水苏碱调节Hippo-YAP信号通路对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用

目的探究水苏碱(stachydrine,STA)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠的神经保护作用,并分析其作用机制。方法将新生SD大鼠随机分为假手术组、HIBD组、STA低剂量(5 mg/kg)组、STA中剂量(10 mg/kg)组、STA高剂量(20 mg/kg)组、维替泊芬(10 mg/kg)+STA高剂量(20 mg/kg)组,除假手术组外,其余大鼠构建HIBD大鼠模型。对各组大鼠进行神经功能缺损评分,采用Morris水迷宫实验进行认知功能评价,测定各组大鼠脑含水量和脑指数,HE染色、尼氏染色观察脑组织神经元损伤,TUNEL染色观察脑组织神经元细胞凋亡情况,Western blot法检测YES相关蛋白(YES associated protein,YAP)、p-YAP、哺乳动物STE20样蛋白激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)、p-MST1、具有PDZ基序的转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)蛋白表达。结果与假手术组比较,HIBD组海马组织损伤加重,尼氏小体减少(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著增加(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著降低(P<0.05);与HIBD组相比,STA低、中、高剂量组海马组织损伤改善,尼氏小体增加(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著降低(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著增加(P<0.05);与STA高剂量组相比,维替泊芬+STA高剂量组海马组织损伤加重,尼氏小体减少(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著增加(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著降低(P<0.05)。结论STA可能通过调控Hippo-YAP信号通路、减少神经损伤和神经元细胞凋亡、改善神经功能,发挥对HIBD新生大鼠的神经保护作用。

常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

右美托咪定对依托咪酯麻醉新生大鼠海马PI3K/Akt信号通路的影响

目的研究右美托咪定在新生大鼠海马区域依托咪酯麻醉条件下对PI3K/Akt信号传导途径的影响。方法选取雄性SD大鼠80只,依据随机数字表法随机分为8组,每组10只,按照不同处理方式分别记作N组(生理盐水)、I组(脂肪乳剂)、D组(二甲基亚砜)、E组(依托咪脂60 mg/kg)、DE-1组(右美托咪定25μg/kg+依托咪脂60 mg/kg)、DE-2组(右美托咪定50μg/kg+依托咪脂60 mg/kg)、DE-3组(右美托咪定75μg/kg+依托咪脂60 mg/kg)、LY294002组(LY294002+右美托咪定75μg/kg+依托咪脂60 mg/kg)。于大鼠苏醒2 h后,每组取5只用透射电镜观察海马神经元的形态学变化,剩余5只采用Western blot法检测各组海马Akt和pAkt(ser473)蛋白含量。结果8组大鼠Akt蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。相较于E组、I组、D组,DE-1组、DE-2组、DE-3组和LY294002组pAkt(ser473)蛋白含量更低(P<0.05);与E组比较,DE-1组、DE-2组、DE-3组和LY294002组pAkt(ser473)蛋白含量更高于E组(P<0.05);与DE-3组比较,DE-1组、DE-2组、LY294002组pAkt(ser473)蛋白含量更低于DE-3组(P<0.05);LY294002组pAkt(ser473)蛋白含量高于DE-1组(P<0.05)。大鼠海马神经元细胞结构损伤随着右美托咪定剂量的增加而减轻。结论右美托咪定可能通过减轻对PI3K/Akt信号通路的抑制作用,来缓解依托咪酯对发育期大鼠海马神经元造成的损伤。

