新西兰白兔BMP 15基因的真核表达载体构建、表达模式及其在卵巢组织的表达

旨在获得新西兰白兔BMP 15基因序列及其组织表达规律,构建其真核表达载体,预测BMP15的生物学功能。本研究选择180日龄性成熟的健康新西兰白兔作为研究对象,采用RT-PCR技术扩增BMP 15基因CDS区序列,利用T4连接方法将目的片段连接至线性化的Pmcherry-N1和pCMV-Myc空载体,构建真核表达载体,利用生物信息学分析其编码蛋白的性质及结构。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术与Western blotting技术检测pCMV-Myc-BMP 15过表达情况。接下来,使用qRT-PCR检测BMP 15基因在不同组织中的表达水平。激光共聚焦方法检测BMP 15基因的亚细胞定位。利用免疫荧光技术检测内源BMP15在新西兰白兔卵巢组织定位情况。结果表明:克隆得到新西兰白兔BMP 15基因CDS区序列长1182 bp,PCR及测序结果表明pCMV-Myc-BMP 15和Pmcherry-N1-BMP 15真核表达载体构建成功。生物信息学分析显示,BMP 15基因编码393个氨基酸;BMP15蛋白不稳定系数为55.32,等电点大小为9.69,是一种稳定的碱性蛋白质。BMP15蛋白共有26个磷酸化位点,15个糖基化位点,存在信号肽,不存在跨膜结构域。系统进化树表明,新西兰白兔与猪亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。二级结构和三级结构分析结果表明,BMP15蛋白主要由α-螺旋(38.68%)、无规则卷曲(37.4%)、延伸链(15.52%)、β-转角(8.40%)组成,为混合型蛋白。蛋白互作关系预测发现,BMP15蛋白与FSHR、FIGLA、BMPR1B、AMHR2、NOBOX等卵巢生长发育的相关蛋白之间存在相互作用。不同组织表达分析显示,BMP 15基因在卵巢组织中特异性表达;激光共聚焦结果显示,BMP15主要存在于在细胞质中。将pCMV-Myc-BMP 15转染至HEK293T细胞内,BMP15的mRNA水平和蛋白水平均显著上调。卵巢组织免疫荧光检测结果显示,BMP15主要定位在卵巢颗粒细胞的细胞质中。本研究成功构建了BMP15的真核表达载体,对BMP 15基因及其编码的蛋白的理化性质和生物学特性进行了预测分析,在HEK293T细胞内成功过表达,并得到了该基因的亚细胞定位情况、组织表达情况及在卵巢组织的分布情况。为后续开展BMP 15基因在卵巢生长发育中的功能及机制研究提供了理论依据。

