B亚型新等位基因803delC的分子生物学研究

目的分析研究1例新的B亚型等位基因血清学特点和分子生物学机制。方法应用血清学方法检测患者ABO血型。应用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)检测ABO血型基因。应用Sanger基因序列分析检测ABO基因1~7外显子编码区域,确定基因突变位点。结果血清学鉴定患者正定型为O型,反定型为B型。PCR-SSP基因分型结果为A/O型,存在A基因,与血清学结果不符。进一步Sanger双链测序结果显示该标本在ABO^(*)B.01/ABO^(*)O.01.01的基础上,第7外显子803位置缺失C碱基。该突变最终导致多肽链上发生p.Ala268Gly和p.Phe269Ser的氨基酸替换,并且从269位置开始产生新的开放阅读框,新的开放阅读框第20号氨基酸为终止密码子,导致B基因表达终止。进一步ABO基因克隆测序证明该突变点位于ABO*B.01基因上,该突变已提交NCBI数据库,收录编号为OR343908。结论在中国人群中发现1种新的导致B变异型的ABO等位基因,基因检测方法可辅助鉴定血清学正、反定型不符的疑难血型。

HLA新等位基因B*46:30序列分析及其编码MHC蛋白分子结构预测与表型鉴定

目的:鉴定分析HLA新等位基因B*46:30序列,对其MHC蛋白分子三级结构及氨基酸残基改变对蛋白结构的可能影响进行模拟分析,并对其血清学表型进行鉴定。方法:应用Luminex SSOP流式、PCR-SBT及单等位基因特异性测序对HLA序列进行序列鉴定。应用SWISS-MODEL及RCSB PDB分析软件,对HLA序列蛋白分子三维结构进行模拟分析。HistoCheck、FATCAT对比分析蛋白分子间差异。使用Terasaki分型板进行血清型表型鉴定。结果:相较于B*46:01,新等位基因B*46:30第559、560位发生C->G、T->A替代。MHC分子结构预测分析表明,B*46:30第163位氨基酸残基由疏水性脂肪族亮氨酸Leu→B*46:30带负电荷的酸性谷氨酸Glu,R值为32。该氨基酸变异位置位于α2结构域构成抗原多肽结合凹槽侧壁的α螺旋顶端,总差异值DSS Score=1.32,均方根偏差RMSD=0.59?,血清型表型检测为B46强阳性。结论:HLA新等位基因序列被WHO HLA命名委员会正式命名为B*46:30,分析预测此编码氨基酸残基改变将可能影响其抗原多肽结合功能,并影响其与TCR及抗体的结合特性,血清型表型鉴定为B46。

猪MHC-Ⅱ类区DQA新等位基因及新突变位点的发现

根据猪SLA DQA基因cDNA序列和人HLA DQA基因组序列设计引物 ,在猪中成功扩增了一个 731bp的片段 ,该片段包括猪SLA DQA基因的大部分第 2外显子、完整第 2内含子和少部分第 3外显子 ,通过克隆和PCR直接测序获得该片段的核苷酸序列。在家系中对第 2外显子的核苷酸序列和其编码的α1 结构域的氨基酸序列进行了分析 ,并与GenBank中所有的SLA DQA第 2外显子序列进行比较分析 ,发现有 4个新突变位点和两个新等位基因存在。新等位基因分别是DQA SLT 2 6和DQA TC 2 1 1。DQA SLT 2 6与单倍型c、d相比有 8个核苷酸的差异和 4个氨基酸的改变 :单倍型c、d在 6 0、6 5、81、93位的氨基酸分别是Val、Lys、Asp、Lys;而DQA SLT 2 6相应的氨基酸是Ala、Glu、Gly、Ile。DQA TC 2 1 1与单倍型c、d相比存在 1个氨基酸的改变 ,由单倍型c和d中 94位氨基酸His变为Tyr。

