Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞的提取与鉴别

背景:树突状细胞在未成熟阶段表现出极强的抗原吞噬功能,它可以在免疫耐受、癌症的免疫治疗等方面都表现出极大的优越性。但由于未成熟树突状细胞在生物体内含量极微,这就严重限制了它在临床、科研方面的应用。目的:提取鉴别Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞。方法:从Lewis大鼠骨髓中分离骨髓前体细胞,应用20 ng/mL粒细胞集落刺激因子、10 ng/mL白细胞介素4培养7 d诱导为未成熟树突状细胞,然后在未成熟树突状细胞中加入1μg/mL脂多糖继续培养2 d诱导为成熟树突状细胞。采用荧光倒置显微镜观察树突状细胞形态,流式细胞仪鉴定成熟和未成熟树突状细胞表面特异性分子,ELISA检测成熟和未成熟树突状细胞培养上清白细胞介素10、白细胞介素12和白细胞介素17A因子的分泌水平,混合淋巴细胞反应检测成熟和未成熟树突状细胞对T淋巴细胞的刺激反应。结果与结论:①普通荧光倒置显微镜下观察树突状细胞具有明显的突起结构;②流式细胞仪可见未成熟树突状细胞低表达CD40、CD86等共刺激分子;相反,成熟树突状细胞高表达上述共刺激分子;③未成熟树突状细胞的白细胞介素10、白细胞介素17A分泌水平要远高于成熟树突状细胞(P<0.01);未成熟树突状细胞的白细胞介素12分泌水平低于成熟树突状细胞(P<0.05);④成熟树突状细胞对T细胞的刺激明显比成熟树突状细胞强,当成熟树突状细胞与T淋巴细胞比例达到1∶10时刺激能力更强;⑤结果表明:Lewis大鼠骨髓前体细胞可以分化为树突状细胞,通过流式细胞鉴定、相关因子检测、混合淋巴细胞反应能够鉴别树突状细胞的成熟和未成熟状态。

羟基磷灰石表面台阶结构对未成熟树突状细胞黏附和mRNA表达谱的影响

目的羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)在骨缺损修复和植入材料界面修饰等方面具有重要的临床应用价值,但其植入后存在着引起慢性炎症和周围组织纤维化的风险。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是免疫过程中最强大的抗原提呈细胞,对适应性免疫应答的启动起着重要作用,是调控慢性炎症反应的关键。已有研究表明,生物材料的表面结构是影响DCs表型和免疫学功能的重要因素。因此,本研究旨在构建HA表面台阶结构,并研究其对未成熟树突状细胞(immature DCs,im DCs)的细胞骨架、黏附形态以及m RNA表达谱的影响,以期挖掘出im DCs响应台阶结构的信号转导机制,为优化HA材料的表面结构设计提供一定的理论依据。方法利用取向连接生长原理制备出具有台阶结构的HA片材,并以表面光滑的HA片材作为对照。用im DCs和不同表面结构的HA片材构建细胞培养模型,通过免疫荧光染色分析im DCs细胞骨架和黏附形态的变化。此外,采用转录组测序分析im DCs的m RNA表达谱的变化。结果HA表面台阶结构的暴露会增加im DCs的铺展面积,影响细胞黏附形态。转录组测序分析显示差异基因主要富集到黏着斑信号通路、趋化因子信号通路、IL-17信号通路等。结论台阶结构可能通过黏着斑信号通路、趋化因子信号通路、IL-17信号通路影响im DCs的免疫学功能。

