黄鳝csf1r基因的克隆及时空表达特征分析

【目的】克隆黄鳝csf1r基因,并对其时空表达特性进行分析,为探明csf1r基因在黄鳝不同体色形成中的作用奠定基础。【方法】采用RACEs(Rapid-amplification of cDNA ends)技术从黄鳝皮肤cDNAs中克隆得到csf1r基因的全长cDNA序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测csf1r基因在黄鳝不同组织、不同发育时期胚胎或个体及3种体色黄鳝(黄黑斑鳝、碎花斑鳝和隐花斑鳝)皮肤和肾脏中的相对表达量,分析该基因的表达特征。测定3种体色黄鳝肝脏中的碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)。【结果】黄鳝csf1r cDNA序列全长为4430 bp(GenBank收录号:OP589303),其编码区长度为2937 bp,编码978个氨基酸,存在免疫球蛋白结构域和蛋白激酶催化结构域2个保守结构域。荧光定量PCR结果表明,csf1r基因在黄鳝脑、精巢、卵巢、肠、心脏、肾脏、肝脏、肌肉、皮肤和脾脏等组织中均有表达,在脾脏和心脏中表达量较高,其次是肾脏、皮肤和肌肉,卵巢中表达量最低;csf1r在胚胎眼晶体形成期开始大量表达,显微观察发现该时期胚胎的躯干上开始有色素颗粒出现。在3种体色黄鳝皮肤和肾脏中,csf1r基因在黄黑斑鳝的皮肤中表达量最低,而在其肾脏中表达量最高。3种体色黄鳝肝脏氧化应激指标测定结果发现,黄黑斑鳝肝脏中的碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力比其他2种体色黄鳝高,但是差异未达显著水平。【结论】csf1r基因可能不仅参与了黄鳝体色的形成,还与黄鳝非特异性免疫相关。

烟粉虱MED隐种14-3-3基因克隆及时空表达谱分析

【目的】真核生物中,14-3-3蛋白是一类可与多种蛋白互作的调节蛋白,能够参与信号转导、免疫反应、生长发育和胁迫响应等。本研究旨在克隆烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种的14-3-3基因的全长cDNA序列,了解该基因编码的蛋白特征和该基因的时空表达模式。【方法】使用RT-PCR技术克隆烟粉虱MED隐种的14-3-3基因全长cDNA序列,通过生物信息学软件和在线网站分析14-3-3基因的生物学特性;使用RT-qPCR测定14-3-3基因在烟粉虱MED隐种不同发育阶段(卵、1-4龄若虫和成虫)、雌雄成虫以及雌成虫头、胸和腹中的表达量。【结果】克隆并鉴定了烟粉虱MED隐种14-3-3基因的两个亚型:Bt14-3-3 epsilon(GenBank登录号:XM_019046102.1)和Bt14-3-3 zeta(GenBank登录号:XM_019057395.1),开放阅读框(ORFs)分别长771和744 bp,分别编码256和247个氨基酸,编码的蛋白是无跨膜螺旋区和信号肽的亲水性蛋白,其二级结构主要由α旋螺旋组成。系统发育树分析表明,Bt14-3-3 epsilon与褐飞虱Nilaparvata lugens、温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的14-3-3 epsilon聚为一支,同源性较高;Bt14-3-3 zeta与褐飞虱的14-3-3 zeta的亲缘关系更近。RT-qPCR结果表明,Bt14-3-3 epsilon和Bt14-3-3 zeta在烟粉虱MED隐种的卵、雌成虫和雌成虫腹部中的表达量较高。【结论】明确了烟粉虱MED隐种14-3-3基因的两个亚型的全长序列、编码蛋白特征及时空表达特点,为后续研究14-3-3蛋白的分子功能奠定了基础。

