MLMT与MLST在新生隐球菌基因分型中的应用研究

目的 探讨多位点微卫星灶分型(MLMT)和多位点序列分型(MLST)在新生隐球菌(C.neoformans)基因分型中的应用。方法 提取22株来源于国内及日本已明确为新生隐球菌的菌株DNA,经MLMT及MLST相应位点的引物进行扩增、测序;计算各微卫星灶(CNG1、CNG2及CNG3)序列中简单重复序列的重复数,确定菌株MLMT的基因型;将本研究菌株的MLST中各位点序列和网上数据库相应序列进行对比,获取该菌株的MLST基因型;比较两种方法在分型中分辨能力。结果 在22株菌中,有16株的基因型为MLMT17/MLST5(16/22,72.73%),MLMT将所有菌株分为7型,而MLST分为4型;根据MLST分型,MLMT17、16、34及39的菌株为MLST5;MLMT2、14、29相对应MLST66、32及31;两种方法的分型分辨能力比较,差异无统计学意义(P=0.488)。结论 MLMT-17/MLST 5是我国和日本的新生隐球菌常见基因型,包含CNG1、CNG2及CNG3位点的MLMT可作为MLST的替代或补充。

新生隐球菌感染与细胞因子的相互关系

新生隐球菌是重要的条件致病真菌,可导致免疫抑制患者产生致命的新生隐球菌性脑膜炎;继而在脑部损伤部位有多种细胞因子的表达和炎症细胞的浸润,形成了一个细胞因子网络,介导一系列致病机制和防御机制的产生.为明确细胞因子与新生隐球菌在致病和防御过程中的相互作用,本文就新生隐球菌与细胞因子的关系进行综述.

新生隐球菌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶活性检测

目的:测定不同孵育条件、来源和血清型的新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性。方法:30℃和37℃下用含有偶氮白蛋白的琼脂培养板培养不同来源及血清型的36株新生隐球菌菌株,测量其产生的廓清晕环的大小,计算CH值[菌落半径/(菌落半径+廓清晕环半径)]来比较其胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性强弱;用丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂观察两种酶活性改变;酶谱法观察菌株浓缩上清液中胞外蛋白水解酶活性和相对分子质量。结果:36株菌株在30℃和37℃培养条件下它们的平均CH值分别为0.558±0.170和0.575±0.169,两者间无显著差异;血清A(n=13)、B(n=13)、D/AD(n=6)型菌株各自的平均CH值分别为0.564±0.144、0.515±0.078和0.482±0.072,各组间无显著差异;临床分离株(n=23)、环境分离株(n=9)和荚膜缺陷株(n=4)各自的平均CH值分别为0.570±0.177、0.513±0.069和0.942±0.075(P<0.05)。对照组(不含抑肽酶)和抑肽酶不同浓度组(1.2、1.6 mU)的平均CH值分别为0.459±0.188,0.975±0.287、0.733±0.252(P<0.01)。菌株浓缩液中含有复杂的胞外蛋白酶类成分。结论:新生隐球菌胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性在30℃、37℃下无显著差异;在临床分离株中比环境分离株和荚膜缺陷株强;在不同血清型菌株间无显著差别;可被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制。

新生隐球菌的磷脂酶活力检测

目的 :评价不同孵育条件、来源和血清型的新生隐球菌分泌磷脂酶的活力情况。方法 :分别在 30℃和 37℃下用蛋黄平板法培养不同来源的 4 0株新生隐球菌菌株 ,测量其产生沉淀圈的大小 ,计算 PZ值来比较其磷脂酶活力的不同。 结果 :4 0株菌中有 39株能在其菌落周围产生明显沉淀圈 ,PZ值在 30℃和 37℃培养条件下分别为 (0 .5 2 9± 0 .12 1)和 (0 .5 2 3± 0 .14 3) ,两者差异无统计学意义 (P>0 .0 5 ) ;在 37℃培养条件下 ,血清 A、B、AD和 D型菌株的 PZ值分别为 (0 .5 4 1± 0 .116 )、(0 .5 18± 0 .0 36 )和 (0 .4 72± 0 .0 5 1) ,3组间差异均无统计学意义 (P>0 .0 5 ) ;临床株和环境株 PZ值分别为 (0 .5 0 1± 0 .0 4 9)和 (0 .5 6 5± 0 .131) ,差异有显著性意义 (P<0 .0 5 )。结论 :温度对新生隐球菌磷脂酶活力没有影响 ;不同来源的新生隐球菌菌株的磷脂酶活力差异较大 ,其中临床分离株比环境分离株磷脂酶活力强 ;而不同血清型菌株的磷脂酶活力无差别。