ABO血型新等位基因Ael08的分子生物学研究

目的研究ABO新等位基因Ael08的分子机制。方法利用单克隆抗体检测先证者标本红细胞ABO血型抗原，标准A、B、O红细胞检测血清中的ABO抗体，吸收放散试验检测红细胞上微量抗原；采用PCR技术扩增先证者ABO基因的第5～7外显子序列，PCR产物经双酶切后直接测序分析6和7外显子；扩增产物经TOPOTA克隆到质粒载体中获得单链，对所得克隆作ABO基因第6、7外显子双向测序分析；家系调查采集先证者父亲和哥哥的标本作血型血清学试验和ABO基因第6和7外显子直接测序分析。结果先证者红细胞上表达很弱的A抗原，只有通过吸收放散才能有效检出，同时其血浆中存在较强的抗-B和较弱的抗-A；直接测序分析发现：6号外显子第261位缺失杂合，7号外显子第297位A／G、467C／T、646T／A、681G／A、771C／T、829G／A、804insG／G杂合；克隆测序发现1个为常见的002等位基因，另1个为1种新的等位基因（已被dRBCNCBI命名为Ae抑8），与A102比较，Ael08在第804位碱基处插入G，这导致氨基酸第268位后阅读框架发生改变，编码产物比正常A1转移酶多37个氨基酸。家系调查显示：先证者Ael08等位基因从父亲遗传所得。结论发现1个ABO新等位基因Ael08，α-1，3-N．乙酰半乳糖胺基转移酶基因（A基因）第804位碱基处插入G突变导致产生Ael表型。

DNA序列分析鉴定HLA-DRB1新等位基因DRB1 1449

目的鉴定HLADRB1位点新等位基因。方法应用基因克隆和DNA测序技术对1例受检样本HLADRB1基因第2外显子(Exon2)作核苷酸序列分析,与已知等位基因序列比对并作血清学分型。结果基因组DNA和DNA克隆的测序结果一致;DRB1Exon2的核苷酸序列与已知等位基因序列均不相同,与同源性最高的HLADRB11432相比,存在4处碱基的改变;以Exon2的第1位碱基为记数起点,核苷酸71位C→>G,196位G→>A,244位T→>G和245位上G→>T,引起相应编码氨基酸28位上天门冬氨酸(Asp)→>谷氨酸(Glu),70位上精氨酸(Arg)→>谷氨酸盐(Gln),86位上缬氨酸(Val)→>氨基乙酸(Gly)。血清学分型结果表明新等位基因血清学特异性为DR14。结论被检标本HLADRB位点存在新等位基因,2005年2月WHOHLA命名委员会正式将其命名为HLADRB11449。

HLA新等位基因B*4086的确认及家系调查

目的识别和鉴定HLA新等位基因B*4086,调查分析该基因的遗传情况。方法应用聚合酶反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-sequence specific oligonucleotide primer,PCR-SSOP)技术对中华骨髓库志愿捐献者血样进行HLA分型,发现1例HLA-B疑似新等位基因,用DNA测序技术鉴定新等位基因并对该基因的携带者进行家系调查。结果经DNA测序确定为HLA新基因序列,该基因与HLA-B*40060101相比,第3外显子419位碱基由A→T,导致相应的140位密码子编码的氨基酸由酪氨酸(Tyr)→苯丙氨酸(Phe)。家系分析表明该新基因来自携带者母亲一方。结论DNA测序表明被测样本含有HLA-B新等位基因,于2008年2月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4086,该新基因遗传于先证者母亲。

中国南方汉族人群中一个常见型新等位基因HLA-C＊08：22的基因频率调查和分析

本研究调查南方汉族人群中1个常见型的HLA新等位基因C*08:22的基因频率。对163份南方汉族无血缘关系个体血样进行常规的HLA-C基因第2、第3和第4外显子测序分型;对所检出的32份带有C*08:01:01/08:22模棱两可结果的样本,进一步增加HLA-C基因的第5和第6外显子测序。在C*08:22被发现和获得WHOHLA因子命名委员会认可前,对40例被鉴定携带C*08:01:01等位基因的无血缘关系供/受者进行HLA-C基因外显子2-6再测序。所有的序列均导入Assign 3.5 SBT软件,分析等位基因型。结果表明,32份无血缘关系个体检出C*08:01:01/08:22模棱两可结果的样本中,发现3例样本鉴定为C*08:22,南方汉族无血缘关系个体中C*08:22的基因频率为0.92%。回顾性分析以往40例携带C*08:01:01等位基因的无血缘关系供/受者对发现,其中2对供/受者实际为C*08:22。结论:C*08:22在南方汉族中为常见型的HLA等位基因,当测序分型出现C*08:01:01/08:22模棱两可的结果时,不能轻易视为罕见型等位基因而错误地排除。

HLA新等位基因A~*02:355序列及其编码蛋白分子三维结构模拟分析

目的:鉴定分析HLA新等位基因A*02:355的序列变异并预测分析其氨基酸残基改变在编码蛋白分子三维空间结构中的影响。方法:应用Luminex SSO流式、PCR-SBT及单等位基因特异性测序对1例A位点变异序列进行鉴定。应用Phyre2蛋白折叠识别在线服务器以及RasMol和PDB Protein Workshop分析软件,对其编码蛋白分子三级结构及其氨基酸残基改变特点在MHC分子三维空间结构中所处位置及可能影响进行模拟分析。结果:相较于A*02:03:01,其第98、102位核苷酸发生T->A、A->C替代,导致其编码氨基酸发生9F→Y改变。其编码蛋白分子三维结构模拟分析表明,该氨基酸变异位置位于α1和α2结构域抗原多肽结合凹槽β折叠片层底面的第1 β股链的中心位置,该位置亦参与构成抗原多肽结合凹袋B和凹袋C。结论:该等位基因序列被WHO HLA命名委员会正式命名为A*02:355。分析预测此编码氨基酸改变将可能影响其MHC分子的抗原多肽结合及呈递功能。