饲养密度对新西兰白兔生长性能、行为、免疫器官指数和血清抗氧化指标的影响

试验旨在探讨饲养密度对家兔生长性能、行为方式、免疫器官指数和血清抗氧化指标的影响。试验选取35日龄体重相近(943.86±51.13)g,健康的雄性新西兰白兔120只,随机分为4组,每组6个重复(笼),即Ⅰ组每个重复(笼)2只(5只/m^(2))、Ⅱ组每个重复(笼)4只(10只/m^(2))、Ⅲ组每个重复(笼)6只(15只/m^(2))、Ⅳ组每个重复(笼)8只(20只/m^(2))。预饲期5 d,试验期35 d。结果显示:在生长性能方面,Ⅰ组和Ⅱ组家兔的末重和平均日增重显著高于Ⅲ组(P<0.05),且极显著高于Ⅳ组(P<0.01),Ⅲ组的末重和平均日增重显著高于Ⅳ组(P<0.05);平均日采食量Ⅰ组和Ⅱ组极显著高于Ⅲ组(P<0.01),Ⅲ组高于Ⅳ组(P<0.01)。在趴卧行为发生率方面,家兔的趴卧行为Ⅰ组和Ⅱ组极显著低于Ⅲ组(P<0.01),Ⅲ组极显著低于Ⅳ组(P<0.01);Ⅰ组和Ⅱ组的运动和站立行为发生率差异均不显著(P>0.05),其余各组之间差异均极显著(P<0.01);Ⅰ组和Ⅱ组的采食行为发生率均极显著高于Ⅲ组和Ⅳ组(P<0.01);Ⅰ组和Ⅱ组的修饰行为发生率极显著高于Ⅲ组和Ⅳ组(P<0.01),而啃咬行为发生率则显著低于Ⅲ组和Ⅳ组(P<0.05)。在免疫器官指数方面,Ⅰ组和Ⅱ组家兔的脾脏指数显著高于Ⅳ组(P<0.05),胸腺指数均显著高于Ⅲ组和Ⅳ组(P<0.05)。在血清抗氧化能力方面,Ⅱ组和Ⅲ组家兔的血清T-AOC浓度和SOD活性均显著高于Ⅳ组(P<0.05);Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组血清中MDA含量均显著低于Ⅳ组(P<0.05)。以上结果表明,适当降低饲养密度能够改善家兔的生长性能和行为状态,提高其免疫和抗氧化能力,在考虑饲养笼具利用率的基础上,以Ⅱ组4只/笼(10只/m^(2))的饲养密度效果最佳。

新西兰白兔CTSB、CTSS基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆新西兰白兔组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)与CTSS基因CDS区序列并进行生物信息学分析,探究其在新西兰白兔不同组织中的表达规律。【方法】采用PCR法扩增并克隆CTSB、CTSS基因CDS区序列,使用Mega 7.0软件构建系统进化树并分析氨基酸序列相似性;利用生物信息学软件分析CTSB、CTSS蛋白理化性质、跨膜结构、信号肽位点及亚细胞定位情况;用实时荧光定量PCR检测CTSB、CTSS基因在新西兰白兔不同组织中的表达量。【结果】新西兰白兔CTSB、CTSS基因CDS区序列长分别为1020、1023 bp,共编码339、340个氨基酸,蛋白分子质量分别为37.627、38.253 ku,理论等电点为5.53、8.40,不稳定系数为30.76、32.38,分别为酸性及碱性蛋白。新西兰白兔CTSB、CTSS基因氨基酸序列分别与猪、马的亲缘关系最近,与鸡亲缘关系较远。CTSB、CTSS蛋白二级结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,二者三级结构预测结果与二级结构一致,均为亲水性蛋白;CTSB蛋白信号肽剪切位点位于第17—18位氨基酸处,含有1个N-端Propeptide-C1结构域与1个Peptidase-C1A-C结构域;CTSS蛋白信号肽剪切位点位于第25—26位氨基酸处,含有1个Inhibitor-129结构域与1个Peptidase-C1结构域。亚细胞定位结果表明,CTSB、CTSS蛋白均主要分布于细胞质(包括细胞壁)内。实时荧光定量PCR结果显示,CTSB基因在腹脂和肝脏组织中表达量较高,CTSS基因在脾脏组织中表达量最高,均显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】成功克隆新西兰白兔CTSB、CTSS基因CDS全长序列,揭示了CTSB、CTSS基因在新西兰白兔不同组织中的表达水平并初步分析了其生物学功能,为进一步研究家兔CTSB、CTSS基因功能及调控机制提供了基础和参考。