微丝骨架结合蛋白在未成熟树突状细胞抗原吞噬过程中的差异表达分析

目的探讨未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs)发挥抗原吞噬功能时关键微丝骨架结合蛋白(microfilament cytoskeleton-binding proteins,MCBPs)的差异表达情况。方法从健康人外周血中分离单核细胞(monocytes,MOs),经重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rhGM-CSF)、重组人白介素-4(recombinant human interleukin-4,rhIL-4)诱导培养6天获得imDCs;将imDCs与低分子量(40 kDa)和高分子量(150 kDa)的右旋糖酐分别孵育1、3和6 h,流式细胞仪检测imDCs吞噬右旋糖酐的比率及免疫表型分子的表达;免疫荧光检测丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)及PFN1、WASP、α-actinin在细胞中的定位情况;qPCR和Western blotting分别检测MCBPs在mRNA和蛋白水平的表达差异;最后,基于系统生物学算法中的逐步回归和主成分分析方法筛选成分系数最大的MCBPs。结果在吞噬抗原的过程中,imDCs对低分子量抗原的吞噬速度更快,吞噬时长可维持约3 h,其细胞表型和细胞形态逐渐向mDCs分化,且F-actin发生明显的重塑,PFN1、CDM、WASP、CAPZB、Filamin A、α-actinin等MCBPs的表达下调,WAVE1、Arp2/3复合体、Fascin的表达上调;信号蛋白Rac1的mRNA表达上调,CDC42和RhoA的mRNA表达下调;免疫荧光结果显示,PFN1、WASP、α-actinin在imDCs吞噬抗原过程中发生转位;逐步回归和主成分分析结果显示PFN1的成分系数最大。结论PFN1可能是imDCs吞噬抗原过程中的关键MCBPs,这对于深入理解imDCs细胞骨架结构变化与免疫学功能之间的关系具有重要意义。

乳酸对小鼠未成熟树突状细胞影响的基因芯片分析

研究乳酸对小鼠未成熟树突状细胞(imDCs)基因组表达水平的影响,为深入研究病理酸性微环境对imDCs免疫功能影响的分子机制提供前期数据。从C57BL/6J小鼠骨髓中分离单核细胞,并诱导其分化为imDCs。20 mmol/L浓度乳酸处理imDCs 24 h,利用BGISEQ平台进行基因芯片分析,筛选出差异表达基因。结果显示,20 mmol/L浓度乳酸处理使imDCs中表达发生变化的基因有915个。通过基因本体论(GO)分析发现差异表达基因参与细胞骨架、凋亡过程及免疫反应等;京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析发现差异表达基因涉及的信号通路包括MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路及TOLL样受体信号通路等。利用Cytoscape软件构建差异表达蛋白之间的互作网络图,并根据节点数筛选关键差异表达蛋白。筛选出分化抗原簇38(CD38)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)等上调关键差异表达蛋白和信号转导和趋化因子受体7(CCR7)、转录激活因子1(STAT1)等下调关键差异表达蛋白。

未成熟树突状细胞诱导异基因嵌合体的形成

目的：证实供体来源的未成熟树突状细胞（ｉｍＤＣｓ）主动免疫受体小鼠后可诱导形成异基因嵌合体。方法：应用供体（Ｃ５７ＢＬ／６）来源的骨髓细胞在体外培养出ｉｍＤＣｓ，灭活后静脉输注受体小鼠（ＢＡＬＢ／ｃ），并于输注后不同时间输注供体来源的骨髓细胞，检测异基因嵌合体的形成。同时比较ｉｍＤＣｓ一次免疫与多次免疫对诱导嵌合体形成的影响。结果：在ｉｍＤＣｓ免疫后３ｄ输注骨髓细胞可诱导异基因嵌合体的形成，并持续１００ｄ以上；在免疫后５ｄ注射骨髓细胞只能形成短暂的（＜２１ｄ）、低水平（＜１％）的嵌合状态；７ｄ后则完全不能形成嵌合。应用一次和多次ｉｍＤＣｓ免疫均能诱导形成异基因嵌合体，且维持时间均大于１００ ｄ，但其嵌合程度有显著性统计学差异（Ｐ＜０．０５）。结论：应用供体来源的ｉｍＤＣｓ主动免疫受体可诱导形成异基因嵌合体。

慢病毒介导可溶性肿瘤坏死因子受体1在小鼠骨髓未成熟树突状细胞中的表达(英文)