不同剂量人脐带间充质干细胞移植对新生大鼠脑白质损伤的修复作用

目的比较不同剂量人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)对新生大鼠脑白质损伤(white matter injury,WMI)的修复作用。方法将2日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为5组:假手术组、WMI组和hUC-MSCs组(低剂量组、中剂量组、高剂量组),每组24只。成功制备新生大鼠WMI模型24 h后,WMI组经侧脑室注射无菌PBS,hUC-MSCs组注射不同剂量hUC-MSCs。造模后14 d、21 d,采用苏木精-伊红染色法观察各组侧脑室周围组织病理变化,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组脑组织中髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mRNA表达水平,免疫组化法观察GFAP、神经元核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)在侧脑室周围组织表达水平;TUNEL染色观察各组侧脑室周围组织细胞凋亡情况。造模后21 d,采用Morris水迷宫实验观察各组新生大鼠的空间学习记忆能力。结果造模后14 d、21 d,WMI组和低剂量组侧脑室周围组织均可见大量细胞核固缩、核破裂,神经纤维排列紊乱,与WMI组比较,中、高剂量组上述病理改变均减轻;与高剂量组比较,中剂量组神经纤维排列相对整齐。与WMI组比较,低剂量组MBP、GFAP mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组MBP mRNA表达水平升高,GFAP mRNA表达水平降低;中剂量组MBP mRNA表达水平高于高剂量组,中剂量组GFAP mRNA表达水平低于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组GFAP、NeuN阳性表达差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组NeuN阳性表达升高,GFAP阳性表达降低(P<0.05);中剂量组NeuN阳性表达高于高剂量组,GFAP阳性表达低于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组凋亡细胞数差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组凋亡细胞数少于WMI组(P<0.05);中剂量组凋亡细胞数少于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组逃避潜伏期时间差异无统计学意义(P>0.05);自潜伏期第3天开始,中剂量组逃避潜伏期时间少于WMI组(P<0.05);中、高剂量组穿越平台次数多于WMI组(P<0.05)。结论低剂量hUC-MSCs对新生大鼠WMI修复效果欠佳,中、高剂量hUC-MSCs均有修复作用,中剂量效果更优。

褪黑素通过PI3K/AKT通路减轻缺氧缺血性脑损伤新生大鼠大脑皮层神经细胞自噬的研究

目的 观察褪黑素(melatonin,Mel)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠大脑皮层神经细胞自噬的影响,并从PI3K/AKT信号通路探讨其机制,为Mel的临床应用提供依据。方法 将7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组、HIBD组及Mel组(各组n=9)。采用经典RiceVannucci法构建新生大鼠HIBD模型。采用苏木精-伊红和尼氏染色法观察新生大鼠大脑皮层神经细胞形态;免疫荧光染色和Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)及Beclin-1蛋白表达水平;免疫组化和Western blot法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylated phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B,p-AKT)蛋白表达水平;通过Pearson相关性分析探讨Mel组与HIBD组自噬与PI3K通路的相关性。结果 建模后24h,假手术组新生大鼠大脑皮层神经细胞大小形态正常、排列规则,HIBD组神经细胞胞体肿胀、排列不规则,Mel组神经细胞排列较规整、形态相对正常。假手术组尼氏小体形态规整,HIBD组尼氏小体形态异常,Mel组尼氏小体形态尚规整。HIBD组LC3及Beclin-1平均荧光强度较假手术组增加,Mel组较HIBD组减少(P<0.05)。HIBD组p-PI3K^(+)、pAKT^(+)细胞数较假手术组减少,Mel组较HIBD组增加(P<0.05)。HIBD组LC3、Beclin-1蛋白表达水平较假手术组增加,p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平较假手术组减少(P<0.05);Mel组LC3、Beclin-1蛋白表达水平较HIBD组减少,p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平较HIBD组增加(P<0.05)。相关性分析显示,Mel组与HIBD组损伤侧大脑皮层LC3、Beclin-1蛋白平均荧光强度差值与p-PI3K^(+)、p-AKT^(+)细胞数差值均呈负相关(P<0.05)。结论 Mel可抑制HIBD新生大鼠大脑皮层神经细胞过度自噬,从而减轻HIBD,其机制与PI3K/AKT通路相关。

天麻素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞表型和晚期糖基化终末产物受体表达的影响

目的研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后反应性星形胶质细胞表型和晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达及天麻素(GAS)干预对其的影响。方法利用48只新生3 d的SD大鼠构建HIBD模型,随机分为假手术组(sham)、HIBD模型组(HIBD)及HIBD后GAS(100 mg/kg)干预组(HIBD+GAS)。Western blotting和免疫组织化学染色检测HIBD后1 d、3 d组缺血侧大脑胼胝体区A1型星形胶质细胞标志物C3、A2型星形胶质细胞标志物S100A10、RAGE、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、脑源性神经营养因子(BDNF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的表达。体外复制TNC-1细胞氧糖剥夺模型(OGD),随机分为对照组(Ctrl)、氧糖剥夺组(OGD)、氧糖剥夺后GAS干预(0.34 mmol/L)组(OGD+GAS)和单纯GAS组(GAS)。Western blotting和免疫荧光染色检测各实验组RAGE、TNF-α、BDNF和IGF-1的蛋白表达。结果与假手术组相比,HIBD后1、3 d缺血侧胼胝体区C3、S100A10、RAGE、TNF-α和IGF-1蛋白表达明显升高(P<0.05);1 d组BDNF蛋白表达降低,而3 d组表达升高(P<0.05)。GAS干预后1 d、3 d组C3、RAGE和TNF-α表达较HIBD组降低(P<0.05),而BDNF和IGF-1蛋白表达进一步升高(P<0.05);GAS干预后3 d组S100A10的表达较HIBD组升高(P<0.05)。且HIBD后1 d、3 d组C3、S100A10、RAGE的免疫组织化学检测结果与Western blotting结果一致。此外,在OGD激活的星形胶质细胞中RAGE、TNF-α表达显著升高(P<0.05),GAS干预后两者表达显著降低(P<0.05),而BDNF、IGF-1表达显著升高(P<0.05)。结论GAS可抑制HIBD后星形胶质细胞中RAGE信号的上调,抑制A1型星形胶质细胞和炎性因子的表达,促进A2型星形胶质细胞和营养因子的表达,发挥神经保护功能。