西方蜜蜂AmAGO1蛋白的分子特性、时空表达谱及抗体制备

【目的】Argonaute(AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera的AGO1(AmAGO1)理化性质和分子特性,解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱,并制备AmAGO1的多克隆抗体,为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。【方法】PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(coding sequence,CDS);通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性;利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1,2,6,12,15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量;构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白,并鉴定其表达形式;制备AmAGO1多克隆抗体,利用ELISA,Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS;AmAGO1含928个氨基酸,分子式为C4624H7332N1316O1325S51,分子量约为104.2 kD,等电点为9.31,平均亲水系数为-0.2965,含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域,但不存在典型的信号肽;AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A.cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的氨基酸序列一致性;西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支,同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异,3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量,而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量;AmAGO1在1,2,6,12,15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异,其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量;AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异,触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几,但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量;AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体;制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。【结论】AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白,含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域;AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能;成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。

斑马鱼角蛋白8基因克隆、组织分布及时空表达分析

研究旨在分析斑马鱼(Danio rerio)角蛋白8(Keratin 8,Krt8)基因的分子特性,组织分布及病原菌感染后的动态表达模式。通过克隆斑马鱼Krt8基因CDS序列,进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术,研究Krt8基因在健康斑马鱼肠道、肝脏、肾脏和皮肤组织中的表达分布,并分析了海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)感染后,在各组织中的时空表达模式。研究结果显示,斑马鱼Krt8基因CDS区序列编码一个含520个氨基酸的蛋白质,其分子量为57.76 kDa,且具有14个磷酸化位点。对构建的系统发育进化树分析表明,斑马鱼Krt8的氨基酸序列与安水金线鲃(Sinocyclocheilus anshuiensis)的亲缘关系最近。此外,Krt8基因在斑马鱼肠道、肝脏、肾脏和皮肤组织中均有分布,其中在肝脏中的表达水平最高。海藻希瓦氏菌感染后,Krt8基因在斑马鱼检测组织中呈现差异表达,其中在肠道中表达下调,在肝脏和肾脏组织中呈现先升高再下降的趋势。综上所述,斑马鱼Krt8可能参与海藻希瓦氏菌感染引起的机体免疫应答或病理生理过程,为进一步研究Krt8蛋白的功能和作用机理提供参考资料。

韭菜迟眼蕈蚊气味受体BodoOR71和BodoOR72基因时空表达分析

以韭菜迟眼蕈蚊的转录组数据为基础,通过RT-PCR克隆并获得韭菜迟眼蕈蚊的两个气味受体基因BodoOR71和BodoOR72的cDNA全长序列,对其序列及结构特征进行生物信息学分析,比较二者在韭菜迟眼蕈蚊不同发育时期及成虫不同组织中的表达量差异。序列分析发现,BodoOR71的开放阅读框(open reading frame,ORF)为759 bp,编码253个氨基酸,具有4个跨膜结构域;BodoOR72的ORF为954 bp,编码318个氨基酸,具有6个跨膜结构域。系统进化树结果表明,BodoOR71和BodoOR72与其他双翅目昆虫亲源关系较近,能够聚在一支。时空表达模式结果表明,BodoOR71在除雄成虫之外的不同虫态均有表达,且在雌成虫中的表达量最高,在雌成虫触角中的表达量显著高于其他组织,在雄成虫各组织中均不表达;BodoOR72在不同虫态均有表达,且在雄成虫中的表达量最高,在雄成虫触角中的表达量显著高于其他组织,在雌成虫各组织中微量表达。推测BodoOR71和BodoOR72可能参与韭菜迟眼蕈蚊嗅觉识别过程。