背景:肿瘤坏死因子α是介导树突状细胞成熟的重要细胞因子之一,可溶性肿瘤坏死因子受体1与其结合可阻断肿瘤坏死因子α的作用,维持树突状细胞于不成熟状态,诱导免疫耐受。目的:构建含有人sTNFR1的慢病毒表达载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法:以人外周血单个核细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出sTNFR1基因片段,亚克隆至慢病毒转移质粒pXZ208,通过IRES连接eGFP报告基因,建立双顺反子慢病毒转移质粒,命名为pXZ9-sTNFR1,DNA测序鉴定。采用脂质体转染293FT细胞,根据报告基因eGFP测定病毒滴度。采用小剂量粒-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4体外培养扩增C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞。培养第5天,以pXZ9-sTNFR1重组慢病毒上清感染未成熟树突状细胞,RT-PCR检测感染后sTNFR1转录,Western blot法检测sTNFR1蛋白表达,观察sTNFR1基因修饰及脂多糖刺激后树突状细胞的表型特征。结果与结论:成功构建重组质粒pXZ9-sTNFR1,转染293FT细胞24h后观察到eGFP表达,病毒滴度在106U/L以上。RT-PCR显示pXZ9-sTNFR1感染的未成熟树突状细胞sTNFR1呈阳性表达,Western blot检测到sTNFR1蛋白存在于感染后未成熟树突状细胞和培养上清中。培养第5天的树突状细胞低表达CD40、CD86、CD80和MHCⅡ类分子,脂多糖刺激后,高表达MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86分子,显示出成熟型树突状细胞表型特征,sTNFR修饰的树突状细胞MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86分子表达水平无变化。提示:①成功构建了负载sTNFR1基因片段及含eGFP报告基因的慢病毒载体,获得了高滴度的重组慢病毒颗粒。②经慢病毒高效转导的未成熟树突状细胞sTNFR1 mRNA及蛋白稳定地表达,可以保护未成熟树突状细胞不被外源性脂多糖刺激活化,维持树突状细胞于非成熟状态。

未成熟树突状细胞诱导Th1／Th2偏移抑制大鼠高危角膜移植排斥反应的实验研究

目的研究供体来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)对高危角膜移植免疫排斥反应的抑制作用及其机制。方法以45只SD大鼠为受体,23只Wist-ar大鼠为供体,碱烧伤建立同种异体高危角膜移植模型。受体SD大鼠随机分为对照组、imDC组、成熟树突状细胞(mature dendritic cell,mDC)组,每组15只;对照组:术前7d经尾静脉注射PBS液0.1mL;imDC组:于术前7d经尾静脉注射体外培养的供体骨髓来源的imDC106个;mDC组:于术前7d经尾静脉注射体外培养的供体骨髓来源的mDC106个。术后每天裂隙灯观察各组角膜植片存活情况并评分;于术后14d每组随机处死5只大鼠,RT-PCR检测角膜植片Th1/Th2细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-12、IL-15、IL-18、IL-4、IL-10mRNA表达水平。结果 imDC组角膜植片存活时间为(19.8±2.1)d,较对照组的(9.2±1.9)d和mDC组的(7.9±1.4)d显著延长,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。RT-PCR结果显示,imDC组Th1型细胞因子IL-12、IL-15、IL-18mRNA表达较对照组和mDC组明显降低;Th2型细胞因子IL-4、IL-10mRNA表达明显升高。结论体外培养的供体来源的imDC可以抑制大鼠同种异体高危角膜移植免疫排斥反应,而调节受体Th1/Th2细胞因子比例是其降低大鼠角膜移植术后免疫排斥反应的机制之一。

雷帕霉素联合未成熟树突状细胞诱导小鼠皮肤移植免疫耐受

目的研究雷帕霉素联合供者骨髓来源的未成熟树突状细胞在诱导小鼠同种异基因皮肤移植免疫耐受中的协同作用。方法健康雄性C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠分别为供者、受者,建立同种异基因皮肤移植模型。对照组术前术后未给予任何免疫干预措施;雷帕霉素组术后第0天至第6天给予雷帕霉素灌胃;未成熟树突状细胞组将供者骨髓来源的未成熟树突状细胞于术前第7天经尾静脉输注给受者;联合组将供者骨髓来源的未成熟树突状细胞于术前第7d经尾静脉输注给受者,并在术后第0天至第6天给予雷帕霉素灌胃。结果对照组、雷帕霉素组、未成熟树突状细胞组、联合组的皮肤移植物存活时间分别为(6.9±1.9)、(12.3±3.0)、(17.0±3.4)、(20.8±3.6)d。方差分析提示组间差异有显著性意义(P<0.05);SNK检验提示各组之间的差异均有显著意义。结论雷帕霉素能延长小鼠皮肤移植物的存活时间;联合供者骨髓来源的未成熟树突状细胞可延长免疫耐受的持续时间。