10个HLA新等位基因的测序确认

目的用DNA测序方法确认HLA新等位基因。方法对常规流式荧光微珠HLA分型方法无法给出确切结果的标本,采用序列特异性引物测序、单倍型测序、克隆测序等方法确认新的等位基因序列,将测得的序列与已知的最相近序列进行比对,可疑新等位基因序列提交GenBank进行注册,向WHOHLA因子命名委员会申报确认。结果2004年5月—2005年12月共进行常规检测12193人份,发现可疑标本21份,测序确认为新等位基因的有10份,申报确认为新的HLA等位基因,已经被正式命名。结论测序是确认HLA基因序列的金标准,但常规直接测序并不能解决全部问题,需要借助组序列特异性引物(GSSP)测序、单倍型测序、克隆测序等方法加以解决。

HLA新等位基因HLA-B_*67:07测序分析及确认

目的人类白细胞抗原B新等位基因核苷酸序列分析及确认。方法采用序列特异性寡核苷酸探针技术(SSO)对2015年中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)人库数据进行HLA常规检测,结果显示有1个磁珠反应异常,进一步选择多聚酶链反应-测序(PCR-SBT)分型发现1个与HLA-B*67相关的有1个碱基不匹配的等位基因,选择对应的组特异性引物对该等位基因进行2次分离式测序,确认突变的等位基因和突变位点。结果发现1个与HLA-B~*67:01:01序列相近的新等位基因,实验结果表明在HLA-B~*67:0:01第3外显子370位置G>A,其突变造成HLA-B~*67:01:01氨基酸序列中100位的氨基端由甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser)。结论本次实验确认了1个新的HLA等位基因,2016年3月30日被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B~*67:07。

HLA新等位基因HLA-B* 13∶42的确认及序列分析

目的认定1个人类白细胞抗原(HLA)新等位基因并分析其核苷酸序列。方法应用PCR-SBT进行HLA常规分型发现1个与HLA-B*13相关的异常等位基因,用针对于B*13的位点特异性SSSP引物测序,确认与同源性最高的HLA等位基因序列的差异。结果发现1个标本的HLA-B位点核苷酸序列与所有已知HLA-B位点等位基因核苷酸序列不一致,与同源性最高的等位基因B*13:02:01的差异是在第3外显子445位的G>T,其突变导致密码子GCC>TCC,结果造成B*13:02:01氨基酸序列中125位的Ala丙氨酸(A)变为丝氨酸(S)。结论该等位基因为HLA-B位点的1个新等位基因,该基因被世界卫生组织(WHO)HLA命名委员会命名为HLA-B*13:42。

MICA新等位基因MICA*002:04的DNA序列鉴定及分析

目的:直接测序法及外显子3 DNA片段克隆测序定确认MICA新的等位基因MICA*002:04。方法:用组特异性引物分别扩增MICA基因,采用Sequence Base Typing(SBT)法分型技术及PCR片段克隆测序法对MICA多态性基因的外显子2、3、4、5进行双向测序。结果:发现1个与MICA*002:01序列相近的新等位基因,在外显子3上有1个碱基位置与国际通用MICA数据库不相符。该基因与MICA*002:01相比在外显子3的碱基位置486出现突变(C→A),密码子位置20由GCC→GCA,相应编码氨基酸是同义突变。结论:DNA测序结果表明该基因序列为新的MICA等位基因,已提交GenBank,于2010年9月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为MICA*002:04。

HLA-A新等位基因A^＊01：01：51的DNA序列分析

目的分析HLA-A*01∶01∶51新等位基因的序列。方法应用SBT基因分型技术,通过位点特异性PCR扩增和组特异性PCR扩增,对扩增产物进行HLA-A基因的第2、3、4外显子双向测序,将测序结果与数据库进行比对,确认突变的位置。结果组特异性引物扩增结果显示A位点有2个等位基因,其中1个为A*02∶07∶01,另1个为新等位基因。经BLAST分析,新等位基因与HLA-A*01∶01∶01∶01序列仅在第4外显子上有1个碱基不同,即第762位C→T,254位氨基酸CTC→CTT,氨基酸没有改变,仍为亮氨酸。新等位基因序列已递交Genebank(JX629459)。结论该HLA-A新等位基因于2012年9月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为A*01∶01∶51。