鸢尾素对新生大鼠高胆红素血症细胞凋亡的影响

目的:探究鸢尾素对新生大鼠高胆红素血症细胞凋亡的影响。方法:将96只新生SD大鼠随机分为对照组(N组)和模型组(M组),于7和10日龄腹腔注射胆红素溶液进行造模。造模成功后将M组随机分为T0组、T1组、T2组、T3组。T1、T2、T3组分别侧脑室注射40、60和80μg/kg的鸢尾素溶液,余各组注射等量磷酸盐缓冲液溶液。侧脑室注射24h后,神经行为学、苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)、原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,Tunel)检测海马区病理改变并统计凋亡率,Western Blot检测海马Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相对表达量。结果:侧脑室注射鸢尾素后。平面翻正反射:T3组所需时间少于T0、T1、T2组且多于N组(P<0.01);负趋地性反射:T3组所需时间少于T0、T1、T2组(P<0.01,P<0.05)。HE染色:M组海马神经细胞核固缩、裂解,排列紊乱。T1、T2、T3组细胞形态等不同程度改善。Tunel染色:M组Tunel+细胞增多,布满视野;N组Tunel+细胞少,呈零星分布;T3组凋亡率低于T0、T1组(P<0.05)。Western Blot:各组Bcl-2蛋白相对表达量无显著性意义(P>0.05);T0组Bax蛋白高于其余各组(P<0.05),T3组低于T1组(P<0.05);T0组Bcl-2/Bax值低于N、T3组(P<0.05),T1、T2组均低于T3组(P<0.05);T0组Caspase-3蛋白高于其余各组(P<0.05),N组低于T1组(P<0.05),T1组高于T3组(P<0.05)。结论:鸢尾素可能通过减少Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2/Bax值来减轻神经细胞凋亡且与鸢尾素注射剂量相关。

NF-κB信号通路在人脐带间充质干细胞移植对新生大鼠脑白质损伤修复中的作用

目的观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)移植对新生大鼠脑白质损伤(white matter injury,WMI)的修复作用,并通过小胶质细胞介导的核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路探讨其机制。方法将2日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组、WMI组和hUC-MSC组,每组18只。建模后14 d,通过苏木精-伊红染色法观察脑白质病理变化,免疫荧光染色法检测离子钙结合适配器分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)表达,免疫印迹法检测核因子κB抑制蛋白α(inhibitory subunit of nuclear factor-kappa B alpha,IκBα)、磷酸化IκBα(p-IκBα)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、神经元核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链反应法检测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、MBP、NeuN mRNA表达,免疫组化法检测MBP、NeuN蛋白表达水平;建模后28 d,利用Morris水迷宫实验评估大鼠空间认知能力。结果建模后14 d,假手术组脑白质区域组织结构完整,细胞形态正常、神经纤维排列规则;WMI组大量细胞变性坏死、神经纤维排列紊乱;hUC-MSC组细胞形态相对正常,神经纤维排列较整齐。WMI组Iba1阳性细胞占比、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达,以及TNF-α和IL-1βmRNA表达较假手术组增加,IκBα蛋白表达及MBP和NeuN阳性表达、蛋白和mRNA表达较假手术组减少(P<0.05);hUC-MSC组Iba1阳性细胞占比、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达,以及TNF-α、IL-1βmRNA表达较WMI组减少,IκBα蛋白表达及MBP和NeuN阳性表达、蛋白和mRNA表达较WMI组增加(P<0.05)。建模后28 d,水迷宫结果显示与假手术组比较,WMI组逃避潜伏期时间延长、穿越平台次数较减少(P<0.05);与WMI组比较,hUC-MSC组逃避潜伏期时间缩短、穿越平台次数增加(P<0.05)。结论hUC-MSC可修复新生大鼠WMI,促进少突胶质细胞成熟和神经元存活,其机制可能与抑制小胶质细胞介导的NF-κB信号通路激活相关。