CCR7基因修饰未成熟树突状细胞诱导小鼠皮肤移植免疫耐受的研究

目的研究CCR7基因重组腺病毒体外转染未成熟树突状细胞(imDCs)对小鼠同种异体皮肤移植免疫耐受的影响。方法小鼠骨髓细胞经梯度离心及rmIL-4、rmGM-CSF诱导培养未成熟树突状细胞;CCR7重组腺病毒经增强离心法转染未成熟树突状细胞;体外观察转染细胞混合淋巴细胞反应;取CCR7修饰imDCs于皮肤移植前2d、移植后第5天,经腹部注入受体小鼠,观察皮肤移植物存活时间和病理变化。结果CCR7基因成功转染入imDCs;腺病毒转染后imDCs刺激T细胞增殖的能力较imDCs组增强但弱于mDCs组,IL-10可以明显降低刺激能力;CCR7腺病毒转染组皮肤存活时间长于转染前,IL-10能显著延长皮肤存活时间。结论CCR7重组腺病毒转染imDCs后,imDCs刺激T细胞增殖的能力部分增强,皮肤移植物存活时间明显延长。

未成熟树突状细胞在大鼠高危角膜移植免疫排斥反应中的作用

目的研究供体骨髓来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)对大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的抑制作用,探讨imDC抑制排斥反应的机理。方法以60只SD大鼠为受体,30只Wistar大鼠为供体,碱烧伤建立同种异体高危角膜移植模型。受体SD大鼠随机分为对照组、imDC组、成熟树突状细胞(mature dendritic cell,mDC)组,每组20只;对照组:术前7d经尾静脉注射PBS液0.1mL;imDC组:术前7d经尾静脉注射体外培养的供体骨髓来源的imDC1×106个;mDC组:术前7d经尾静脉注射体外培养的供体骨髓来源的mDC1×106个。术后每天裂隙灯观察各组角膜植片存活情况并评分;于术后3d、7d、14d每组随机处死4只大鼠,取角膜植片行HE染色,Westernblot分析检测各组大鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞表面特异性标志转录因子Foxp3编码的Scurfin蛋白的表达。结果 imDC组角膜植片存活时间为(19.6±1.1)d,较对照组的(9.5±0.9)d和mDC组的(7.0±1.6)d明显延长,差异均有统计学意义(均为P<0.01);Westernblot检测结果显示,术后3d、7d、14dimDC组Foxp3编码的Scurfin蛋白的表达(相对吸光度值分别为2.21±0.76、2.31±0.68、2.24±0.18)明显高于对照组(相对吸光度值分别为1.41±0.12、1.47±0.25、1.68±0.09)和mDC组(相对吸光度值分别为1.43±0.14、1.58±0.41、1.46±0.13),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论应用体外培养的供体来源的imDC可以抑制大鼠同种异体高危角膜移植免疫排斥反应,而诱导CD4+CD25+调节性T细胞的产生是其降低大鼠角膜移植术后免疫排斥反应的机制之一。

胸腺基质淋巴细胞生成素受体剔降的未成熟树突状细胞调节哮喘小鼠Thl/Th2失衡的研究

目的树突细胞疫苗是治疗哮喘的新途径,文中探讨经鼻滴注基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoetin,TSLP)受体剔降的未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)对哮喘模型小鼠过敏性气道炎症及Th1/Th2免疫失衡的影响,为免疫调节治疗哮喘提供理论和实验基础。方法36只C57BL/6小鼠随机分为胸腺TSLP受体剔降的imDC治疗组(A组)、imDC治疗组(B组)和哮喘组(C组)。以卵蛋白(ovalbumin,OVA)、氢氧化铝免疫建立哮喘模型,A组和B组分别于激发前气道内滴注100μl的细胞悬液,分别含有1×106TSLPR剔降的imDC、imDC,C组气道内滴注100μl的PBS;各组激发后肺泡灌洗分析细胞组份,分离肺淋巴细胞测定细胞因子分泌水平,以流式细胞仪检测CD4+干扰素-γ(interferonγ,IFN-γ)+、CD4+白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)+百分比及IFN-γ+/IL-4+比值,比较各组肺组织学改变。结果TSLP受体剔降的imDC治疗组与其他组比较:①可明显抑制OVA抗原激发后气道内嗜酸性粒细胞的浸润(P<0.01);②明显抑制肺淋巴细胞产生IL-4、IL-5,增加了IFN-γ的产生;③肺淋巴细胞CD4+IFN-γ+百分比及IFN-γ+/IL-4+明显升高(P<0.01),而CD4+IL-4+百分比则明显下降(P<0.01);④明显抑制哮喘鼠气道内及肺泡内的过敏性炎症反应。结论激发前经鼻滴注TSLP受体剔降的imDC对哮喘小鼠过敏性气道炎症有明显的防治作用,其机制可能与抑制树突细胞TSLP-TSLP受体信号通路,调整Thl/Th2失衡有关。

