暗纹东方鲀幼鱼体质量与形态性状的相关与通径分析

为了解暗纹东方鲀幼鱼形态性状与体质量之间的关系,随机选取40日龄暗纹东方鲀幼鱼328尾,测定其全长(X1)、体长(X2)、头长(X3)、吻长(X4)、口裂(X5)、眼间距(X6)、躯干长(X7)、体高(X8)、尾柄长(X9)、尾柄高(X10)10个形态性状和体质量(Y),利用相关分析和通径分析,研究了影响体质量的主要形态性状。结果表明,40日龄暗纹东方鲀幼鱼各形态性状与体质量的相关性,均达到了极显著水平(P<0.01),X1对体质量的直接作用,远大于其他形态性状,是影响体质量最主要的因素,X4、X5、X6、X7、X8和X9通过X1间接地对体质量产生了重要影响。暗纹东方鲀幼鱼形态性状对体质量的最优多元回归方程为:Y=-6.083+0.086X1+0.129X4+0.192X5+0.103X6+0.047X7+0.123X8+0.075X9(R2=0.882)。提出,在对暗纹东方鲀以体质量为目标进行选育时,可以全长为主,吻长、口裂、眼间距、躯干长、体高、尾柄长等其他形态性状为辅进行选择。

低温胁迫对暗纹东方鲀肠道氧化应激、细胞凋亡及肠道微生物组成的影响

为了探究低温胁迫对暗纹东方鲀肠道氧化应激、细胞凋亡及肠道微生物组成的影响,实验测定了3个处理温度(25、19和13℃),4个取样时间点(0、6、24和96 h)下氧化应激、细胞凋亡与肠道微生物相关指标。结果显示,与对照组相比,随着温度降低肠道绒毛发生坏死、增生和杯细胞肿大。总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)含量显著增加。肠道微生物组成多样性降低。肠道微生物丰度发生改变,如黄色杆菌属、副球菌属、乳球菌属和双歧杆菌属的丰度随温度降低而上升,梭菌属、气单胞菌属和嗜热芽孢杆菌属的丰度随温度上升而下降。细胞凋亡相关基因(caspase-3、caspase-7、caspase-9、p53、Bax和Bcl-2)的表达随温度降低升高。此外,实验发现副球菌属和嗜热芽孢杆菌属丰度的改变与肠道氧化应激、细胞凋亡均具有Pearson相关性,其可作为潜在微生物用来反映暗纹东方鲀是否处于氧化应激和细胞凋亡状态。本研究结果可为暗纹东方鲀健康养殖提供基础资料。

暗纹东方鲀TGF-β1基因的克隆、表达特征及生长性状相关SNP位点筛选

为探究暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)TGF-β1基因与其生长性状的关联及作用,采用RACE技术克隆了暗纹东方鲀TGF-β1基因,分析了其基因结构与表达特征,并通过直接PCR扩增法对TGF-β1基因进行多片段比对,在此基础上筛选出与生长性状相关的SNP位点。研究发现TGF-β1基因cDNA全长共2217 bp,包含5′UTR 51 bp,3′UTR 1014 bp,ORF 1152 bp,编码383个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,暗纹东方鲀TGF-β1基因与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)同源性最高(92.82%)。进化树分析表明,暗纹东方鲀TGF-β1基因编码氨基酸序列与红鳍东方鲀聚为一支,与鲈形目鱼类亲缘关系最近(68.46%~73.33%)。qRT-PCR检测显示,TGF-β1基因在暗纹东方鲀8种不同组织(心脏、肝脏、脑、脾脏、肾脏、肌肉、中肠和鳃)都有表达,其中肾脏表达量最高,心脏和脾脏表达量次之。通过SNP位点不同基因型与个体生长性状的相关性分析,发现TGF-β1上的SNP g.3908 C>A位点与暗纹东方鲀多项生长性状有关,其中CC型是优势基因型,且CC型个体体宽、肥满度较高。研究结果证实TGF-β1基因与暗纹东方鲀生长性状有一定的相关性,可为暗纹东方鲀分子标记辅助育种提供基础资料。