新生隐球菌致头皮和颅骨损害1例报道

目的隐球菌病是由新生隐球菌引起的人和动物的播散性感染,最常累及肺及中枢神经系统,文中报道1例新生隐球菌致头皮和颅骨损害。方法全面临床检查排除其他疾病,患者皮损进行组织病理学检查并对皮损处分泌物进行真菌培养和形态学鉴定,分离菌株进行rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)测序鉴定,对分离菌株进行抗真菌药物体外药敏试验和致病性检查。结果患者头部CT示颅骨破坏,头皮肿胀。皮损病理示:肉芽肿性炎,并可见球形病原体,特殊染色示PAS(+)、PAM(+)、阿新兰染色阳性。分泌物墨染涂片显微镜下见圆形菌体,沙堡培养基25℃培养出乳白色菌落,表面光滑湿润。科玛嘉平皿划线培养菌落呈淡紫红色。根据真菌形态学特点和基因序列结果鉴定为新生隐球菌。体外药敏试验显示该菌对伏立康唑、伊曲康唑敏感。致病性研究显示对小鼠具有致病性且呈播散性。结论该病例为国内首报的由新生隐球菌所致的头皮和颅骨损害。

小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染的实验研究

目的：建立原发性小鼠新生隐球菌皮肤感染模型，探讨免疫抑制状态在小鼠皮肤隐球菌感染形成中的作用。方法：24只BALB／c小鼠，随机均分为免疫抑制组（腹腔注射200mg／kg的环磷酰胺）和未抑制组。将新生隐球菌标准野生株B3501分别以5×10^7／ml皮内接种于两组小鼠，观察病程，记录皮损形成与消退时间，并进行皮损组织真菌培养与病理检查。结果：两组小鼠均于接种菌悬液后2～9d[免疫抑制组（3．42±1．17）d、未抑制组（4．25±1．42）d]产生了结节、丘疹、溃疡、传染性软疣样皮损，并均于接种后22～44d[免疫抑制组（36．75±4．20）d、未抑制组（29．00±4．75）d]自愈。免疫抑制组小鼠皮损形成时间与未抑制组无显著性差异，而消退时间晚于未抑制组（P〈0．05）。皮损组织真菌培养与病理检查均确证为隐球菌感染。结论：BALB／c小鼠皮下接种隐球菌后发生原发性皮肤感染，可以作为研究本病的动物模型。免疫抑制可能并不是原发性皮肤隐球菌感染的易感因素。

原发性新生隐球菌肺炎的诊断和治疗随访研究

目的报道2例原发性新生隐球菌肺炎病例的临床、病理和影像学表现,以及伊曲康唑序贯治疗的转归。方法应用胸部CT检查发现病变,经皮肺活检获得病理组织,经纤维支气管镜微量支气管肺泡灌洗法获得病原学,采用伊曲康唑序贯治疗,CT随访观察,直到肺部阴影完全消失。结果1例无临床症状,健康体检摄胸片发现多发结节状阴影,边缘锐利,呈肿块样改变。另1例因发热、咳嗽及呼吸困难入院,胸片呈多发性大片状阴影。2例患者的脑脊液真菌培养阴性,肾脏B超和CT检查均无阳性发现。肺脏病理穿刺检查找到病原菌,苏木精-伊红(HE)、六胺银和PAS染色确诊为隐球菌肺炎,经纤维支气管镜微量支气管肺泡灌洗标本培养、分离及鉴定诊断为新生隐球菌,且在其中1例患者的工作环境中分离得到新生隐球菌。伊曲康唑静脉注射2周,序贯口服3个月不等,肺部阴影完全消失,随访2年无复发。结论健康人吸入新生隐球菌后可发生肺炎。临床表现呈多样性,可无任何症状,仅胸部影像学表现为多发结节阴影,须与肺癌鉴别;迅速进展者表现为发热、咳嗽及呼吸困难,肺部阴影表现类似细菌性肺炎,呈多发性片状阴影,可有月晕症。伊曲康唑序贯治疗效果良好。

对两种新生隐球菌选择性培养基的比较研究

比较鸟籽琼脂 (GASA ,Guizotiaabyssinicaseedagar)和咖啡酸玉米琼脂 (CACA ,Caffeicacidcommealagar)对新生变种和格特变种的培养效果 ,再同时用两种培养基分离鸽粪和澳洲赤桉标本中的新生隐球菌。结果表明 ,CACA对新生隐球菌的培养和选择性分离效果与GASA相同 。