鳙goat基因序列特征及其时空表达模式分析

【目的】探究鳙的ghrelin O-acyltransferase(goat)基因序列特征及时空表达模式,解析goat基因的潜在生物学功能。【方法】通过RACE扩增得到goat基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR对其在早期发育阶段、各组织和冬夏季4个组织(脑、肠道、肌肉和肝脏)中的表达特征进行检测;结合原位杂交和免疫组化技术分别从基因和蛋白水平解析goat基因在肠组织中的分布特征,并通过实时荧光定量PCR评估goat基因及通路相关基因的共表达模式。【结果】鉴定得到goat基因cDNA序列全长2255 bp,开放阅读框(ORF)长1116 bp,共编码371个氨基酸残基。推导氨基酸序列含7个跨膜结构域,并包含参与催化的天冬酰胺(第251位)和组氨酸(第282位)。同源比对分析发现鳙GOAT氨基酸序列与鲤科鱼类相似度极高。鳙goat基因在早期孵化时和出膜后5 d的表达水平均显著高于其他时期(P<0.05,下同);成体组织差异表达分析发现goat基因在肠道中表达量最高;goat基因在夏季脑、肠道和肌肉组织的相对表达量均显著高于冬季。原位杂交试验结果显示goat基因在肠道中表达信号较强,且肠道切片的免疫组化试验显示肠黏膜中存在GOAT与GHRL共定位的阳性信号。goat基因与生长激素的合成、分泌和作用通路(ko04935)中相关基因存在共表达关系。【结论】goat基因具有MBOAT家族的典型结构特征,可能通过与摄食相关基因(ghrl等)协作来参与鳙摄食调控和生长代谢适应等生物学过程。

硫化氢信号对大白菜FLCs时空表达模式的调控作用

硫化氢(H_(2)S)是一种气体信号分子,可以促进植物的开花,且这一过程与开花的关键因子FLOWERING LOCUS C(FLC)有关。大白菜中已报道的FLC同源基因有4种。本研究对这4种FLC同源基因进行了时空表达模式和功能分化研究,以及H_(2)S对BrFLCs的表达模式的调控作用进行了探讨。结果表明:4种BrFLCs同源基因的表达表现出不同的时空特异性。其中,BrFLC 1、2和3的发育时期表达模式与拟南芥AtFLC相似,而BrFLC 5未表现出发育时期特异性。BrFLC 1只在叶中表达,而BrFLC 2在不同组织中均有表达,BrFLC 3在各组织中的表达量最高,但组织特异性差异不明显,BrFLC 5表达量不高且不具有组织特异性。经外源H_(2)S处理,BrFLCs表达略有下调,叶片中的BrFLC 2表达量最低。H_(2)S还能够不同程度地调节BrFLCs下游基因的表达,这可能和BrFLCs的表达模式改变有关。综上所述,H_(2)S可能通过调节大白菜中4个BrFLCs基因的表达模式影响其植株的开花时间。

日本医蛭摄食前后不同组织中水蛭素基因(hirudin)的时空表达模式

【目的】探究日本医蛭在不同摄食阶段、各个组织(唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精/卵巢)中水蛭素基因(hirudin)的时空表达模式,为水蛭药材的科学合理利用提供理论依据。【方法】基于水蛭唾液腺转录组数据筛选结果及基因克隆获得的水蛭素基因序列信息,利用实时荧光定量PCR方法,对水蛭关键活性成分的编码基因hirudin在不同摄食阶段、不同组织中的表达量进行检测分析,研究该基因的时空表达模式。【结果】水蛭素基因(hirudin)在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精/卵巢组织中均有表达,且在唾液腺中的表达量显著高于其他组织;Hirudin基因在不同摄食阶段的唾液腺组织中表达结果显示,摄食后第2天表达量显著升高,之后随着摄食时间的推延而呈下降趋势;Hirudin基因在嗉囊、肠中的表达量呈先升高后下降趋势,分别于摄食后第1、第2天达到最高,之后会随着停食时间延长呈下降趋势,尤其是在摄食后第7、第8天的表达量呈显著性降低;Hirudin基因在皮肤组织中也有表达,并随着停食时间的延长呈先升后降趋势,最高峰出现在摄食后第2天;在精/卵巢组织中,摄食期间hirudin基因的表达量最高,与其他摄食阶段的表达呈显著性差异。【结论】水蛭素基因(hirudin)在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤和精/卵巢组织中均有不同程度的表达,在唾液腺中的表达量显著高于其他组织。摄食行为及食物刺激可能影响水蛭素基因(hirudin)的表达,在不同摄食阶段的表达量存在显著差异。研究结果可为水蛭药材的科学采收加工、提取部位的科学选取、合理入药提供理论依据和技术支撑,对未来水蛭药材资源的可持续利用具有重要的参考价值。