暗纹东方鲀肠上皮细胞体外培养方法的建立及皮质醇对其生理生化的影响

应激反应对暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)养殖业危害极大,而皮质醇(cortisol)是判断鱼类应激反应的重要标志物。肠道是鱼体与外界环境接触的媒介,肠道生理状态能反映鱼体的应激水平,但目前肠道在鱼类响应应激反应中的作用不详。本研究以暗纹东方鲀肠上皮细胞为对象,分别采用胰蛋白酶和DMEM培养基、胰蛋白酶和1640培养基、Ⅰ型胶原酶和DMEM培养基、Ⅰ型胶原酶和1640培养基4种方法对其进行原代培养,旨在建立暗纹东方鲀原代肠上皮细胞体外培养方法,并在此基础上探讨皮质醇对暗纹东方鲀肠上皮细胞氧化应激、细胞凋亡和脂代谢的影响。利用CCK-8法检测肠上皮细胞活力,透射电镜观察皮质醇处理后细胞内线粒体的形态结构,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测氧化应激相关基因、细胞凋亡相关基因及脂代谢相关基因在肠上皮细胞内的表达模式,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡等。结果显示,在4种培养方法中,采用胰蛋白酶消化和DMEM培养基进行培养的肠上皮细胞增殖率最高,贴壁情况最佳;与对照组相比,当皮质醇浓度高于2 000 nmol/L时,肠上皮细胞活力显著下降(P<0.05);透射电镜显示,所有皮质醇处理组肠上皮细胞内线粒体结构发生改变,线粒体数量增加;随皮质醇处理浓度的升高,肠上皮细胞内氧化应激相关基因(sod、cat和gsh-px)及促凋亡基因(caspase-3、caspa-se7、caspase-9、bax和p53)表达量和凋亡指数均显著上升,抗凋亡基因bcl-2表达量显著下降(P<0.05);脂肪合成相关基因(g6pd、6gpd、pparγ、fas和acc)表达量显著下降,脂肪分解相关基因(hsl、ppara、lpl和cpt-1)表达量显著上升(P<0.05);甘油三酯和总胆固醇含量显著下降,游离脂肪酸含量显著上升(P<0.05)。结果表明,皮质醇能够促进暗纹东方鲀肠上皮细胞的氧化应激和细胞凋亡,同时促进脂肪的分解并抑制脂肪的合成。本研究以期为暗纹东方鲀抗应激养殖提供一定的参考资料。

不同饵料形态对暗纹东方鲀幼鱼生长的影响

为探索提升暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)幼鱼养殖技术,开展了饲料形态对暗纹东方鲀幼鱼生长影响的相关研究。将同一种粉状配合饲料,制成团状和软颗粒2种形态,对比研究其对暗纹东方鲀幼鱼(0.680±0.007)g生长的影响。经过30 d的养殖,结果表明,团状饲料组的相对增重率、特定生长率分别达到了(309.47±3.00)%和(2.04±0.01)%·d^(-1),饲料效率为(80.92±2.06)%,存活率为(64.29±2.02)%,显著高于软颗粒沉性饲料组(P<0.05),团状饲料组的水质较稳定,说明团状饲料为暗纹东方鲀幼鱼更适宜的饲料形态。研究结果可为开发高品质暗纹东方鲀幼鱼饲料提供参考。

暗纹东方鲀1龄鱼种与南美白对虾池塘混养技术研究

根据暗纹东方鲀和南美白对虾的生物学特性,在暗纹东方鲀1龄鱼种池塘混养南美白对虾,暗纹东方鲀1龄鱼种(鱼苗规格150尾/kg,全长4.0 cm/尾)放养密度7.5万尾/hm^(2),南美白对虾苗(全长0.9~1.0 cm/尾)放养密度30.0万尾/hm^(2)。至当年底,可收获暗纹东方鲀1龄鱼种7540.5 kg/hm^(2)(平均规格104.3 g/尾),成活率达96.4%;收获南美白对虾2346.0 kg/hm^(2)(70尾/kg)。与暗纹东方鲀1龄鱼种池塘单养相比较,混养模式的养成规格、产量、成活率等没有明显差异,在生产成本没有明显增加的情况下,取得了较好的经济效益,具有较强的推广价值。

饲料中添加壳聚糖和益生菌对暗纹东方鲀幼鱼生长及部分消化酶活性的影响

在基础饲料中分别添加不同浓度的益生菌(0.1%、0.2%、0.4%)、壳聚糖(0.2%、0.5%、1.0%)、壳聚糖与益生菌混合物、甘露聚糖与益生菌混合物,在室内水泥池(5.0m×2.0m×1.0m)中喂养暗纹东方鲀幼鱼(3.15±0.05g),用基础饲料投喂暗纹东方鲀作为对照,每组三个重复,60d后测定鱼体的生长、肌肉生化成分、肝胰脏、肠道蛋白酶和淀粉酶活性和白肌RNA/DNA。结果显示,对照组相对增重率为476.4%,饲料中添加0.2%的壳聚糖、0.1%的益生菌对暗纹东方鲀的促生长作用最明显,相对增重率显著提高。壳聚糖与益生菌混合物、甘露聚糖与益生菌混合物对生长无显著影响。对照组肌肉蛋白质和脂肪含量分别为82.94%、11.21%,壳聚糖、益生菌与甘露聚糖在饲料中的添加,能够显著降低肌肉脂肪含量,显著提高肌肉蛋白质含量,也能在一定程度上降低肝体比。0.2%壳聚糖和0.1%益生菌能使肠道淀粉酶活性显著增强(P<0.05),白肌RNA/DNA显著增大(P<0.05),说明肠道淀粉酶活性增强和蛋白质合成增加是壳聚糖和益生菌促进暗纹东方鲀生长的重要原因。