细胞芯片检测新生隐球菌菌株丝氨酸蛋白酶的表达

目的:利用细胞芯片技术检测新生隐球菌菌株中丝氨酸蛋白酶的表达,初步探讨丝氨酸蛋白酶在新生隐球菌致病过程中的作用。方法:不同来源和血清型的新生隐球菌菌株36株,应用组织芯片构建仪制备菌株芯片,利用菌株细胞芯片和免疫组化技术对菌株中丝氨酸蛋白酶的表达情况进行检测。结果:丝氨酸蛋白酶在所有菌株细胞中强阳性表达率为67.0%(25/36),强阳性表达率在血清A型、血清B型、血清D/AD型分别为46.2%(6/13)、92.3%(12/13)、66.7%(4/6),在环境分离株、临床分离株及荚膜缺陷株中分别为55.6%(5/9)、82.6%(19/23)、25%(1/4)。不同血清型及不同来源菌株中,以血清B型、临床分离株中的丝氨酸蛋白酶阳性表达率高(P<0.05)。结论:菌株细胞芯片是检测致病性真菌样本成分的新技术;致病力强的新生隐球菌临床分离株中的丝氨酸蛋白酶表达最高,提示丝氨酸蛋白酶在临床菌株致病过程中起到主要作用。

新生隐球菌生态学研究

目的:研究中国环境中新生隐球菌变种的生态学特点。方法:采集10个城市(3组)鸽粪标本620份和江西贵溪地区澳洲赤桉标本819份;采用咖啡酯玉米山梨醇琼脂(CACA)培养基分离新生隐球菌,并对菌株进行CGB培养,酚氧化酶、尿素酶、血清型、交配型试验和形态学观察。结果:①不同纬度地区鸽群的新生隐球菌标本阳性率为G1[40°～50°北纬(N)]13%,G2(30°～40°N)50%,G3(20°～30°N)29%,G2显著高于G1(P<0.01);3组鸽群阳性率基本相同(P>0.05),平均为81%。②环境分离358株全部37℃生长、酚氧化酶阳性、CGB培养阴性;1株尿素酶阴性;其中101株均为α交配型和A血清型,提示全部为grubii变种;发现环境分离菌株荚膜变异并与其他真菌的自然黏附现象。③从江西贵溪生长的澳洲赤桉未分离到新生隐球菌格特变种。结论:中国环境中以grubii变种为主的新生隐球菌的生态学特点与其所在的地区纬度明显相关;由澳洲赤桉分离新生隐球菌格特变种的研究仍然需要继续进行。

北京昌平区鸽粪中新生隐球菌的分离鉴定及其血清型、配型分析

目的了解鸽粪中新生隐球菌的携带率及其血清型、配型。方法在北京昌平区收集家养鸽粪便标本,利用沙包培养基、尿素培养基、多巴培养基和CGB培养基对鸽粪中的新生隐球菌进行分离鉴定。PCR扩增ITS基因进行分子生物学鉴定,并通过特异性引物PCR扩增,分析其血清型和配型。结果 143份鸽粪标本中共分离得到6株新生隐球菌,分离阳性率为4.87%,其血清型均为A型,其中3株为α配型,3株为a配型。结论在北京昌平区家养鸽携带新生隐球菌的阳性率为4.87%,其血清型均为A型。

新生隐球菌临床分离株热休克反应的差别及其临床意义

目的：检测新生隐球菌中的热休克蛋白70（Hsp70）在不同的温度条件下表达量的差别，以探讨Hsp70在新生隐球菌致病中的作用。方法：采用鼠抗人、猪、狗等的Hsp70抗体通过Western印迹法检测6株临床分离株及1株CZYD2标准株新生隐球菌的 Hsp70，根据实验信号强弱定性判断在不同刺激条件下的 Hsp70产量。结果：在42℃×30min热应激及37℃×48h持续体外培养下新生隐球菌Hsp70产量较30℃培养下为高。结论：结合较难治愈病例分离株的Hsp70表达量高、热休克反应强的情况，推测Hsp70可能是新生隐球菌致病的一个因素。