2-甲氧基雌二醇对新生大鼠缺氧性肺动脉高压的保护作用

目的探讨2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME)在新生大鼠缺氧性肺动脉高压中的保护作用。方法96只Wistar新生大鼠随机分为常氧组、缺氧组和缺氧+2ME组,每组随机分为3 d、7 d、14 d、21 d亚组,每个亚组8只。缺氧组和缺氧+2ME组分别予以每日皮下注射生理盐水和2ME(剂量240μg/kg),常氧组在常氧环境下饲养,每日皮下注射生理盐水。直接测压法测量右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP);苏木精-伊红染色观察肺血管形态,计算肺血管重塑指标肺小动脉中层血管壁厚度占血管外径的百分比(MT%)和肺小动脉中层截面积占血管总截面积的百分比(MA%);免疫组化法检测肺组织中缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应检测HIF-1α、PCNA mRNA表达水平。结果与常氧组比较,缺氧3、7、14、21 d时缺氧组、缺氧+2ME组RVSP升高,HIF-1α、PCNA蛋白和mRNA表达水平上调(P<0.05),缺氧7、14、21 d时缺氧组MT%、MA%增加(P<0.05);与缺氧组比较,缺氧3、7、14、21 d时缺氧+2ME组RVSP降低,HIF-1α、PCNA蛋白和PCNA mRNA表达水平下调(P<0.05),缺氧7、14、21 d时缺氧+2ME组MT%、MA%减少(P<0.05)。结论2ME可能通过抑制HIF-1α、PCNA表达,减轻肺血管重塑,对新生大鼠缺氧性肺动脉高压发挥保护作用。

五味子乙素对缺氧缺血新生大鼠的脑保护作用及机制

目的研究五味子乙素(Sch B)对缺氧缺血新生大鼠的脑保护作用。方法SD新生大鼠48只随机均分为假手术组、模型组、Sch B组(Sch B,55.4 mg/kg)及3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(自噬抑制剂3-MA,10 mg/kg),后3组大鼠采用结扎左侧颈总动脉建立缺氧缺血新生大鼠模型,后两组大鼠在造模同时灌胃或注射相应药物、假手术组和模型组灌胃生理盐水,共7 d;采用Longa分级法对各组大鼠进行神经功能缺失评分,HE染色检测各组大鼠海马神经元组织学变化,免疫荧光染色检测脑组织线粒体形态,免疫印迹实验检测脑组织自噬蛋白(Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)及PINK1、Parkin蛋白表达,试剂盒测定各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠海马神经元萎缩、变性,数量减少,出现严重病理损伤,脑神经细胞线粒体长度、脑组织SOD水平明显降低(P<0.05),MDA水平、神经功能缺失评分及脑组织Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,Sch B组大鼠脑海马神经元损伤减轻,脑神经细胞线粒体长度、脑组织SOD水平、脑组织自噬蛋白(Beclin-1、LC3II/LC3I)及PINK1、Parkin蛋白表达水平升高(P<0.05),MDA水平、神经功能缺失评分降低(P<0.05);3-MA组大鼠海马神经元损伤加重,脑神经细胞线粒体长度、脑组织SOD水平、脑组织Beclin-1、LC3II/LC3I及PINK1、Parkin蛋白表达水平降低(P<0.05),MDA水平、神经功能缺失评分升高(P<0.05)。结论Sch B降低缺氧缺血大鼠神经功能缺损症状,其机制可能与抑制大鼠脑组织氧化应激、促进线粒体自噬作用有关。