中药降脂复方对新西兰白兔胆固醇-胆汁酸代谢的调节

目的:探讨中药降脂复方对新西兰白兔胆固醇-胆汁酸代谢的调节机制。方法:采用随机数字表法将60只新西兰白兔分为对照组、模型组、中药降脂复方低剂量组和中药降脂复方高剂量组,每组15只。除对照组外,其余组新西兰白兔给予高胆固醇饮食,同时给予相应药物进行灌胃,每天1次,连续4周。ELISA法检测肝脏胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7α hydroxylase, CYP7A1)的水平;酶水解法测定血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、总胆红素(total bilirubin, TBIL)的水平;酶循环法测定血清总胆汁酸(total bile acid, TBA)水平;HE染色检测肝脏病理变化;RT-PCR检测小异源二聚体伴侣(small heterodimer partner, SHP)、胆盐输出泵(bile salt export pump, BSEP)和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1) mRNA相对表达量。结果:与对照组相比,模型组TC、TBIL水平及SHP mRNA、BSEP mRNA、ABCA1 mRNA相对表达量升高,TBA水平及CYP7A1活性降低;与模型组相比,中药降脂复方组TBA水平及CYP7A1活性升高,TC、TBIL水平及SHP mRNA、BSEP mRNA、ABCA1 mRNA相对表达量降低,且呈剂量依赖性,差异均具有统计学意义(P<0.05)。HE染色显示,模型组新西兰白兔肝细胞肿大,有炎性细胞浸润;给予中药降脂复方后,各组新西兰白兔肝脏病理改变有所改善。结论:中药降脂复方能有效调节新西兰白兔胆固醇-胆汁酸代谢,其作用机制可能与调控SHP、BSEP及ABCA1表达有关。

Vc-獭兔、日本大耳白兔与新西兰白兔血液蛋白多态性研究

为给加速 Vc-獭兔育种提供理论依据 ,利用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对 Vc- 系、 系獭兔、日本大耳白兔和新西兰白兔血液中的红细胞酯酶 (Es-1、Es-2和 Es-3 )、血清前转铁蛋白 (Prt)、后白蛋白 (Po)等 5个蛋白位点的多态性进行了测定 ,结果表明 :在 4个群体中 ,Es-1、Es-2、Es-3和 Po各有 3种表型 ,分别受 2个共显性等位基因控制 ,Prt有 6种表型 ,受 3个共显性等位基因控制。计算表型频率及基因频率。并根据基因频率计算遗传距离和聚类分析 ,分析结果 :Vc- 系、Vc- 系獭兔的亲缘关系最近 ;Vc-獭兔与日本大耳白兔的亲缘关系较近 ,与新西兰白兔的亲缘关系较远 ,日本大耳白与新西兰白兔的亲缘关系最远。

日本大耳白兔、新西兰白兔的遗传分化研究

应用平均基因杂合度、平均基因纯合度、等位基因有效数、基因均质度、Lewontin的Shannon信息测度 ,对日本大耳白兔、新西兰免两个群体存在的血液蛋白位点的基因频率进行遗传分析 ,研究表明 :日本大耳白兔的基因杂合度、等位基因有效数指标和Shannon信息测度值均高于新西兰白兔 。

新西兰白兔支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

目的了解支气管败血波氏杆菌在实验兔群中的感染情况,并对该菌的生物学特性进行研究。方法从江苏南京地区四家实验兔场采集有鼻炎症状的患兔鼻腔分泌物63份进行细菌的分离鉴定,并对分离菌对小鼠的毒性,对断奶幼兔的致病性,对抗生素敏感性和生长培养特性等进行了研究。结果共分离出支气管败血波氏杆菌19株,分离率为30.16%,分离菌中有15株为强毒,1株为弱毒,3株无毒;对其中5株强毒株的抗生素敏感性试验表明,所有毒株对新霉素、氯霉素、红霉素、妥布霉素高度敏感,而对痢特灵、链霉素、洁霉素均不敏感,对其他抗生素的敏感性则各不相同。结论支气管败血波氏杆菌是引起实验兔鼻炎的重要病原菌,分离率较高,并与季节具有一定的相关性,分离菌对小鼠毒性较高,对幼兔具有一定的致病性,具有特定的生长特性、形态特性和对抗生素的敏感特性。

