旋毛虫新生幼虫期特异性T668全长cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA片段 T6 6 8- SS2作为核酸探针 ,在新生幼虫 c DNA文库中筛选出 10个阳性克隆。序列测定及分子生物学软件分析表明 ,克隆 G10 - 6的 c DNA片段全长 16 0 0 bp,含 12 90 bp的开放阅读框架 ,编码 1个由 4 30个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量理论推导值为 4 6 84 0 ,等电点 (PI)为 9.6 5。主导氨基酸为Ser(11.39% )和 Thr(10 .93% )。开放阅读框架中具有丝氨酸蛋白酶保守功能区及酶活性位点结构 ,其 N末端的信号肽及 2个糖基化位点表明 ,其为分泌性糖蛋白 ,预示其可能在细胞外起着重要作用。DNA同源性分析表明 ,该 c DNA为一新的 c DNA分子。

旋毛虫新生幼虫期特异性T668 cDNA在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的对旋毛虫新生幼虫期特异性T668cDNA进行表达及鉴定,以获得基因工程抗原。方法应用PCR技术,从pBK CMV T668重组质粒中扩增到不含信号肽序列的T668cDNA片段,将目的基因克隆于原核表达载体pET28a(+),构建pETT668重组质粒,再将其转化到E.coli表达菌株DE3感受态细胞中,经IPTG诱导表达,以SDS PAGE鉴定表达产物。结果pETT668表达蛋白的分子质量单位为49ku,且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加,诱导5h时表达量达到高峰;薄层扫描结果显示,目的蛋白占菌体总蛋白的34.6%。Western blotting检测显示,表达蛋白可被感染旋毛虫家猪血清所识别。结论旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在大肠埃希菌中获得高效表达,且表达蛋白具有良好的抗原性。

旋毛虫新生幼虫期特异性T_(314)全长cDNA的克隆及表达

利用 PCR将旋毛虫新生幼虫期特异性全长 T31 4c DNA的信号肽祛除后重组到原核表达载体 p ET- 2 8a。将重组质粒 p ET2 8- T31 4转入克隆菌 DH5α和表达菌 DE3,分别提取质粒进行酶切、测序鉴定。用 IPTG诱导培养重组表达菌DE3,做菌体裂解物外源基因表达产物的 SDS- PAGE分析。将重组质粒表达的融合蛋白免疫家兔制备抗血清 ,采用Western blot检测 T31 4c DNA在旋毛虫不同发育时期的表达情况及其天然表达产物的相对分子质量。测序结果显示 :外源 T31 4c DNA的 PCR产物在重组质粒 p ET2 8- T31 4中阅读框架正确 ;SDS- PAGE分析结果显示 :经 IPTG诱导后转化菌 DE3的裂解产物与对照菌相比出现了 1条相对分子质量约为 390 0 0的新条带 ,大小与外源 c DNA融合蛋白的理论推导值 3880 0相符 ;Western blot检测结果显示 :T31 4c DNA的天然表达产物仅存在旋毛虫新生幼虫 ,不存在于成虫与肌幼虫 ,且相对分子质量大小与其在原核重组质粒中表达产物相同。

旋毛虫新生幼虫期特异性基因糖蛋白表达载体的构建

根据旋毛虫新生幼虫 (NBL)期特异性全长cDNASSC1基因序列 ,PCR扩增目的基因 ,克隆入pMD18T后 ,根据其读码框架 ,克隆入表达载体pET2 8b ,构建其原核表达载体pET2 8b -SSC1。分别用SalI和XhoI、SmaI和HindIII双酶切 ;XbaI单酶切鉴定重组子 ,结果均与预期相符 ,进一步测序结果也表明重组载体读码框架正确 。

旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库的构建及其初步筛选

利用差减杂交 (减法杂交 ,subtractive hybridization)技术 ,以旋毛虫新生幼虫 ( newborn larvae,NBL)的 c DNA作为试验方 ( tester) ,以肌幼虫 +成虫的 c DNA作为驱动方 ( driver) ,制备新生幼虫差减 c DNA;利用 T载体构建 NBL差减 c DNA文库 ,获克隆株 90个。以试验方的差减 c DNA第 2次 PCR产物 +未差减c DNA为试验方探针 ,以驱动方的差减 c DNA第 2次 PCR产物 +未差减 c DNA为驱动方探针 ,在 NBL差减c DNA文库中初筛 NBL的期特异性克隆 ,获初筛克隆 2 4个。这些初筛期特异性克隆进一步用 Southern blot确认鉴定 ,获真阳性期特异性克隆 2个 ( NBL SSC1 ,NBL SSC2 )。DNASIS以及 Blaster的分析结果显示 ,这2个克隆为旋毛虫的 2个新基因 ,其中 NBL SSC1编码糖蛋白 ,NBL SSC2编码丝氨酸蛋白酶。本试验为旋毛虫期特异性基因全长序列的调取、分析。

旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的结构与功能分析

目的 :运用生物信息学原理 ,对由旋毛虫新生幼虫 (NBL)差减文库调取的新生幼虫期特异性基因进行分析。方法 :通过对BLASTn核酸数据库及BLASTp蛋白数据库的相似性检索 ,登陆PROSITE数据库进行蛋白位点和序列模式分析 ,并采用AN THEPROT 4 3软件包对其理化特性进行分析。结果 :相似性检索及序列模式分析显示 ,该基因为胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的编码基因 ,并对其编码蛋白的理化特性 ,疏水性、抗原性、信号肽及其二级结构进行了预测。登陆SWISS -MODEL自动蛋白质同源模建服务器 ,搜索、优化后预测了其 3D结构模型。结论 :该期特异性基因为旋毛虫新生幼虫胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的编码基因。

以重组蛋白为抗原的ELISA法检测旋毛虫抗体

目的寻求特异性强、敏感性高的旋毛虫病诊断抗原。方法以旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在E.coli高效表达的重组蛋白为抗原,分别以兔、猪和健康者血清及旋毛虫病阳性血清为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、山羊抗猪IgG和山羊抗人IgG为二抗,建立检测旋毛虫抗体的间接ELISA方法,并以旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(ES)抗原作为检测对照。结果以T668重组蛋白为抗原,对兔、猪和人旋毛虫病血清进行检测,阳性检出率为100%,且敏感性高(0.016μg/孔),与ES抗原检测结果完全一致。结论T668重组抗原有望替代ES抗原检测旋毛虫抗体。