藁本内酯抑制缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织凋亡相关蛋白的表达

目的:通过检测体内外缺氧缺血条件下NOD样受体蛋白3(NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、GSDMD-N蛋白水平评价藁本内酯(LGSL)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠的神经保护作用。方法:选取7日龄SD雄性大鼠随机分为假手术组(Sham组)、HIBD组和LGSL组各10只,采用左颈总动脉双重结扎构建HIBD模型,体外建立小胶质细胞氧糖剥夺(OGD)模型(OGD/R)。采用CCK-8评估不同浓度LGSL干预24 h对OGD/R小胶质细胞活力的影响;通过免疫印迹评估20μM LGSL对体内外缺氧缺血条件下NLRP3、Caspase1、IL-1β、GSDMD-N表达的影响。结果:在体内外模型中,NLRP3、IL-1β、Caspase1及GSDMD-N表达均上调(P<0.05);20μM LGSL干预24 h后,NLRP3、IL-1β、Caspase1及GSDMD-N表达均下调(P<0.05)。结论:LGSL可以显著抑制新生大鼠体内外因缺氧缺血引起的神经炎症反应。

大黄素对脂多糖诱导的新生大鼠急性肺损伤的保护作用

目的 探索大黄素对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的新生大鼠急性肺损伤的保护作用。方法 新生大鼠腹腔注射LPS制作建立急性肺损伤模型,每天腹腔注射不同剂量大黄素(emodin, EMD),连续治疗7 d,对照组腹腔注射等体积生理盐水。通过HE、Masson染色进行组织病理学检测,免疫组织化学检测肺组织平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平,原位末端标记法(TUNEL)检测肺组织细胞凋亡水平,Western Blot检测肺组织Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)、裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cleaved Caspase 3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达水平。结果 脂多糖使大鼠肺损伤评分、肺纤维化程度、α-SMA平均光密度、TUNEL阳性率、Collagen I、Collagen Ⅲ、cleaved Caspase3、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平较对照组显著增加,大黄素处理能剂量依赖性抑制脂多糖引起的上述变化。结论 大黄素对LPS诱导的新生大鼠急性肺损伤具有保护作用。

基于Nrf2/Gpx4通路研究右美托咪定对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠铁死亡及神经功能的影响

目的基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)信号通路,研究右美托咪定(DEX)对缺血缺氧性脑损伤(HIBD)新生大鼠铁死亡及神经功能的影响。方法构建HIBD新生大鼠模型,随机分为模型组、DEX(100μg/kg)组、DEX(100μg/kg)+抑制剂(Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇2 mg/kg)组,每组12只,另取12只新生大鼠作为对照组。对照组和模型组腹腔注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。大鼠神经功能缺损程度评分(NDS)评价大鼠神经功能;氨基酸自动分析仪检测海马组织中谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)水平;尼氏(Nissl)染色检测海马区神经元形态;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测海马组织中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量;试剂盒检测海马组织丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、铁含量;蛋白免疫印迹检测海马组织中Nrf2、HO-1、Gpx4、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(xCT)表达情况。结果与对照组比较,模型组海马区神经元形态异常,腹侧神经元轴突长短不一且排布不整齐,部分神经元呈背侧脱离趋势,NDS评分、海马组织中Glu、IL-6、TNF-α、NSE、MDA、铁含量升高(P<0.05),GABA、GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT蛋白水平降低(P<0.05);与模型组比较,DEX组海马区神经元形态相对饱满,腹侧神经元轴突较整齐,NDS评分、海马组织中Glu、IL-6、TNF-α、NSE、MDA、铁含量降低(P<0.05),GABA、GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT蛋白水平升高(P<0.05);Nrf2抑制剂可减轻DEX对HIBD新生大鼠神经损伤的改善作用(P<0.05)。结论DEX能够激活Nrf2/Gpx4通路,抑制铁死亡,改善HIBD新生大鼠神经损伤。

