抗日本乙型脑炎病毒的线粒体靶向小分子化合物的筛选及鉴定

[目的]线粒体作为重要的能量代谢细胞器,不仅可以调控宿主先天免疫通路影响病毒复制,而且其生物学功能的改变与病毒生命周期密不可分。本文旨在确定抑制日本乙型脑炎病毒(JEV)的线粒体靶向化合物。[方法]通过体外CCK-8、间接免疫荧光、蛋白免疫印迹、RT-qPCR以及细胞因子检测等试验,对382种线粒体靶向化合物抗JEV的效果进行评价,筛选到的敏感药物在小鼠体内进行抗病毒效果验证。[结果]通过药物初筛,从382种药物中筛选出9种疑似抗JEV药物,进一步的体外分子试验筛选确定了其中3种药物对JEV复制有明显的抑制作用,分别为丙酮酸钠(sodium 2-oxopropanoate)、布喹那(brequinar)及松果菊苷(echinacoside)。动物试验结果表明,3种药物有效抑制了JEV在小鼠体内的增殖,给药组小鼠体重增加明显高于对照组,血液中的病毒含量更低,死亡率更低,细胞因子水平出现显著变化,其中以布喹那给药组最为明显。[结论]成功筛选出3种抗JEV的线粒体靶向化合物,为探究线粒体在病毒复制中发挥的作用提供了借鉴,也为抗JEV的临床药物研发提供了新思路。

日本乙型脑炎病毒的分离与鉴定

收集一例疑为乙型脑炎病毒感染的种公猪肿大的睾丸病料,并将其处理制成匀浆过滤后,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离病毒,然后设计一对PrM/E基因的特异性引物,采用RT-PCR方法对所分离的病毒进行鉴定,并将其PrM/E基因扩增产物测序,测序结果与乙型脑炎GenBank登陆的SA14-14-2株(AF315119)和SA14株(U14163)进行比较。结果表明,所分离病毒的PrM/E基因序列与JEV强毒株SA14和弱毒株SA14-14-2相应序列同源性分别为98.1%和97.1%,证实分离毒株为乙型脑炎病毒。

日本乙型脑炎病毒强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-NS2A诱导小鼠CD4^+T细胞应答的研究

为了解日本乙型脑炎病毒(JEV)强、弱毒株非结构蛋白的免疫效果,笔者分析了JEV强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表达的差异。通过观察JE减毒活疫苗(SA14-14-2株)和JEV贵州分离株(GZ株)分别在BHK-21细胞上出现的CPE,并收集强、弱毒株的细胞悬液,提取总RNA,分别设计6对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A的编码基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Aq和pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq,将构建成功的6种真核表达质粒免疫健康小鼠,最后采集小鼠的血液和组织分别进行JEV抗体检测和细胞免疫水平检测。研究结果显示:JEV GZ强毒株与JEV SA14-14-2弱毒株能在BHK21细胞上增殖并产生CPE现象;构建的6种真核表达质粒免疫小鼠后经血常规和T淋巴亚群检测可以极显著或显著增加CD4+和CD8+细胞的含量。表明JEV强毒株非结构蛋白所诱导的细胞免疫略优于弱毒株非结构蛋白诱导的细胞免疫,但差异不明显。本研究结果可为日本乙型脑炎病毒的病原基础研究提供参考。

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列。设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证。经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性。对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体。本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据。

日本乙型脑炎病毒贵州分离株NS1基因克隆及表达载体的构建

为了研究日本乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因工程疫苗、生物免疫活性及细胞因子IL-2对真核表达的影响,试验采用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株(GZ株)NS1 cDNA,克隆到pMD19-T载体上,再进行双酶切并回收目的片段,分别与pET32a(+)和pcDNA3.1(+)载体连接并转化入感受态细胞Top10中,构建原核表达载体pET32a(+)-NS1和真核表达载体pcDNA3.1(+)-NS1,并将NS1基因插入已经构建好的重组质粒pcDNA3.1(+)-IL-2上,构建以IL-2融合表达的真核载体pcDNA3.1(+)-IL-2-NS1,分别通过抽提阳性质粒酶切鉴定和测序后,应用DNAStar等生物软件进行序列分析,最后进行原核表达载体和真核表达载体双酶切及测序。结果表明:JEV GZ株NS1 cDNA全长为1 245 bp,可编码415个氨基酸。说明JEV GZ株NS1 cDNA克隆成功,JEV GZ株NS1基因的原核表达载体、真核表达载体以及IL-2融合表达的真核载体构建成功。