肾移植术后新生隐球菌病的临床特点及转归

目的:分析肾移植术后新生隐球菌病的临床特点,旨在提高诊治水平。方法:回顾性分析6例肾移植术后新生隐球菌感染患者的临床特点、实验室检查结果、治疗及转归。结果:6例患者中5例原发病为慢性肾小球肾炎,1例为原发性高草酸尿症(I型);全部患者均系首次肾移植,发病中位时间为移植术后6年。6例患者HIV均阴性,2例乙肝表面抗原携带者,1例丙型病毒性肝炎;3例合并糖尿病,且血糖控制不佳;3例合并高血压;3例合并皮肤感染;1例有鸽子接触史。所有患者均存在发热和头痛症状,且有不同程度意识障碍,其中3例癫痫;5例脑膜刺激征阳性;2例视力下降,1例听力下降。本组患者均体型消瘦,T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+计数偏低,存在不同程度贫血,白蛋白和前白蛋白低下,移植肾功能不全。6例患者均颅内高压(23.5～41cmH2O),脑脊液蛋白含量均高于正常,但葡萄糖降低;5例脑脊液墨汁染色找到新生隐球菌,4例脑脊液培养出新生隐球菌;3例新生隐球菌菌血症,3例皮损活检组织培养新生隐球菌阳性,2例合并肺部酵母菌感染,4例诊断符合全身播散性新生隐球菌病。4例采用氟康唑治疗,1例伊曲康唑,1例氟康唑续伏立康唑;经上述药物治疗后,3例治愈并行维持性血液透析治疗,余3例死亡。结论:肾移植术后新生隐球菌易播散至皮肤,常因非特异性皮肤改变而延误诊断,因此有必要早期行皮肤组织活检以及特殊染色。早期明确诊断和及时治疗是提高此病救治成功率的关键。

MALDI-TOF MS对新生隐球菌和格特隐球菌的快速鉴定与分析

目的利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速鉴定新生隐球菌和格特隐球菌,并进一步对隐球菌不同基因型进行分析。方法收集2017年6月至2019年11月该院分离的44株隐球菌。采用URA5基因PCR产物限制性片段长度多态性(URA5-RFLP)方法对44株隐球菌进行基因分型。应用MALDI-TOF MS对44株隐球菌进行鉴定,进一步使用MALDI Biotype软件对隐球菌临床株和基因分型标准菌株进行聚类分析。结果44株隐球菌临床株URA5-RFLP分型结果显示,42株为新生隐球菌VNⅠ型,1株为格特隐球菌VGⅠ型,1株为格特隐球菌VGⅡ型。MALDI-TOF MS鉴定结果为42株新生隐球菌,2株格特隐球菌,鉴定分值为1.975~2.346分,与分子生物学结果一致。新生隐球菌和格特隐球菌之间,以及新生隐球菌和格特隐球菌不同基因型之间,特征蛋白的质量和峰的信号强度存在差异。聚类分析发现新生隐球菌和格特隐球菌分别位于两个不同的集群,且新生隐球菌和格特隐球菌不同基因型被区分开。绝大多数新生隐球菌VNⅠ型临床株与VNⅠ型标准菌株位于同一集群,格特隐球菌VGⅠ型和VGⅡ型临床株分别与VGⅠ型标准菌株和VGⅡ型标准菌株位于同一集群。结论MALDI-TOF MS可以快速、准确鉴定新生隐球菌和格特隐球菌,而且可作为一种潜在的分型方法对新生隐球菌和格特隐球菌不同基因型进行区分。

系统性红斑狼疮并发新生隐球菌病7例分析并文献复习

目的分析系统性红斑狼疮并发新生隐球菌病的临床特点,以提高临床诊疗水平。方法回顾性分析2009年1月—2015年12月南京军区南京总医院肾脏科诊治系统性红斑狼疮并发新生隐球菌病患者7例的临床特点、实验室检查结果、治疗及转归,并复习相关文献。结果 7例患者中男1例,女6例,年龄18~49(28.1±11.2)岁;6例表现为隐球菌性脑膜炎,1例考虑肺部隐球菌病;7例均无人类免疫缺陷病毒感染,起病前均曾给予甲泼尼龙冲击治疗,后续单用激素或激素联合免疫抑制剂治疗;2例有明确的鸽子接触史,1例有家禽接触史;4例接受血隐球菌抗原检测滴度均阳性;5例行脑脊液检查,脑脊液墨汁染色均阴性,4例脑脊液培养阳性,4例血培养阳性,3例颅内压明显增高(最高>350 mmH_2O),1例曾行脑室切开引流,1例治疗过程中出现脑积水行腰椎穿刺脑脊液持续引流。5例患者发病时CD4^+数目低于200×10~6/L,1例为335×10~6/L,1例未查。例1单用伊曲康唑,例4单用大扶康,例5予两性霉素B联用大扶康,例6予大扶康联用两性霉素B,均治愈;例2单用两性霉素B,例3予大扶康联用米卡芬净,放弃治疗最终死亡;例7予两性霉素B、氟胞嘧啶片、大扶康治疗后死亡。结论系统性红斑狼疮并发隐球菌性脑膜炎发生率低,但病死率较高,可能和免疫抑制剂和糖皮质激素的应用有关,早期明确诊断和及时治疗是提高此病治愈的关键。