未成熟树突状细胞联合骨髓移植诱导肾移植大鼠免疫耐受及其机制

目的 供体来源未成熟树突状细胞输注联合骨髓移植,诱导异体肾移植大鼠产生免疫耐受,并探讨其 机制。方法 肾移植大鼠分为5组:阴性对照组、未成熟树突状细胞组、骨髓移植组、联合诱导组、环磷酰胺组。 51Cr释放实验测定大鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞毒效应;ELISA检测脾细胞培养上清IL-4、IFN-γ、TGP- β水平。结果 阴性对照组肾移植大鼠的平均存活时间(MST)为(7.12±1.25)d,未成熟树突状细胞组为(24.38 ±3.20)d,骨髓移植组为(7.87±2.1)d,环磷酰胺组为(18.13±2.36)d,而联合诱导组延长到(80.75±16.88)d, 与上述4组比较,均存在显著性差异(P<0.01)。耐受组大鼠(CTL)杀伤率低于排斥组(4.3±1.0)υs(39.6± 4.4),(P<0.01)。耐受组大鼠脾细胞培养上清IL-4和TGF-β水平为(185.44±32.17)ng／L和(716.82± 197.62)ng／L,高于排斥组(P<0.01);而IFN-γ水平为(532.78±34.54)ng／L,低于排斥组(P<0.01)。结论 术前供体来源未成熟树突状细胞输注联合骨髓移植,可成功诱导受体大鼠产生免疫耐受,其机制可能与特异性 CTL无能及TH1／TH2/TH3细胞因子网络的免疫偏离有关。

CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞在大鼠高危角膜移植免疫排斥反应中的作用

目的研究趋化因子受体7(chemokine receptor 7,CCR7)基因重组腺病毒体外转染供体骨髓来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDC)对大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的作用。方法以60只SD大鼠为受体,30只Wistar大鼠为供体,碱烧伤建立高危角膜移植模型。将SD大鼠分为空白对照组、未修饰imDC组、imDC+腺病毒空载体组(imDC+Ad组)和imDC+CCR7腺病毒组(imDCs+Ad-CCR7组),每组15只;各组受体术前7 d和术后3 d经尾静脉注入PBS液0.1 mL、供体来源的未修饰imDC 10×106个(0.1mL)、空载体腺病毒转染后的imDC 10×106个(0.1 mL)和携带CCR7腺病毒转染后的imDC 10×106个(0.1 mL);术后受体大鼠每天裂隙灯下观察角膜植片存活情况并对角膜植片的混浊、水肿及新生血管程度进行评分;术后14 d每组随机处死5只大鼠取角膜行HE切片观察。结果角膜植片存活时间:空白对照组(10.44±1.88)d,imDC组(16.00±2.18)d,imDC+Ad组(15.11±2.03)d,imDC+Ad-CCR7组(23.67±2.83)d,4组间比较差异有统计学意义(F=53.005,P=0.000);与空白对照组相比,imDC组、imDC+Ad组、imDC+Ad-CCR7组角膜植片存活时间均明显延长(均为P<0.01);imDC+Ad-CCR7组较imDC组与imDC+Ad组均明显延长(均为P<0.01)。角膜植片HE染色切片显示,imDC+AdCCR7组的植片轻度水肿、基质层板层纤维排列有序,未修饰imDC组和imDC+Ad组呈不同程度的水肿,基质层板层纤维排列轻度紊乱、有少量炎性细胞;空白对照组植片高度水肿、角膜基质板层纤维紊乱并出现大量炎性细胞和新生血管。结论静脉注入CCR7基因修饰的imDC可以明显延长大鼠高危角膜移植后角膜植片存活时间,抑制角膜移植免疫排斥反应。