转基因抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白的时空表达分析

玉米是我国最重要的粮食作物之一,虫害会造成严重的品质和产量损失,转Bacillus thuringiensis(Bt)基因抗虫玉米为玉米害虫的防治提供了新途径。转Bt基因抗虫玉米的抗虫性与外源杀虫蛋白表达量具有密切的关系,明确Bt杀虫蛋白在不同生育期和不同器官中的表达量,对害虫的综合防治和农业转基因生物安全管理具有重要意义。连续两年采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了9个地点种植的瑞丰125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量,对比分析了玉米拔节期(V6-V8)叶片、抽雄期(VT)雄穗、吐丝期(R1)叶片和花丝、成熟期(R4)叶片和籽粒的Bt杀虫蛋白含量,结果表明Bt杀虫蛋白表达量在不同玉米器官中差异较大。2年9个地点的数据整体上呈现出叶片中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较高,而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较低的规律。9个地点种植的瑞丰125的Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量有所差异,但差异整体较小。

龟纹瓢虫胰岛素信号通路AKT、MAPK、RPS6KB基因序列结构与时空表达模式分析

为明确龟纹瓢虫Propylea japonica胰岛素信号通路中AKT、MAPK和RPS6KB三个基因的序列结构和时空表达模式,基于龟纹瓢虫全基因组序列数据,选取AKT、MAPK和RPS6KB三个基因全长进行序列结构分析,蛋白序列结构分析发现其分别编码522、332和375个氨基酸。利用qRT-PCR检测其在龟纹瓢虫雌虫不同发育时期(羽化后1、3、5、7 d)、不同组织(头、胸、腹、肠)中的表达模式,结果显示AKT、MAPK和RPS6KB基因表达量均在龟纹瓢虫雌虫羽化第7 d显著上调,并达到最高水平;AKT在雌虫羽化第1 d和3 d高表达部位均为头部,第5 d和7 d高表达部位分别为肠道和胸部;MAPK基因在龟纹瓢虫雌虫羽化第1 d、3 d、5 d和7 d,头部表达水平均显著高于胸、腹和肠道;RPS6KB基因在其羽化后第1 d、3d、5d和7d,腹部表达水平均显著高于头、胸和肠道。AKT、MAPK、RPS6KB基因在龟纹瓢虫不同发育时期及不同组织中的表达量存在差异,为进一步研究胰岛素信号通路在龟纹瓢虫生殖发育中的作用奠定了基础。

三疣梭子蟹IAG基因结构及不同剪切体时空表达

【目的】分析三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)IAG(PtIAG)基因的结构及不同剪切体的时空表达模式,揭示其在性别分化中的功能及作用机制。【方法】基于NCBI数据库的甲壳动物IAG基因序列构建ML系统进化树。利用生物信息学软件对PtIAG基因的DNA结构及启动子区域进行分析。利用PCR技术对PtIAG基因进行可变剪切分析。利用qPCR技术对PtIAG基因进行时空表达分析。【结果】ML系统进化树显示,PtIAG基因与其他蟹类IAG基因的进化关系更近。PtIAG基因包含4个外显子和3个内含子,全长2615 bp。核心启动子位于起始密码子(ATG)上游2834 bp,启动子区域包括SOX-5、SOX-9、DSX等转录因子识别位点。PtIAG基因存在2种不同的转录本,其中PtIAG2为内含子保留型可变剪切转录本。qPCR结果显示,在幼体发育时期,PtIAG基因主要在溞状幼体Ⅰ期的雄蟹中表达;在成体组织中,PtIAG基因主要在促雄性腺中表达。【结论】PtIAG基因在三疣梭子蟹雄性分化及维持中具重要功能。