猪日本乙型脑炎病毒NS1基因重组腺病毒的构建及表达

应用RT-PCR方法扩增出猪日本乙型脑炎病毒(JEV)的NS1基因,通过SalⅠ+EcoRⅠ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEV的NS1。

单克隆抗体治疗日本乙型脑炎病毒感染恒河猴的实验研究

恒河猴感染日本乙型脑炎病毒(JEV)后,出现脑炎的一系列症状与体征,终因呼吸及循环衰竭而死亡。病毒感染猴体温升至39℃以上后的第2天,注射单克隆抗体(McAb)制剂进行治疗。结果McAb经肌肉、静脉、硬膜下加肌肉等不同途径注射后,均显示良好的疗效,对恒河猴的保护率达100％;其中以硬膜下加肌肉途径注射McAb的效果最佳。多次注射McAb,未发现任何不良反应与毒副作用;提示将鼠源性McAb用于灵长类安全可靠,若过渡到临床使用,是可行的。

日本乙型脑炎病毒NS1基因及其疫苗的研究进展

日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患传染病。乙型脑炎病毒的三种糖基化蛋白PrM、E和NS1是其主要免疫保护性抗原,其中PrM和E蛋白是日本乙型脑炎病毒的结构蛋白,其结构和相关疫苗研究的报道较多。NS1蛋白是日本乙型脑炎病毒的非结构蛋白,其主要参与病毒复制的早期阶段,推测可能参与病毒组装和释放。可诱导补体依赖性溶细胞反应,不能产生中和抗体,能诱发机体在非中和性抗体存在的情况下产生保护性免疫。在接种乙脑病毒的细胞的细胞内、细胞表面及上清液中均含有大量的NS1蛋白。对小鼠接种NS1蛋白或NS1蛋白特异性抗体,均能让小鼠产生对乙脑病毒感染的保护性免疫作用。本文主要就乙型脑炎病毒非结构基因NS1及其免疫疫苗的研究进展进行综述,为其更进一步深入研究JEVNS1基因及其相关疫苗奠定基础。

日本乙型脑炎病毒小鼠脑内分布研究

为定位检测日本乙型脑炎病毒(JEV)在试验小鼠脑内分布情况,本研究建立了JEV的小鼠感染模型,取发病死亡小鼠的脑组织制作石蜡切片,利用抗JEV单克隆抗体,采用免疫酶组化方法对抗原进行组织学定位检测。试验结果表明,所建立的间接免疫酶组化方法灵敏度高,特异性好,证明了JEV选择性感染神经元,抗原阳性表达主要集中在脑干、神经节及大脑皮质。

日本乙型脑炎病毒NS5rdrp蛋白的真核表达及鉴定

为了探究日本乙型脑炎病毒( Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机理和研制以 JEV 复制复合体为靶标的药物,试验以 GenBank 中收录的 JEV HW1 株基因序列为模板,设计针对 NS5rdrp 的特异性引物,提取 JEV RNA,反转录得到 cDNA,以其为模板使用 PCR方法克隆得到 NS5rdrp 基因片段;利用 T4DNA 连接酶构建重组质粒 pcDNA3. 1-NS5rdrp,并对产物测序;提取去除内毒素的重组质粒,用转染试剂 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 转染 BHK21 细胞,转染 24 h 后观察结果;最后利用 Western-blot 技术检测 NS5rarp 蛋白的表达情况。结果表明: PCR扩增得到大小约为920 bp的 NS5rdrp 基因片段;测序结果经 NCBI 上 BLAST 比对分析,克隆得到的 NS5rdrp 基因与 HW1 株的同源性为 100%;转染时细胞的最佳密度区间为 70%~ 80%,转染试剂与转染质粒的比例为 3 ∶ 1;经过Western-blot 检测,重组质粒在细胞内正常表达,NS5rdrp 蛋白的分子质量约为 37 ku。说明试验通过真核表达成功获得 NS5rdrp 蛋白。