锌对新西兰白兔血管细胞凋亡影响的实验研究

目的 观察锌对血管细胞凋亡的影响。方法 选用雄性新西兰大白兔 2 1只 (实验组 14只 ,对照组7只 ) ,实验组饮水中加葡萄糖酸锌 (锌浓度 15 .0 mmol/L )喂养 ,分别于 6,12个月时取主动脉 ,应用光镜及电镜观察血管形态学变化 ,以 DNA末端标记法观察细胞凋亡。结果 锌喂养 6个月时微细结构及超微结构出现不同程度的病理变化 ,12个月时血管内壁色泽灰暗 ,弹性降低 ,内皮细胞肿胀 ,中膜平滑肌增生 ,细胞核膜内陷切迹 ,染色质回缩 ,线粒体部分空泡变 ,胞浆膜破裂 ,弹力纤维稀疏。实验组较对照组血管细胞凋亡增多 (P <0 .0 1) ,细胞凋亡面积增加 (P <0 .0 1)。结论 补锌能诱导血管细胞凋亡 。

福建白兔与新西兰白兔生长和生化指标比较

【目的】了解福建白兔的生长与生化特性及其与新西兰白兔的差异,为进一步开发利用福建白兔提供科学数据支持。【方法】测定福建白兔与新西兰白兔不同日龄的生长发育情况和90日龄的生化指标,并分别进行品种内性别比较和品种间比较。【结果】福建白兔公兔体重均大于同期母兔体重但差异不显著,35~90日龄日增重公兔显著高于母兔(P<0.05)。两个品种兔相比,90日龄福建白兔的体重、体长、胸围、耳长、耳宽、免疫球蛋白IgM、IgG、球蛋白、谷氨酰转肽酶、总胆固醇、低密度脂蛋白都低于新西兰白兔,且除低密度脂蛋白差异显著外(P<0.05),其他差异极显著(P<0.01);而福建白兔白蛋白、乳酸脱氢酶和总胆红素极显著高于新西兰白兔(P<0.01)。【结论】福建白兔与新西兰白兔相比,其体型小,生长速度慢,血液生化指标具有总胆固醇低、低密度脂蛋白低和白蛋白高等优点。

饲粮中添加桑叶粉对新西兰白兔生长性能及血清主要生化指标的影响

根据新西兰白兔生长性能及血清主要生化指标的变化,研究饲粮中桑叶粉的适宜添加量。选用120只35日龄的断奶新西兰白兔供试,随机分为4个处理组,分别用桑叶粉添加水平（质量分数）为0（对照组）、15%（试验Ⅰ组）、20%（试验Ⅱ组）、25%（试验Ⅲ组）的饲粮饲养,调查其生长性能及血清主要生化指标,结果显示：试验Ⅰ组新西兰白兔的日增体质量和70日龄体质量极显著高于对照组（P〈0.01）,料重比极显著低于对照组（P〈0.01）,整个试验期采食量差异不显著（P〉0.05）;各试验组新西兰白兔血清中的血糖、总胆固醇、总甘油三酯、尿素氮含量均显著低于对照组（P〈0.05）,而对照组血清中的总蛋白质含量与各试验组之间差异并不显著（P〉0.05）。研究结果表明,饲粮中添加桑叶粉对于新西兰白兔的生长性能和血清的几项主要生化指标有显著影响,且以15%～20%添加量的饲养效果最佳。