中华蜜蜂气味结合蛋白基因OBP4的分子特性及时空表达

气味结合蛋白OBPs在蜜蜂识别气味分子和生理反应的过程中起到了十分重要的作用。本研究通过利用生物信息学软件预测分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白基因OBP4(AcerOBP4)编码的蛋白理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻位相连法(Neighbor-joining,NJ)构建AcerOBP4及其它昆虫OBPs的系统发育树;通过qRT-PCR技术分析AcerOBP4在中华蜜蜂的哺育蜂、采集蜂和1日龄工蜂各组织的表达情况。结果表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂Apis melliferaOBP4(AmelOBP4)氨基酸同源性为78%,AcerOBP4在中华蜜蜂的触角表达量最高,其次是足和头部组织表明该基因与蜜蜂的嗅觉行为密切相关。此外,AcerOBP4在蜜蜂脑部有一定的表达,但是在腹部组织表达量很低。该研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为继续深入研究OBP4在中华蜜蜂中是否影响嗅觉行为提供了基础。

郁金香HKT1基因参与盐胁迫响应的时空表达模式分析

以郁金香盐敏感品种‘范思哲’为试材,通过水培试验分别设置胁迫处理(0.4 mol·L^(-1)NaCl)、对照(0 mol·L^(-1)NaCl),于胁迫后的0、4、8、12、24、48、72 h分别对郁金香的不同组织部位(根、鳞茎、地上茎、叶)进行取样,利用实时荧光定量PCR对4个组织在7个时间的HKT1基因时空差异表达水平进行分析,以期为探究HKT1基因在郁金香体内维持钾钠离子平衡的能力,进一步挖掘郁金香耐盐基因、完善郁金香耐盐机理提供参考依据。结果表明:郁金香在NaCl诱导下,随着盐胁迫的持续,HKT1基因在郁金香各组织中均有上调,但表达丰度不同,说明HKT1基因在各组织的响应进程存在差异,是郁金香盐胁迫过程中的差异表达基因。伴随着胁迫时间的增加,HKT1基因表达量在鳞茎、地上茎、叶组织中均呈现先上升后下降的趋势,而在根中通过持续高表达来维持体内钾钠离子的平衡,是郁金香响应盐胁迫最为敏感部位。HKT1基因是郁金香抵御盐胁迫相关的转录因子,其参与了郁金香对盐胁迫的调控过程。该研究发现郁金香HKT1基因时空表达模式,表明其在钾钠离子的选择性吸收过程中发挥着重要的作用,该研究结果可为后续郁金香耐盐机制的研究奠定基础,提供分子依据和有效的基因资源。

Bt玉米杀虫蛋白含量的时空表达及对亚洲玉米螟的杀虫效果

利用ELISA方法对2个转Cry1Ab基因抗虫玉米品种MON810和Bt11在不同生育期、不同组织器官中杀虫蛋白的表达量进行了分析,利用室内生测方法研究了不同组织器官对亚洲玉米螟初孵幼虫杀虫效果,并分析了杀虫蛋白表达量与杀虫效果的相关性。结果表明,Cry1Ab杀虫蛋白在Bt玉米MON810和Bt11的不同生育期和组织中的表达量呈明显的时空动态变化,以营养生长阶段的心叶组织表达最高,分别为1880.6和1473.1ng·g-1,生殖生长阶段的花粉含量最低,分别为52.3和73.3ng·g-1。随着叶片的生长,叶片中的杀虫蛋白含量明显下降,生殖生长阶段的各组织器官的杀虫蛋白的含量因组织而异。不同Bt玉米品种间同一组织器官的杀虫蛋白表达量也存在一定差异。室内生测结果表明,2个Bt玉米各组织对亚洲玉米螟初孵幼虫具有很好的杀虫效果,心叶、苞叶、雌穗尖和籽粒中Bt杀虫蛋白表达量及取食的幼虫死亡率呈显著正相关,但Bt11花丝以及MON810和Bt11的雄穗中Bt杀虫蛋白的含量与杀虫效果不一致,说明Bt玉米杀虫活性的表达还会受到其它一些因素的影响。

黄瓜cs-acs1g基因克隆及不同时空表达的研究

在cs-acs1g基因克隆的基础上进一步研究了此基因不同发育阶段表达状况,结果表明:没有经过生长素处理,cs-acs1g基因在苗期1～5片叶中不表达,与利用乙烯利、赤霉素等处理的材料效果相同,使用一定浓度生长素处理之后,此基因在两叶期开始表达,并且随着处理的次数增加而增加;cs-acs1g基因在黄瓜不同部位表达状况不同,在根尖、茎尖生长点表达强,在果实和腋芽中表达很弱.因此,黄瓜cs-acs1g基因存在不同时空表达的差异.