日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究

日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患性传染病,日本乙型脑炎病毒的结构蛋白包括C、Pr M和E 3种。其中C蛋白主要参与病毒RNA和蛋白之间的相互作用,且具有核定位信号序列,在乙脑病毒中,缺失此序列后C蛋白只在感染细胞的细胞质中出现;PrM和E基因是其主要免疫保护性抗原基因,表达的蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白,是病毒颗粒的主要成分,也是维持病毒粒子形态结构的主要物质,主要参与病毒感染的后期阶段,可诱导产生保护性免疫。近年来许多学者对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因原核表达和真核表达及其相关免疫原性进行了大量的研究,取得了一定的研究进展,文章主要针对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究进展进行了综述,为乙型脑炎基因工程疫苗的进一步研究提供参考。

猪日本乙型脑炎病毒NS1基因的表达和抗体制备

猪Sus scrofa domestica日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是引起母猪繁殖机能障碍的重要病原之一,其NS1蛋白参与病毒复制和组装、调节宿主免疫反应功能。提取猪日本乙型脑炎上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增该病毒的NS1基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28（a）上,构建重组原核表达质粒pET-28（a）-JEV-NS1,转化大肠埃希菌Escherichia co1i BL21（DE3）菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS1蛋白,获得分子量大小为46 kDa的重组蛋白。为了提高表达量,JEV-NS1基因的958~1 245 bp被截短。聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明：JEV-NS1表达量明显提高,纯化后含量达到总蛋白的85%以上。纯化后的蛋白免疫ICR小鼠Mus musculus,制备了小鼠抗JEV-NS1多克隆抗体,western-blotting验证了JEV-NS1的抗原性和抗体的特异性。

牡丹江市某规模化猪场日本乙型脑炎病毒的RT-PCR检测

日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）．3L称乙型脑炎病毒，简称乙脑病毒，属于黄病毒科（Flaviridae）黄病毒属，所引起的疾病称为乙型脑炎或日本脑炎，是严重威胁人畜的一种急性传染病的季节性和一定的地理分布区域，多发生于蚊虫较多的夏秋季节，属于自然疫源性疾病。猪感染乙脑后土要表现为：潜伏期为3—4d，患病幼畜高热稽留，精神沉郁，步行踉跄，最后身躯麻痹而死；育肥猪持续高热：

日本乙型脑炎病毒NS3蛋白的真核表达及鉴定

为了探讨日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机制及其蛋白与宿主蛋白的相互作用关系,试验以GenBank中收录的JEV HW1株NS3基因序列为模板设计引物,经PCR扩增获得NS3基因序列后,采用ClonExpress克隆技术将NS3基因连接到真核表达载体p EGFP-C3上,将得到的产物pEGFP-C3-NS3送生工生物工程(上海)股份有限公司测序;使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent体外转染幼地鼠肾细胞(BHK21细胞),观察24 h后应用Western-blot和IFA法进行鉴定。结果表明:PCR克隆获得的基因片段大小约为1 370 bp,NS3基因片段与HW1株同源性为100%;BHK21细胞密度在70%~80%时质粒转染效果最佳,质粒质量与转染试剂体积的比例为1∶3;Western-blot鉴定融合蛋白成功表达,分子质量约为79 ku;IFA鉴定融合蛋白成功表达,24 h为转染高峰期,绿色荧光最强,pEGFP-C3-NS3与NS3阳性血清反应显红色荧光。说明在BHK21细胞中成功表达出NS3蛋白。