血管紧张素Ⅳ类似物益智二肽保护丙泊酚重复麻醉新生大鼠的学习记忆能力

目的探讨血管紧张素Ⅳ类似物益智二肽(Dihexa)预给药对丙泊酚重复麻醉的新生大鼠学习记忆能力的影响及其机制。方法7日龄SD大鼠78只(体质量12~20 g),随机均分为对照组、丙泊酚重复暴露组及Dihexa+丙泊酚重复暴露组;对照组腹腔注射生理盐水(7.5 mL/kg),丙泊酚重复暴露组腹腔注射丙泊酚(75 mg/kg),Dihexa+丙泊酚重复暴露组腹腔注射Dihexa(0.5 mg/kg),25 min后给予丙泊酚(75 mg/kg)腹腔注射,造模持续5 d;末次给药后24 h,部分大鼠断颈处死取脑组织,采用ELISA法检测大鼠海马组织血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,Western Blot法检测海马突触素(SYP)和突触后致密蛋白95(PSD95)的表达,高尔基染色法观察树突棘密度;每组取8只大鼠30日龄行莫里斯(Morris)水迷宫实验评价空间学习记忆能力。结果与对照组比较,丙泊酚重复暴露组2~5 d逃避潜伏期增加,穿越平台次数减少,目标象限停留时间缩短,海马组织AngⅣ含量减少,IL-1β、TNF-α的含量增加,PSD95、SYP蛋白表达降低,海马CA1区树突棘密度减少,差异有统计学意义(P<0.05);与丙泊酚重复暴露组比较,Dihexa+丙泊酚重复暴露组2~5 d逃避潜伏期减短,穿越平台次数增多,目标象限停留时间更长,海马组织AngⅣ含量增加,IL-1β、TNF-α的含量减少,PSD95、SYP蛋白表达升高,海马CA1区树突棘密度增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Dihexa预处理可抑制丙泊酚重复麻醉新生大鼠诱导的海马炎症反应和突触可塑性损害,保护大鼠学习记忆能力。

新生大鼠海马神经元原代培养方法的研究

目的 :研究和比较 3种不同培养神经元的方法 ,提供一种纯化效率和存活率均较高的培养技术。方法 :取新生SD大鼠的海马区 ,应用一般培养法、加阿糖胞苷法、加阿糖胞苷和神经生长因子法培养神经元 ,观察神经元的形态。用倒置显微镜观察和MTT比色分析检测神经元的存活率。用ABC免疫组化染色法 ,比较 3种不同培养方法在不同培养时间所获得神经元的纯度。结果 :加阿糖胞苷和神经生长因子培养组神经元生长良好 ,纯度和存活率均较高。结论 :加阿糖胞苷和神经生长因子培养神经元的方法具有简便可行 ,易于生长的优点 。

茯苓水提液对叠氮钠致原代培养的新生大鼠海马神经细胞线粒体损伤的影响

目的 从生化和形态学的角度观察茯苓水提液对叠氮钠致原代培养的新生大鼠海马神经细胞线粒体损伤的影响。方法 新生大鼠海马神经细胞原代培养至第 11天 ,吸弃培养液 ,加入MTT(0 .4mg·mL-1)温育 4h ,用自动酶标仪在 5 5 0nm处检测被神经细胞线粒体酶还原的MTT的量 ,以此作为评价细胞活力的指标。通过间接免疫荧光 (一抗为鼠抗α tubulin抗体 )的方法 ,利用激光扫描共聚焦显微镜观察来评价神经细胞骨架改变。结果 叠氮钠与培养细胞孵育能剂量依赖性地损伤细胞 ,6 4mmol·L-1孵育 4h时 ,细胞的线粒体酶还原MTT的能力为对照组的 (6 0 .73± 5 .13) % ,微管结构模糊、紊乱。茯苓水提液 (10～2 0mg·mL-1)与细胞预孵育 2 4h ,能明显抵抗叠氮钠引起的神经细胞线粒体还原MTT的能力下降 ,微管结构紊乱。结论 茯苓对维持神经细胞线粒体的功能及微管结构方面有重要作用 ,对防治某些神经退行性疾病如老年性痴呆、血管性痴呆及帕金森氏病等 。

高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞和髓鞘的保护作用

目的以前的研究已经证实高压氧(HBO)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)有保护作用,但其确切机制尚不清楚。该研究从HBO对内源性神经干细胞(NSCs)和髓鞘的影响来探讨HBO保护作用的机制。方法7日龄SpragueDawley新生大鼠随机分为4组:正常对照组、HIBD组、高压空气治疗组(HBA)和高压氧治疗组(HBO)。HBA组和HBO组于缺氧缺血后1h内分别行HBA和HBO处理,每日1次连续7d。BrdU免疫组化检测在体内源性神经干细胞(NSCs)。Westernblot测定nestin的表达。髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫组化检测髓鞘损伤。结果HIBD后3周,HIBD组缺血侧的室管膜下(SVZ)区和海马齿状回(DG)BrdU阳性细胞数目明显少于正常对照组(均P<0.01),HBO组SVZ区BrdU阳性细胞增多不明显,但DG区BrdU阳性细胞明显增多,与HIBD组比较差异有显著性意义(P<0.05)。HIBD组nestin表达较正常对照组下降,HBO组表达增加,HBA组增加不明显。HIBD后1周,HIBD组MBP免疫组化损伤评分增加,HBO组与HBA组损伤评分均有减轻,HBO组与HIBD组比较差异有显著性(P<0.01),但与HBA组比较差异无显著性(P>0.05)。结论HBO可减少新生大鼠HIBD后内源性NSCs的死亡和减轻髓鞘损伤,这可能是HBO的保护作用机制之一。