中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的克隆及时空表达

【目的】克隆获得中华蜜蜂(Apis cerana cerana)Acer OBP14基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织c DNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Acer OBP14 c DNA全长序列,并提交至Gen Bank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA5.2软件中的邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建Acer OBP14及其同源膜翅目昆虫OBPs的系统发育树;通过实时荧光定量PCR技术分析Acer OBP14在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中m RNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂气味结合蛋白基因Acer OBP14的c DNA序列(Gen Bank登录号为KT24648)。Acer OBP14的开放阅读框(ORF)长度为408 bp,编码135个氨基酸,预测其蛋白分子量为15.08 k D,理论等电点为5.44,有信号肽,无跨膜结构,且第18—127位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守结构域;存在多个比较明显的疏水区域,可能是脂溶性气味分子的结合位点;含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。亚细胞定位分析表明,Acer OBP14属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。Acer OBP14蛋白具有7个α螺旋,α1—α6属于典型OBPs核心螺旋,α7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比对结果显示,Acer OBP14与西方蜜蜂Amel OBP14的氨基酸序列一致性最高,达到86%;其次是大蜜蜂Ador GOBP56a-like,一致性为55%。系统进化树分析表明,同为蜜蜂属的中华蜜蜂Acer OBP14、西方蜜蜂Amel OBP14、大蜜蜂Ador GOBP56a-like、中华蜜蜂Acer OBP21和小蜜蜂Aflo GOBP56d-like聚为一个分支,切叶蜂属的苜蓿切叶蜂Mrot GOBP56a-like、侧沟茧蜂属的毁侧沟茧蜂Mdem GOBP83a-like、壁蜂属的角额壁蜂Ocor OBP3和熊蜂属的Bter GOBP56d-like和Bimp GOBP56d-like聚为另一大分支。荧光定量PCR结果显示,Acer OBP14在成蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,其表达程度有差异。1日龄工蜂的胸部表达量最高,触角次之,且两者均极显著高于头、腹、足和翅(P<0.01);其他日龄工蜂触角表达量均极显著高于其他组织(P<0.01),其中20日龄工蜂的触角表达量最高。从各组织在不同发育阶段的表达量来看,触角的表达量在1日龄最低,极显著地低于其他日龄(P<0.01);5、10日龄逐渐增加,15日龄突然下降,20日龄达到最高,极显著高于其他日龄(P<0.01);之后又呈逐渐下降趋势。头、胸、腹、足和翅膀表达量总体上随日龄增加而呈下降趋势,5日龄之后大幅下降,之后趋于平稳且呈低丰度表达。【结论】Acer OBP14属于Minus-C OBP亚家族,具有PBP-GOBP家族的典型结构;组织表达谱结果暗示,Acer OBP14属普通气味结合蛋白GOBP,在中华蜜蜂中除嗅觉识别之外还参与其他生理功能。

平榛冷适应相关基因CBF的克隆及时空表达特性分析

低温是影响植物分布、进而影响生长和产量的关键因素之一。Weiser（1970）指出低温导致植物的基因表达发生变化;早在20世纪90年代研究者就发现了植物的冷适应现象（Guyetal.,1985）。虽然迄今为止植物抗寒的分子机制还没完全清楚。

水稻花青素合成相关基因的时空表达研究

水稻花青素的生物合成受很多因素的影响,最根本的影响因素是结构基因和调控基因的表达水平不同,导致色素积累的差异性。本文通过半定量PCR方法研究一些结构基因和调节基因的时空表达差异性。发现OsPAL,OsCHS和OsCHI为花青素的基本表达基因,在叶片、茎、花期及花后1～2周的种子中均有表达。OsF3H,OsF3’H和OsDFR不在茎中表达,在叶片、花期和花后1～2周内均有表达,且在花后1～2周内,其表达量与时间成正比。OsANS在黑米和紫叶水稻的叶片和花中有少量表达,在花后1～2周内,仅在黑米中表达,且表达量与时间成正比。OsB1和OsB2特异性地在紫叶水稻的叶片中表达,OsC1也特异地在花期时表达。说明水稻不同部位的花青素积累受控于不同的基因,具有一定的时空表达特异性。