暗纹东方鲀线粒体COI及其侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

以暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)肝脏的线粒体DNA为模板,按照红鳍东方鲀线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,克隆并测定了线粒体细胞色素氧化酶I亚基(COI)及其侧翼tRNA基因的全序列,结果显示,克隆了暗纹东方鲀COI基因1 546 bp及其5′端上游的tRNATyr基因和3′端下游的tRNASer基因序列共1 766 bp。用DNA分析软件对暗纹东方鲀与GenBank中10个目14种鱼类的COI序列进行比较分析,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的COI基因具有较高的同源性,与同属红鳍东方鲀的同源性最高为97.6%,与同目不同科的矛尾翻车鲀和翻车鲀的同源性为76.5%和75.4%。根据暗纹东方鲀与其他1 314种鱼的COI基因序列同源性所建立的进化树,与传统的分类地位基本吻合。推定的这两种tRNA的二级结构都具有典型的三叶草型结构。

饲料糊精水平对暗纹东方鲀幼鱼生长、消化酶活性和血液生化指标的影响

配制等蛋白质(42%),等脂肪(9%),糊精水平分别为10%、15%、20%、25%、30%的5组饲料,饲养暗纹东方鲀幼鱼[初始体质量为(10.25±0.51)g]60 d,考察饲料中不同糊精水平对其生长、消化酶活性和血液生化指标的影响。结果发现,随着饲料糊精水平的升高,暗纹东方鲀幼鱼的特定生长率和饲料效率先增加后降低,25%组最高,并显著高于10%和15%组。30%组鱼的脏体比和肝体比显著高于10%组,同时其肝脂肪含量也显著高于其他组。10%组的肝糖原和血浆总氨基酸含量显著低于其他组。10%和15%组鱼的肝胰脏和肠道中淀粉酶活性显著低于其他实验组,而其肝胰脏中胰蛋白酶活性显著高于30%组。25%和30%组的血浆总胆固醇和甘油三酯含量显著高于10%和15%组。10%和15%组的血浆尿素氮含量显著高于其他实验组。15%和20%组的血细胞数量显著高于其他实验组。30%组的细胞凋亡率及细胞内活性氧(ROS)和钙离子(Ca2+)含量显著高于其他实验组。饲料糊精水平对暗纹东方鲀幼鱼的血糖含量、血浆谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性及肝胰脏和肠道中脂肪酶活性无显著影响。在本实验条件下,暗纹东方鲀幼鱼饲料中糊精的适宜水平为20%～25%。

壳聚糖和益生菌对暗纹东方鲀抗病力和免疫功能的影响(英文)

为了解壳聚糖和益生菌刺激和增强免疫应答的可能作用,本试验在基础饲料中添加0.2%、0.5%、1.0%的壳聚糖,0.1%、0.2%、0.4%的益生菌,甘露聚糖与益生菌混合物,壳聚糖与益生菌的混合物,在室内水泥池中喂养暗纹东方鲀(3.15±0.05)g 2个月,根据抗菌活力筛选出免疫增强饲料组(0.2%壳聚糖,0.1%、益生菌,甘露聚糖与益生菌混合物,壳聚糖与益生菌混合物)测定免疫功能。结果表明,甘露聚糖与益生菌混合物仅提高头肾T淋巴细胞转化,壳聚糖与益生菌混合物显著增强头肾T、B淋巴细胞转化和脾脏B淋巴细胞体外培养时分泌的IgM。筛选出的四种免疫增强饲料均能使头肾B淋巴细胞体外培养时分泌的IgM显著增加。无论是脾脏B淋巴细胞还是头肾B淋巴细胞,体外培养时所分泌的IFN-α都不同程度地受抑制。