高压氧促HIBD新生大鼠内源性神经干细胞增殖过程中Wnt-3蛋白的变化

目的近年来的研究已经证实高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)能够促进缺氧缺血性脑损伤(Hy-poxic ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠内源性神经干细胞(Neuralstem cells,NSCs)的增殖,并且发现Wnt信号途径参与神经干细胞的增殖,故本课题将探讨HBO对HIBD新生大鼠脑内源性NSCs增殖分化过程中Wnt-3蛋白的变化的影响及其它们之间的相关性。方法7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为正常对照组(CON),缺氧缺血性脑损伤组(HIBD)及高压氧组(HBO)。采用经典的Rice法制成HIBD模型,HBO组在HIBD后3h内进行HBO治疗(压力为2个绝对大气压,稳压1h,每日1次,连续7d)。采用BrdU/nestin,Wnt-3/nestin免疫荧光双标法,检测HIBD后6h,24h,3d,7d,14d,缺血侧侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)增殖的NSCs及Wnt-3蛋白的动态变化,激光共聚焦显微镜(LSM510,Zeiss)分析细胞内nestin蛋白与Wnt-3蛋白的荧光强度,统计学分析二者相关性。Western blotting法检测缺血侧大脑半球nestin、Wnt-3总蛋白的动态变化。结果SVZ区BrdU+nestin+细胞于HBO治疗后3h开始增加,7d达最高水平,显著高于CON组与HIBD组(P<0.01),14d时BrdU+nestin+细胞数开始下降,但仍多于CON和HIBD两组(P<0.05);NSCs细胞膜表面Wnt-3蛋白于HBO治疗后3h开始增加,3d时达最高水平,并维持较高水平至14d时开始下降;直线回归分析示细胞内Wnt-3蛋白与nestin蛋白呈直线相关(r=0.893,P<0.05);Western blotting分析示缺血侧大脑半球Wnt-3蛋白于HBO后3d,7d一直维持较高水平,显著高于其他各时间点(P<0.05),至14d时表达开始下降;nestin总蛋白水平于HBO治疗后21h开始增加(P<0.05),7d达最高水平,后下降。结论高压氧可以促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖,其机制与Wnt信号活化有关。[中国当代儿科杂志,2007,9(3):241-246]

苦参碱对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的 :研究苦参碱 (matrine)对血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )诱导新生大鼠心肌成纤维细胞 (cardialfibroblasts,CFb)增殖和胶原合成的影响 ,探讨其抑制心肌纤维化的机制。方法 :建立AngⅡ诱导新生大鼠CFb纤维化模型 ,采用MTT法检测Mat对CFb增殖的影响 ;羟脯氨酸测定检测CFB胶原合成量 ;RT PCR检测Mat作用下CFb的Ⅰ型胶原、间质胶原酶 (MMP 13)、组织金属白酶抑制因子 1(TIMP 1)、TGFβ 1的基因表达情况。结果 :①在一定范围内 ,苦参碱以浓度依赖性方式抑制AngⅡ诱导CFb的增殖和胶原合成 (P <0 .0 1) ,②苦参碱可以降低Ⅰ型胶原和TGFβ 1基因mRNA表达 ,③苦参碱可以提高MMP 13基因mRNA表达。结论 :苦参碱通过抑制AngⅡ诱导的CFb增殖和胶原合成增加 。

神经节苷脂对脑缺氧缺血后新生大鼠海马CA_1区N-甲基-D-天门冬氨酸受体表达的影响

目的 研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后海马区N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)及NMDARmRNA表达的变化和神经节苷脂(GM1)对其的影响。方法 建立HIBD模型。用免疫组化及原位杂交方法检测缺氧缺血(HI)和GM1干预后不同时间点NMDA受体I型亚单位(NR1)阳性细胞及NR1mRNA阳性细胞的表达。结果 HI后新生大鼠海马CA1区NR1及NR1mRNA表达增强,GM1可使其受体表达下调(P<0.05)。结论 GM1可使新生大鼠海马CA1区NR1及NR1mRNA表达下调,对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有保护作用。