5-HT及电刺激对胃节律紊乱模型新西兰白兔胃电活动的影响

目的:观察5-HT及电刺激对胃节律紊乱模型新西兰白兔胃电活动的影响.方法:对以胰高血糖素造模的新西兰白兔胃节律紊乱模型采用外周注射5-HT、胃起步点起搏,电刺激室旁核和中缝大核(P7)的方法,四导胃浆膜电信号同步记录,分析胃体、及胃窦部胃电信号的平均频率,相位差,负相位比率,波形对应率,幅度等指标,考察5-HT及电刺激对胃节律紊乱模型新西兰白兔胃电活动的影响.结果:(1)胰高血糖素外周注射,胃体2频率加快(4.29±0.60→4.56±0.59,P=0.05),胃窦频率减慢(4.54±0.51→4.27±0.44,P=0.013),胃节律紊乱模型建立成功;(2)胃节律紊乱模型外周注射500μg5-HT后频率均加快(胃体1:4.06±0.45→4.25±0.37,P=0.031;胃体3:4.32±0.51→4.58±0.36,P=0.041;胃窦:4.54±0.47→4.73±0.44,P=0.017),波形对应率变好(胃体3:0.78±0.13→0.83±0.10,P=0.030);(3)胃节律紊乱模型胃起搏后频率均加快,胃体3(4.27±0.53→4.52±0.47,P=0.022);(4)胃节律紊乱模型室旁核电刺激能进一步减慢频率,胃体3(4.47±0.44→4.14±0.46,P=0.046)、胃窦(4.05±0.54→3.69±0.55,P=0.039)差异显著,胃窦负相位比率升高(0.32±0.19→0.40±0.19,P=0.046).单纯室旁核电刺激抑制胃电,进一步证实中枢存在"下行性抑制系统";(5)胃节律紊乱模型P7电刺激后胃窦频率减慢(4.31±0.44→3.86±0.47,P=0.012).结论:外周注射胰高血糖素后,胃节律紊乱模型建立成功.外周注射5-HT500μg或胃起步点起搏后节律趋向正常,浆膜胃电波形转好;室旁核和P7电刺激则进一步减慢胃电频率,可能是下行性抑制系统在发挥作用.

WHBE兔血气-电解质分析及与日本大耳白兔和新西兰白兔比较研究

目的探讨WHBE兔、日本大耳白兔和新西兰白兔血气、电解质指标的差异性。方法取WHBE兔、日本大耳白兔和新西兰白兔经耳中动脉取肝素抗凝血，在NOVA血气电解质分析仪上测定血气、电解质指标。结果与日本大耳白兔比较，WHBE兔pH值、PCO2、PO2、SO2、BE-ECF、BE-B、SBC、HCO3^-、TCO2、a／A和P02／FI11个指标均明显低于日本大耳白兔（P〈0．05，P〈0．01），而Osm、Na^＋和Mg^＋＋明显高于日本大耳白兔（P〈0．01）；与新西兰白兔比较，WHBE兔pH值明显低于新西兰白兔（P〈0．01）。而Mg^＋＋明显高于新西兰白兔（P〈0．01）。结论上述结果为WHBE兔标准化提供可靠的生物学数据，同时为WHBE兔在呼吸系统和心血管疾病中的应用提供了实验依据。

福建地方兔与新西兰白兔生长及屠宰性能比较

福建黄兔与黑毛福建兔（在龙岩市上杭县俗称通贤乌兔）都是福建省地方优良兔种,具有适应性广、抗病力强、繁殖率高、胴体品质好和药用功能强等优点,素有＂药膳兔＂之称,市场畅销,近年来在福建省的饲养量逐年上升。新西兰白兔是世界著名的中型肉兔品种,具有生长发育快、产肉性能好、饲料报酬高等特点。

新西兰白兔超数排卵试验研究

采用国产FSH和德国产PMSG对58只新西兰白兔进行超数排卵试验。结果表明:①两种激素均有较好的超数排卵效果,FSH组平均排卵点和平均回收胚胎数分别为28.5±18.0个、22.5±13.2枚;PMSG组分别为27.0±11.9个、23.6±9.8枚。经t检验,两者差异不显著(P>0.05),但从超排母兔回收胚胎的分布情况看,PMSG组的超排效果更稳定些。②右侧卵巢排卵数无论是FSH组(53.7%),还是PMSG组(50.5%)均高于左侧卵巢(分别为46.3%和49.5%),FSH组左、右侧卵巢排卵数差异极显著(P<0.01),PMSG组差异不显著(P>0.05)。③两种激素在春季对母兔的超排效果都明显地优于秋季(P<0.01)。