西花蓟马气味结合蛋白的cDNA克隆、序列分析及时空表达

【目的】鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)并对其序列特征及分布情况进行研究,为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并用MEGA6.0的邻接法(neighbor-joining)构建系统进化树,应用服务器Chou&Fasman预测蛋白的二级结构,通过实时荧光定量PCR检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克隆了一个西花蓟马气味结合蛋白基因,命名为Focc OBP1(Gen Bank登录号:KM527948);该基因c DNA序列全长660 bp,其中开放阅读框450 bp,编码149个氨基酸,3′端非编码区长172 bp,具有真核生物poly A加尾结构,5′末端非编码区长38 bp,预测成熟蛋白分子量为16.39 k D,等电点为7.46,N端有22个氨基酸组成的信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸位点特征,其排列方式为C1-X26-C2-X3-C3-X40-C4-X9-C5-X8-C6,符合典型OBP 6个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有3个亲脂性区域,第74—83位的氨基酸残基形成的亲脂性口袋尤为明显,可能是脂溶性气味分子的结合位点;Focc OBP1氨基酸序列与3个半翅目和10个同翅目昆虫OBP聚在同一分支,其中与绿盲蝽(Apolygus lucorum)的Aluc OBP8(Gen Bank登录号为AFJ54049.1)、苜蓿盲蝽(Adelphocoris lineolatus)的Alin OBP5(Gen Bank登录号为ACZ58031.1)、牧草盲蝽(Lygus lineolaris)的Llin OBP2(Gen Bank登录号为AHF71029.1)同源相似性最高,其次是棉蚜(Aphis gossypii)的Agos OBP7(Gen Bank登录号为AGE97637.1)、大豆蚜(Aphis glycines)的Agly OBP7(Gen Bank登录号为AHJ80893.1)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)的Rpad OBP7(Gen Bank登录号为AHL30243.1)等昆虫OBP,表明Focc OBP1与这些基因的亲缘关系也较近;经Focc OBP1蛋白的二级结构预测,Focc OBP1以α-螺旋为主,其次是β-折叠,转角含量较少;经不同发育阶段检测发现,Focc OBP1在西花蓟马若虫期和初羽化成虫期的表达量较高,且随成虫羽化后天数的延长表达量逐渐降低,在雌雄成虫间的表达量也有差异;在初羽化成虫的不同组织检测发现,Focc OBP1几乎在初羽化成虫触角中特异性表达;构建了重组表达质粒p ET-30a/Focc OBP1。【结论】明确了Focc OBP1的核苷酸、氨基酸序列特征,分析了该蛋白的二级结构特征,根据Focc OBP1在西花蓟马中的时空表达情况,推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、定位寄主植物、信息素合成或性行为方面扮演重要角色;成功构建了重组表达质粒p ET-30a/Focc OBP1,为下一步该蛋白表达纯化及其功能的深入研究打下了基础。

葡萄VvGA2ox1基因克隆、亚细胞定位及时空表达分析

以‘藤稔’葡萄(Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’)的花序、叶片和果实为试材,利用RT-PCR结合RACE技术,成功克隆了葡萄VvGA2ox1基因的cDNA序列,全长1 331 bp,共编码332个氨基酸。该基因在GenBank数据库的登录号为JQ608472。序列比对结果表明:VvGA2ox1与矮牵牛和棉花同源基因的氨基酸序列相似度分别为71.26%和71.08%。进一步构建了VvGA2ox1的亚细胞定位表达载体,定位结果显示,VvGA2ox1蛋白定位于细胞膜上。半定量RT-PCR与定量RT-PCR结果均表明,VvGA2ox1在葡萄花序、叶片和果实等器官中均有表达,但在花序、幼叶和小果中的表达水平较高。