非离子氨氮和亚硝酸盐氮对暗纹东方鲀稚鱼的急性毒性试验

在水温21~23℃,pH 8.2~8.5,溶解氧6.00~7.50mg/L的条件下,采用半静水法研究了非离子氨氮和亚硝酸盐氮对全长（1.6±0.2）cm、体质量为（0.11±0.05）g的暗纹东方鲀稚鱼的急性毒性效应。试验结果表明,暗纹东方鲀稚鱼受到非离子氨氮和亚硝酸盐氮胁迫后,先后出现鱼体体色变白、扭曲、侧游、失去平衡、昏迷等中毒症状。随着非离子氨氮和亚硝酸盐氮质量浓度的提高和胁迫时间的延长,暗纹东方鲀稚鱼死亡率逐渐升高,存在明显的剂量效应和时间效应关系。非离子氨氮和亚硝酸盐氮对暗纹东方鲀稚鱼96h半致死质量浓度分别为0.46mg/L（95%置信限0.34~0.64mg/L）和290.12mg/L（95%置信限255.16~329.87mg/L）,安全质量浓度分别为0.046 mg/L和29.01mg/L。非离子氨氮和亚硝酸盐氮对暗纹东方鲀稚鱼具有一定毒性,且非离子氨氮毒性大于亚硝酸盐氮毒性。

暗纹东方鲀线粒体COⅡ及两侧tRNA基因的克隆和序列分析

用细胞色素氧化酶第二亚基基因(COⅡ)特异性引物对暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)的线粒体DNA(mtDNA)进行PCR扩增,克隆并测定了COⅡ及其侧翼tRNA基因的全序列,结果显示,COⅡ基因691 bp和5'端上游的tRNAAsn基因及3'端下游的tRNALys基因序列共890 bp.用DNA分析软件比较暗纹东方鲀与GenBank中9个目11种鱼类的COⅡ序列,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的COⅡ基因具有较高的同源性;其中与同属红鳍东方鲀(T.rubripes)的同源性最高为99.0%.暗纹东方鲀COⅡ基因的核苷酸组成中,A+T含量为56%,与其他11种鱼类的A+T含量(55%～62%)相近.鱼类COⅡ序列组成对A+T核苷酸的偏倚程度比较低.根据暗纹东方鲀与其他11种鱼的COⅡ基因序列同源性所建立的分子进化树,与传统的分类地位基本吻合.推定的tRNA二级结构为典型的三叶草型结构.

同时蒸馏萃取-气质联用分析养殖暗纹东方鲀肉中的挥发性成分

分别以二氯甲烷和乙醚作溶剂,同时蒸馏萃取(SDE)养殖暗纹东方鲀肉中的挥发性成分,结合气质联用(GC-MS)对挥发性成分进行定性,以2,4,6-三甲基吡啶内标定量分析,并结合主成分分析法(PCA)对挥发性成分进行数据挖掘。结果表明:乙醚为溶剂时,总共鉴定到了57种成分,含量较高的是十四醛(4 963.71ng/g)、十八醛(1 171.51ng/g)、(Z)-13-十八醛(2 007.21ng/g)、乙酸乙酯(1 148.44ng/g)、十六酸(4 639.90ng/g)等;以二氯甲烷为溶剂时,总共鉴定到了78种成分,主要是十六醛(2 381.77ng/g)、2,3-丁二酮(1 267.40ng/g)、十六酸(545.08ng/g)等。比较得出,二氯甲烷溶剂在定性方面有优势,乙醚溶剂在定量方面效果较好。2种溶剂萃取一共检测出96种化合物,其中醛类29种、酮类11种、醇类16种、含氮含硫及杂环类化合物22种、酯类7种、酸类3种、烷烃类8种。

3种水产消毒剂对暗纹东方鲀稚鱼的急性毒性试验

在水温21~23℃,pH 8.20~8.50,溶解氧6.00~7.50mg/L条件下,采用半静水法研究了苯扎溴铵、戊二醛和聚维酮碘对全长（1.73±0.32）cm、体质量（0.19±0.01）g暗纹东方鲀稚鱼的急性毒性效应。试验结果表明,苯扎溴铵对暗纹东方鲀稚鱼24、48、72h和96h半致死质量浓度分别为1.04、0.95、0.72mg/L和0.53mg/L;戊二醛对暗纹东方鲀稚鱼24、48、72h和96h半致死质量浓度分别为4.27、3.55、2.94mg/L和2.40mg/L;聚维酮碘对暗纹东方鲀稚鱼24、48、72h和96h半致死质量浓度分别为269.80、200.00、158.54mg/L和151.09mg/L。苯扎溴铵、戊二醛和聚维酮碘对暗纹东方鲀安全质量浓度分别为0.24、0.74mg/L和32.97mg/L,均高于其厂家推荐使用质量浓度,可以在暗纹东方鲀生产中使用。但暗纹东方鲀对苯扎溴铵和戊二醛较为敏感,在生产过程中应严格控制使用质量浓度。