HLA新等位基因HLA-A*11∶230序列分析及确认

目的对人类白细胞抗原(HLA)-A*11新等位基因核苷酸序列分析及确认。方法采用多聚酶链反应-测序(PCR-SBT)在对2015年中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)入库数据进行HLA常规分型中,应用组序列特异性引物(GSSP)单链测序方法针对常规SBT检测中A位点无匹配结果的2例无亲缘关系陕西汉族供者样本进一步进行确证实验,并运用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针技术(PCR-SSO)进行对照实验。结果经确证实验发现2例无亲缘关系供者携带同一HLA-A新等位基因序列,与同源基因HLA-A*11∶01序列相比,均在第2外显子98位置发生A>G突变,该突变造成氨基酸序列9位由酪氨酸(TAC)变成半胱氨酸(TGC);而2例样本的PCR-SSO结果均显示为HLA-A的常见等位基因组合,未见异常反应格局。结论经WHO HLA因子命名委员会正式命名的新等位基因HLA-A*11:230的发现和鉴定表明,对于常规测序无匹配结果的样本应进一步深入分析,即使以常见等位基因组合为分型结果的SSO方法仍存在HLA新等位基因漏检的可能,需引起注意。

HLA新等位基因A*9217家系调查分析

背景:目前所发现的HLA等位基因是在人类进化过程中,为了适应某种外界环境过程中逐渐产生的,新近产生而不曾被人们发现的为新等位基因,这些新的等位基因产生诱因千变万化,在诱发因素消除之后这些突变是否持续存在,尚需进一步观察。目的:采用DNA测序技术确认聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸分型检测中的可疑结果,确认新的HLA等位基因,分析新等位基因HLA-A*9217(WHO注册号:WHS10004629)的遗传方式。设计、时间及地点:以DNA为观察对象的开放性试验。其中常规初检聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法于2007-11在河南省红十字血液中心中华骨髓库河南分库人类白细胞抗原组织配型实验室完成,测序实验于2008-02在戴诺生物技术(北京)有限公司人类白细胞抗原实验室完成。材料:中华骨髓库志愿捐献者(编号:371xxxxx)及其直系3代亲属血样,受试者共9人在实验室逐个登记,采集静脉血5mL,EDTA抗凝。方法:用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸流式荧光微珠HLA分型方法、SBT测序分型方法,对A*9217携带者家庭成员进行中低分辨,DNA测序高分辨检测分析,血清学方法检测ABO,MN,Rh血型系统,分析新基因的发现及遗传方式。主要观察指标:HLA新等位基因A*9217携带者A位点外显子3序列对比。结果:通过受检者HLA分型结果和红细胞系统ABO,MN,Rh血型分析,先证者A*9217应来自父方,但父方并没有检出A*9217,而是检出了与之序列相近的A*020301,与A*9217在处显子3有3处碱基改变391T>G,414C>G,418T>G,A*9217携带者的2个孩子均检出A*9217。结论:新基因A*9217先证者父方产生突变所致,该突变能正常遗传给后代,该基因是否能稳定遗传下去有待进一步观察研究。

新等位基因人类白细胞抗原B*15:133的鉴定及其原核表达

背景:国际上至2010-04共报告人类白细胞抗原4633个等位基因,中国自2000年至少发现200个新的等位基因,由于资金和时间有限,大部分新等位基因未作血清分型、家系研究以及进一步的功能性研究。目的:在健康志愿者人群中发现新等位基因,并对其进行家系研究,同时构建重链胞外区多肽的原核细胞表达载体,鉴定其在原核细胞中是否表达。方法:利用PCR-SSO和PCR-SBT技术,对人群的人类白细胞抗原进行筛选。使用血清学和SBT技术对拥有新等位基因的供者进行家系分析。用分子克隆的方法构建表达载体转染原核细胞,运用Western-blot鉴定是否表达。结果与结论:发现一个新等位基因与人类白细胞抗原B*15:18:01在第419位相差一个核苷酸,C->T,即Codon116位TCC->TTC,导致氨基酸由丝氨酸改变成苯丙氨酸。最终确定命名为人类白细胞抗原B*15:133。血清学表达B71(70)抗原。发现此供者的新等位基因来自于母亲。表达载体pET30a(+)-B*15:133在原核细胞中表达的多肽可被抗HIS标签单克隆抗体特异性识别。结果表明,使用分子生物学技术在大样本的筛查下发现了新等位基因人类白细胞抗原B*15:133,利用分子克隆的方法成功构建表达载体pET30a(+)-B*15:133,并在原核细胞中有大量高纯度蛋白表达。