20株新生隐球菌生物学特性分析

目的分析20株临床分离于脑脊液、血液、尿液、痰液和支气管灌洗液的隐球菌菌株的生物学特性。方法分别以油菊籽、咖啡酸玉米琼脂、刀豆氨酸-甜菜碱-溴麝香草酚蓝培养基、尿素酶试验、37℃生长试验I、D32生化鉴定板和荚膜形成试验等初步鉴定后,再经大亚基核糖体DNA(LSUrDNA)的D1/D2区域序列分析进一步鉴定菌种。同时进行血清分型和随机扩增DNA多态性研究。结果20株菌皆具有以下特征:①形成荚膜,②37℃3天内生长试验皆为阳性,③咖啡酸玉米琼脂和油菊籽培养基皆可以产生褐色菌落,④尿素酶试验96 h皆呈阳性,⑤CGB培养基未见蓝色菌落生长,⑥ID32鉴定板可以鉴定到属,种的鉴定结果各不相同,⑦大亚基核糖体DNA(LSUrDNA)的D1/D2区域序列分析证实皆为新生隐球菌的新生变种,⑧血清型仅见A和AD二型,以A型为多数(83.33%),⑨20株临床分离株随机扩增DNA多态性分析有一定的生态多样性。结论20株临床分离株皆为新生隐球菌的新生变种,血清型多数为A型,少数AD型,但不同菌株间存在一定的生物多态性。

伊曲康唑与氟胞嘧啶体外联合抗新生隐球菌临床分离株的实验研究

目的:评价新生隐球菌临床分离株对伊曲康唑与氟胞嘧啶联合用药的敏感性及两种药物之间相互作用的方式。方法:采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的棋盘微量稀释法,检测了20株新生隐球菌临床分离株对伊曲康唑、氟胞嘧啶及两药联合用药的体外药物敏感性,同时对两种药物的作用方式进行了判定。结果:联合用药时显著减少了每一药物MIC值的几何均数,25%受试菌株表现为协同作用方式,60%的受试菌株表现为相加作用方式,15%受试菌株表现为无关作用方式,未观察到拮抗作用。测定不同浓度下单一药物和联合用药的一株菌的菌落形成单位,联合用药较氟胞嘧啶单独用药菌落形成单位有减少现象。结论:伊曲康唑与氟胞嘧啶联合应用较两种药物单独应用的体外抗新生隐球菌的活性高。

新生隐球菌病研究进展

隐球菌是条件致病性深部真菌,易发于细胞免疫功能受损的人群。新生隐球菌是隐球菌属的重要致病菌,属环境腐生菌,可从土壤和鸽粪中分离到,并被认为是人和动物最主要的传染源。医学方面,近年来由新生隐球菌引起的感染有逐渐增多的趋势,主要引起人的脑膜炎和肺炎。动物医学方面,可引起马的呼吸道病、牛羊的乳腺炎。鸽是隐球菌的自然宿主,但并不引起发病。该文从隐球菌病的病原特征、分类、毒力因子、致病性等生物学特性进行了概述,并对人和动物新生隐球菌病的传染和流行的基本环节、发病机制、临床表现、防治等方面的研究进展进行了综述。

艾滋病并发新生隐球菌脑膜炎13例临床分析

目的:提高对艾滋病并发新生隐球菌脑膜炎的认识。方法:对2002年9月—2008年3月期间收治的13例艾滋病并发新生隐球菌脑膜炎患者的临床资料进行回顾性分析。结果:13例患者均有发热、头痛、颈项强直等神经系统症状和体征,平均体重47.90 kg,恶病质表现;CD4^+细胞计数11例<0.05×10~9/L,2例在(0.05～0.1)×10~9/L之间,平均0.038×10~9/L。结论:艾滋病并发隐球菌脑膜炎常发生在晚期患者,病情重,预后差,应加强早期预防、早诊断、早治疗。