养殖型暗纹东方鲀生长与发育特性

观测养殖型暗纹东方鲀,获得4个年龄组的生长数据和解剖资料。拟合出雌、雄的体长体重关系和生长方程,分析其肥满度、胸腹围特点以及性腺和肝脏发育特点。结果显示,养殖型暗纹东方鲀雌雄体长生长规律相似;但体重在2.5龄前雄鱼生长速度大于雌鱼,2.5龄后则相反。养殖暗纹东方鲀体型比野生暗纹东方鲀肥胖,体重/体长和肥满度皆大于野生型。研究还发现,养殖暗纹东方鲀性腺发育不良和肝脏脂肪变性发生率高,且两者的发生存在一定关系,致使全人工育成的成鱼繁殖难以成功。

利用PCR-DGGE法分析暗纹东方鲀的弧菌菌落组成

采用16S rDNA特征序列PCR-DGGE法,分析了不同饵料饲养的暗纹东方的表皮、性腺和肠道中,以弧菌为主的细菌群落的组成。结果表明:(1)共鉴定出暗纹东方体内18种微生物,均归属于变形细菌的gamma亚群,其中13种为弧菌科细菌,3种为肠杆菌科细菌,2种为气单胞菌属细菌;(2)投喂鲜活鱼虾的与投喂人工配合饲料的暗纹东方肠道和性腺中的细菌组成是不同的,在性腺中分离到的所有12种细菌中,只有2种细菌是相同的,约占17%;在肠道中分离到的所有13种细菌中,有4种是相同的,约占31%。而在表皮上所分离到的11种细菌中,有7种细菌是相同的,约占64%;(3)DGGE特征条带V1、V13、V18、V14和V17所代表的细菌只在表皮组织被分离到,V6所代表的细菌仅出现在以鲜活鱼虾作为饵料的暗纹东方性腺中,V5所代表的细菌仅出现在以鲜活鱼虾作为饵料的暗纹东方肠道中;(4)DGGE特征条带V5、V8、V13、V18、V6、V14和V17所代表的细菌不能在TCBS培养基上培养,占18种被鉴定的细菌总数的39%。

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。

暗纹东方鲀脂肪肝并发诺卡氏菌病

对濒死暗纹东方鲀进行了常规临床检查、细菌分离鉴定、药敏试验和组织病理学观察,综合临床研究和治疗结果,认为暗纹东方鲀死亡原因是严重脂肪肝并发诺卡氏菌感染。分离菌株属于诺卡氏菌属,但对小鼠和暗纹东方鲀致病力不强。分离菌株对诺氟沙星、氧氟沙星、新霉素、阿米卡星等敏感,但对磺胺类和四环素类有耐药性,且容易形成对氨苄青霉素的耐药性。肝胰脏表现为严重脂肪肝和小的肉芽肿。肾脏表现为肾小管上皮细胞变性坏死并同基底膜分离,肾小管内有细胞管型和蛋白管型。消化道黏膜脱落,淋巴细胞浸润。

暗纹东方鲀年龄鉴定的研究

用耳石、脊椎骨、鳃盖骨等识别和鉴定暗纹东方鲀(Takifugu obscurusAbe)的年龄,在描述其轮纹特征基础上,比较其在判读暗纹东方鲀年龄和生长特征上的异同与准确性。结果表明,耳石磨片上的轮纹特征明显、清晰且规律性强,是最好的年龄鉴定材料;脊椎骨轮纹也很清晰,但测量时有一定难度,也是较好的年龄鉴定材料;鳃盖骨上年轮较难判定,只能作为辅助材料。本文还对牙齿能否作为年龄鉴定材料进行了观测。

不同盐度预处理后Ⅰ龄暗纹东方鲀的摄食、生长和饲料利用

通过 4周的生长实验 ,研究了Ⅰ龄暗纹东方 (82 35± 2 97g)在不同盐度预处理后的摄食、生长和饲料利用情况。结果显示 :35‰的预处理盐度对暗纹东方的生长有抑制作用 ,当这种盐度胁迫解除后 ,暗纹东方的生长表现出明显的补偿现象。本实验中摄食率随前处理盐度的升高而增加 ,变化范围为 1 83%— 2 5 1% ,特定生长率亦随前处理盐度增加而增加 ,即由 0 83%增加到 1 2 8% ,饵料系数则随前期盐度实验中盐度的增加而降低 ,由 1 6 7降至 1 4 7。在盐度预处理实验及淡化养殖条件下的特定生长率除 8‰外有显著差异。