人类白细胞抗原新等位基因A*2636的确认

背景:目前中华骨髓库主要采用分辨率较高的聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法检测人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1,该方法在提高分辨率的同时,有些检测结果难以一次性确定,可采用DNA测序技术确认。目的:识别和确认一个人类白细胞抗原新等位基因。设计、时间及地点:以DNA为观察对象的开放性实验。常规初检聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法于2007-11在河南省红十字血液中心中华骨髓库河南分库人类白细胞抗原组织配型实验室完成,测序实验于2008-02在戴诺生物技术(北京)有限公司人类白细胞抗原实验室完成。材料:中国造血干细胞捐献者初检结果可疑为新基因的重采血样5mL。方法:采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法进行常规人类白细胞抗原分型,发现A位点反应格局异常,提示有2个无法解释的假阳性探针反应(10FP、88FP)和1个假阴性探针反应(58FN)、不能正常判读给出确切结果时,采用DNA测序技术测定人类白细胞抗原A位点外显子2,3,4(Exon2,3,4)的核苷酸序列,并与已知相近等位基因进行序列对比分析。主要观察指标:测序结果与已知人类白细胞抗原等位基因序列的比较分析。结果:聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法基因分析结果显示,受检者人类白细胞抗原基因分型为A*02xx,26xx(10FP、88FP58FN),B*15(75),55xx,DRB1 08xx,11xx,A位点反应格局异常,提示有2个无法解释假阳性反应*(10FP、88FP),有1个假阴性探针反应(58FN),不能指定为任何人类白细胞抗原A位点等位基因。对本例人类白细胞抗原A基因第2,3,4外显子双向之直接测序结果分析显示:A*02010101,A*260101292S/C。分析测序结果峰图,292位置应为C,分析软件提示该基因改变在A26new一侧。该序列与人类白细胞抗原A*260101进行比对,同源性99%,在第2外显子区域292位碱基发生了G→C,74位的密码子GAC>CAC最终导致了氨基酸的改变,即天冬氨酸(Asp)→组氨酸(His)。结论:该序列为A位点的一个新等位基因,已在GenBank注册(注册号EU785343),并于2008-04被WHO-HLA因子命名委员会正式命名为A2636.(HWS10005530)。

新等位基因HLA-A＊ 1127的确认和序列分析

目的识别确认临床样本中一个新的HLA等位基因。方法应用PCR-SSO,PCR-SSP基因分型技术对HLA分型,对可能的HLA新等位基因进行分子克隆和DNA测序,分析与最同源的A*1104的差异。结果该序列与已知的所有HLA-A等位基因序列不一致,与A*1104的差异表现在第3外显子区域中的核苷酸570 G→C,571 T→G导致氨基酸分别由谷氨酸→天冬氨酸,色氨酸→甘氨酸。结论该基因为HLA-A位点的一个新等位基因,已被WHO HLA因子命名委员会于2007年8月正式命名为HLA-A*1127。

新等位基因HLA-B^＊9537的确认和序列分析

目的识别并确认1个新的HLA等位基因。方法应用PCR-SSO,PCR-SSP基因分型技术对1份临床样本做HLA分型,对可能的HLA新等位基因进行分子克隆和DNA测序,分析与最同源的B*1504的差异。结果得到1份样本的序列与已知的所有HLA-B等位基因序列不一致,与B*1504的差异表现在第3外显子区域中的379G>C,409C>T,412G>A,419C>T,导致氨基酸分别由谷氨酸→天冬氨酸(E103D),苏氨酸→赖氨酸(T113K),谷氨酰胺→谷氨酸(Q114E)和丝氨酸→苯氨酸(S116F)。结论该基因为HLA-B位点的1个新等位基因。

HLA新等位基因DRB1＊03：80的鉴定及其序列分析

本研究旨在分析鉴定中国人群HLA-DR位点1个新等位基因。应用Luminex PCR-SSO流式分型技术发现1例罕见等位基因组合样本,应用PCR-测序分型(sequence-based typing,SBT)及单等位基因特异性测序分型技术进行鉴定分析。结果表明,该样本DR位点1个等位基因序列与同源性最高的DRB1*03:06等位基因相比,其第2外显子第239位核苷酸碱基由C→G,结果导致相应51位密码子编码的苏氨酸变为精氨酸。结论:确定了该样本含有1个HLA-DRB1新等位基因。该等位基因被WHO HLA因子命名委员会正式命名为DRB1*03:80。