新西兰白兔选育研究

新西兰白兔原产于美国，由弗兰德兔、美国白兔和安哥拉兔杂交育成，是当代最著名的肉用品种之一，具有早期生长快、饲料报酬高、出栏早、繁殖性能好等优点。世界许多国家均有饲养，由于不同国家的选育目标不同，因而形成各自的特点。20世纪70年代该品种引入我国，目前许多省市均有饲养。近年来，各地外贸、畜牧部门多次从美国及其他国家引进该品种，每次引种数量从数百只到上千只不等，均需花费巨额外汇。但由于引种渠道不同，引入后有关部门缺乏系统的选育，致使引种通常达不到预期效果。

不同方式抽取的新西兰白兔骨髓中成纤维细胞集落形成单位数量差异观察

目的 观察不同方式抽取的新西兰白兔骨髓中成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)数量差异。方法通过计数在体外培养条件下定量接种骨髓的CFU-F克隆数量观察了新西兰白兔胫骨、股骨、坐骨上三个穿刺点抽取的骨髓中CFU-F在下述情况中的数量差异：1．同一部位分别抽取不同量骨髓(0．2m1、2m1、2ml、1m1)：2．同一部位前后两次(间隔一周)抽取同量骨髓(2m1)；3．不同性别；4．不同年龄(4-6个月、1-1．5岁、2．5-3岁)。结果1．与首次抽取骨髓(0．2m1)比较，各穿刺点第二次抽取的骨髓(2m1)CFU—F数量虽略有下降，但变化不明显，继续抽取骨髓(分别为2ml、1m1)其CFU—F值均比前一次抽取的骨髓明显下降。通过检测股骨上穿刺点每次抽取前的骨髓像变化证实这种现象是穿刺部位骨髓被外周血稀释的结果：2．胫骨骨髓中CFU-F数量略低于股骨和坐骨骨髓；，3．同一部位后次抽取的骨髓CFU-F数量明显低于前次；4．雄性兔骨髓CFU-F数量略低于雌性兔，但差异无显著性；5．上述三个年龄组骨髓中CFU-F数量无明显差异。结论在研究兔骨髓基质细胞时，若实验要求应用较为纯净的骨髓，抽取骨髓量应在2m1以内为宜或多处取材，避免短期内在同一部位重复取材。

新西兰白兔生长性状的遗传参数估计

【目的】对新西兰白兔不同生长日龄体重和平均日增重进行遗传分析。【方法】利用成都市爱华畜牧科技有限公司种兔场2011-2013年的生长性状记录，采用多性状动物模型约束性最大似然法（REML）对新西兰白兔35、42、56、70、84日龄的5个体重性状，35～42、42～56、56～70、70～84日龄的4个平均日增重性状进行遗传参数估计。【结果】结果表明，新西兰白兔35、42、56、70、84日龄体重的遗传力分别是0.63、0.46、0.43、0.42、0.39。各日龄间体重呈强正遗传相关，相邻日龄间的遗传相关较其他日龄间强。35～42、42～56、56～70、70～84日龄平均日增重的遗传力分别是0.30、0.36、0.31、0.21。4个平均日增重间呈弱遗传相关。【结论】为新西兰白兔育种方案的制定和选育工作提供了理论基础。

建立新西兰白兔后腔静脉血栓形成模型的研究

目的:探索一种新的家兔深静脉血栓形成模型的建立方法。方法:取新西兰白兔27只,随机分为血栓模型组18只,对照组9只。模型组家兔,通过不完全结扎加暂时性阻断后腔静脉血流的方法,建立深静脉血栓形成的动物模型;对照组仅开腹后行后腔静脉游离。于建模后48h、7d观察并行血管超声多普勒检查和病理学检测,并与对照组进行比较。结果:模型组家兔造模手术均顺利完成,手术成功率100%;1只家兔术后因腹泻死亡;超声及病理学检查均证实血栓形成确实、静脉壁组织变化明显。而对照组仅1只家兔静脉内少量附壁血栓形成、静脉壁变化不明显。结论:不全结扎加暂时性阻断法可建立一种稳定的家兔后腔静脉血栓形成模型,是作为静脉血栓性疾病研究理想的动物模型。