血1次,直至24d,检测血清抗体水平;于攻毒后24、48、72和120h采集咽喉及泄殖腔拭子,以确定排毒周期。结果表明,感染该NDV毒株后,鸭没有临床发病症状和死亡情况发生;感染后鸭排毒开始于攻毒后第1天,到第5天停止,在攻毒组咽喉及泄殖腔拭子中均检测到NDV。抗体水平检测结果显示,该NDV能够诱导鸭体内产生抗NDV特异抗体。实时荧光定量PCR结果发现,与对照组相比,感染后24h,部分鸭组织中AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD6、AvBD9和AvBD16表达量均显著升高(P<0.05);感染后48h,AvBD1和AvBD6在部分鸭组织中表达量均显著上调(P<0.05);感染后48h法氏囊中白细胞介素6(IL-6)和脾脏中干扰素γ(IFN-γ)的表达量明显低于感染后24h的表达量。综上所述,该鸭源NDV毒株感染可诱导绍鸭体内在早期产生天然免疫反应,这些反应可能与病毒在机体内复制有关。

鹅新城疫病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究拟建立一种能在基层实时、便捷诊断鹅新城疫病毒(goose Newcastle disease virus,GNDV)的检测方法。根据GenBank中公布的GNDVF基因的高度同源保守序列设计特异性引物,并在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂,建立可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,建立的方法能特异地检测出GNDV及NDV Lasota疫苗株,而小鹅瘟病毒(GPV)、禽流感病毒(AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)等其他病毒均为阴性。所建立的GNDV可视化RT-LAMP检测方法对RNA的最低检测限为10pg,反应过程不需PCR仪等复杂的仪器,50min即可完成反应,可经肉眼观察反应体系颜色判定结果。该方法特异性强、灵敏度高,且操作安全、简便、快捷,可满足基层筛查GNDV的需求。

新城疫病毒的分子生物学研究进展(综述)

新城疫病毒（ＮＤＶ）是重要的禽畜传染病原物之一，本文综述了该病毒的分子生物学研究进展，包括基因组分析、致病的分子基础和抗ＮＤＶ的基因工程疫苗研究，并对基因工程疫苗研究前景进行了讨论。

金线莲提取物体外抑菌及抑制鸡新城疫病毒在CEF上的增殖

采用滤纸片扩散法和二倍稀释法测定金线莲不同方法提取物对6种供试菌的体外抑菌效果,并利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定金线莲水提取物对NDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖的影响.结果表明:3种提取方法所获得的金线莲提取物均对链球菌有较强抑制作用,表现为高敏;对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌表现为中敏;对酵母菌和普通变形杆菌的抑制作用不明显,表现为低敏.最小抑菌浓度均不高于12.5 g.L-1.药物与病毒混合组对NDV的抑制率显著高于先病毒后药物组和先药物后病毒组(P<0.05).药物浓度与NDV抑制率存在明显的正相关(P<0.05).在先药物后病毒组和药物与病毒混合组中,15.62-31.25 g.L-1金线莲水提取物具有显著的抗NDV效果;1.95-3.90 g.L-1金线莲水提取物抗NDV效果不明显.

新城疫病毒HN基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法扩增新城疫病毒HN基因并将其克隆至T载体,测定其核苷酸序列。尔后用PCR扩增球状头部编码区,并将其克隆至pSOC质粒soc基因3'端EcoRⅠ位点,重组质粒pSOC-HN转化E.coliBL-21(DE3)感受态细胞,以终浓度1mmol/L的IPTG诱导表达,在SDS-PAGE凝胶上可检测到分子量约67KD的融合蛋白特异条带,west-blot证实表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性。

五味消毒饮加味体外抑菌和抑制新城疫病毒试验

为了解五味消毒饮及加味对临床分离致病菌的体外抑制作用及对新城疫病毒(NDV)在鸡胚内增殖的抑制作用,采用水煎醇沉法得到五味消毒饮及加味的供试水煎液,琼脂扩散法和试管倍比稀释法测定对11株分离菌的体外抑制作用;鸡胚法测定五味消毒饮加味对新城疫病毒(NDV)在鸡胚内增殖的抑制作用。结果表明,五味消毒饮对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、2株表皮葡萄球菌(奶牛)、绿脓杆菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌(奶牛)的最小杀菌质量浓度(MBC)分别为大于1、1、0.5、0.5(0.5)、0.5和1 g/mL,五味消毒饮加味的MBC分别为1、0.5、0.25、0.25(0.25)、0.5和1 g/mL;五味消毒饮加味0.2、0.1和0.05g/mL对NDV在鸡胚内增殖与对照组比较具有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01),药毒混合组>预防组>治疗组。五味消毒饮加味抑菌作用优于原方,并对NDV在鸡胚内增殖具有抑制作用。

免疫鸡群新城疫病毒的分离与分子鉴定

从免疫鸡群中分离到9株新城疫病毒（NDV），其中5株为强毒株，4株为中强毒株。用RT—PCR扩增F基因cDNA片段，并将其分别克隆到pGEM—Teasy载体中。序列分析结果表明，上述分离株F基因长度为1662bp，编码553个氨基酸，其F蛋白的氨基酸序列同源性为96．0％～99．8％；但与常见疫苗株的氨基酸同源性仅为87.6％～92.2％，F蛋白裂解位点序列为^112R-R-Q／R—K—R—FI—G^119,均属于基因Ⅶ型NDV。

禽肉产品中禽流感与新城疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持。【方法】根据Gen Bank已发表NDV的F基因序列(Gen Bank登录号JX840454)和APV的F基因序列(Gene Bank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性。【结果】优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(La Sota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现。二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA。应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致。随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(Gen Bank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(Gen Bank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%。【结论】针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持。