日本乙型脑炎病毒对猪外周血单核细胞炎性因子mRNA转录时相影响的研究

为分析猪日本乙型脑炎病毒(JEV)感染猪外周血单核细胞后对其促炎因子转录的影响,探讨JEV感染的分子免疫致病机制。采用real-time RT-PCR方法,测定并分析了JEV感染猪外周血单核细胞(PBMC)后病毒RNA含量及白细胞介素(IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-17、IL-18)炎性细胞因子mRNA转录时相的变化。结果显示,JEV感染猪PBMC后引起IL-8,IL-12p35和p40的分泌呈现不规则的曲线,IL-18表达量持续升高;IL-17表达量持续下降,仅在感染后48 h的时候达到峰值。以上结果表明,JEV感染PBMC可促使炎性因子分泌增加,参与细胞免疫应答。

猪日本乙型脑炎病毒NS5原核表达和多克隆抗体制备

提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.

日本乙型脑炎病毒GⅢ型标准品质粒的构建

目的构建检测日本乙型脑炎病毒(JEV)GⅢ型拷贝数的质粒标准品,利用该质粒标准品定量检测病毒的拷贝数。方法通过设计引物经反转录聚合酶链反应扩增JEV相对保守区序列(prM结构蛋白),得到的目的片段克隆连接到pMD19-T载体上,从而获得JEV质粒标准品。随后,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)得到质粒标准品的标准曲线方程以及对JEV患者血清中病毒拷贝数进行检测。结果构建的JEV质粒标准品的RT-qPCR结果显示:相同浓度复孔间Ct值差异小(<0.5),熔解曲线峰值单一。得到的标准曲线方程为y=-0.2889 x+11.516,R 2=0.993,乙脑患者血清样品原液及倍比稀释度的病毒拷贝数分别为1184130.27、120912.86、10736.84、1053.45、121.25 copies/μL。结论本研究成功构建了检测JEV的质粒标准品,通过RT-qPCR发现其具有稳定性好、灵敏度高等优点,可应用于JEV拷贝数的定量检测。

日本乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

采用日本乙型脑炎病毒单克隆抗体预包被酶标板，将纯化的日本乙型脑炎病毒（ JEV）作为检测用抗原，利用包被捕获法建立了用于检测猪乙型脑炎抗体的间接ELISA法。采用建立的ELISA法对50份已知阴性血清样本检测，临界OD450nm值为0．343，ELISA与IFA对200份血清进行平行检测，总符合率为92．9％，与商品化的同类国产试剂盒的符合率为95％。与其他常见的猪病毒阳性血清抗体无交叉反应，2～8℃保存12个月稳定。研制的ELISA抗体检测试剂盒为临床JEV血清抗体检测及其疫苗的免疫效果评价提供了技术手段。

猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展

日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是人兽共患病日本乙型脑炎的病原,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此,建立快速可靠的JEV检测方法,有利于及时检测JEV和采取措施防控日本乙型脑炎。本文总结了近年来检测JEV的新型方法,包括分子生物学检测、免疫学检测、生物传感器检测等技术,以期为有效诊断及防治JEV感染提供技术指导。

展示日本乙型脑炎病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒病毒样颗粒的制备

为增强日本乙型脑炎病毒表位疫苗的免疫原性,提高其免疫效果,将日本乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白中编码的B细胞表位(150～156aa,307～316aa,327～333aa,386～399aa)及T细胞表位(60～68aa,436～445aa)序列连接于猪细小病毒(PPV)VP2的5′端,并插入到原核表达质粒pCold-Ⅰ中,构建成重组质粒pMEP-VP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),使重组蛋白MEP-VP2得到表达。Western-blot分析表明,表达产物能被抗JEV多抗和抗PPV多抗识别。电镜观察显示,表达的重组蛋白MEP-VP2能够在体外自我组装成病毒样颗粒PPV-VLP(JEV)。结果表明,N端连接JEV的多表位肽的猪细小病毒的VP2蛋白能体外组装成有活性的病毒样颗粒。