受体来源未成熟树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫低反应性的实验研究

目的研究不负载供者抗原的受者未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)对大鼠肝移植的保护作用,探讨imDC抑制排斥反应的机理。方法以SD大鼠作为供体,雄性Wistar大鼠作为受体,随机分为4组,每组10只,建立肝移植急性排斥反应模型,移植前对受体进行不同的处理。对照组:受体未接受任何处理;环孢素A(CsA)组:术后第2 d开始给予CsA〔10 mg/(kg.d)〕灌胃;成熟树突状细胞(mDC)组:受体术前1 d经阴茎背静脉注射受体来源的mDC 1×106个/只;imDC组:受体术前1 d经阴茎背静脉注射受体来源的imDC1×106个/只。模型建立后10 d各组随机处死5只,取移植肝脏组织行HE染色和免疫组化(FasL/Fas)染色,观察肝脏组织形态结构和排斥反应,根据Banff评分系统判断排斥反应程度;Western blot分析检测各组Foxp3编码的Scurfin蛋白的表达。另留5只大鼠观察术后存活时间;收集血标本,全自动生化分析仪测定ALT、TBIL;双抗体夹心ELISA法检测血清IL-2、IFNγ-、IL-4和IL-10水平。结果CsA组和imDC组术后大鼠中位生存时间明显长于对照组和mDC组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植术后各组大鼠血清生化检查:对照组和mDC组ALT及TBIL明显高于CsA组和imDC组(P<0.05);且IL-2和IFNγ-也明显高于CsA组和imDC组(P<0.01),但IL-4和IL-10明显低于CsA组和imDC组(P<0.01)。移植肝脏形态学检测:对照组和mDC组与CsA组和imDC组比较,排斥反应更严重(P<0.05)。Western blot检测:imDC组Foxp3编码的Scurfin蛋白的表达明显高于其他3组(P<0.05)。结论imDC通过阻断间接识别能明显延长移植物存活时间。imDC可能通过以下机理诱导免疫低反应:诱导T细胞凋亡;选择性激活Th2细胞亚群,诱导Th1/Th2偏移;诱导调节性T细胞产生。

MACS系统对小鼠造血干细胞定向分化为未成熟树突状细胞的实验研究

目的:探讨经MACS系统在体外获得大量高纯度未成熟树突状细胞(imDC)的方法,并对其细胞表面标志、形态和功能进行鉴定。方法:对健康C57小鼠的骨髓通过MACS系统分离、纯化CD117+造血干细胞(HSC);使用SCF+IL-3行体外扩增,并采用GM-CSF+IL-4+IL-10诱导其定向分化为imDC;进而在倒置显微镜、扫描电镜以及透射电镜下观察其形态、功能,采用流式细胞计数法检测、鉴定其表面标志物的表达。结果:SCF+IL-3可以分别在3、5、7d时体外扩增HSC达10.34±1.43倍、22.65±2.71倍、54.39±3.08倍;小鼠HSC可被成功诱导分化为imDC,且具有吞噬功能,表面树突呈毛刺状、较为短小,imDC并表达CD11c+、I-A/I-Elow、CD40-、CD80-、CD86-。结论:本方法可稳定、有效地获得大量高纯度的imDC。

NOD小鼠未成熟树突状细胞体外诱导淋巴细胞生成并扩增调节性T细胞的研究

目的探索非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)诱导并扩增调节性T细胞(regulatory Tcells,Treg)的优化方案。方法分离、培养NOD小鼠骨髓来源的imDC和淋巴细胞,并进行混合淋巴细胞培养,分别加入白介素(IL)-2、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1、抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激淋巴细胞增殖、分化。实验分为4组:对照组(淋巴细胞+IL-2)、实验1组(淋巴细胞+imDC+TGF-β1+IL-2)、实验2组(淋巴细胞+imDC+抗CD3抗体+抗CD28抗体+IL-2)、实验3组(淋巴细胞+imDC+抗CD3抗体+抗CD28抗体+TGF-β1+IL-2)。用流式细胞仪检测各组培养3d后淋巴细胞的扩增情况及混合培养6d淋巴细胞中CD4、CD25及Foxp3的表达。结果 imDC和淋巴细胞混合培养3d后,对照组、实验1组、实验2组和实验3组增殖指数分别为(1.04±0.03)%、(1.26±0.02)%、(1.36±0.01)%和(1.55±0.02)%。实验3组的增殖指数较实验1组和实验2组明显升高(均为P<0.01)。混合培养6d后,对照组、实验1组、实验2组和实验3组的CD4+CD25+T淋巴细胞亚群所占比例分别为(2.41±0.02)%、(17.98±1.02)%、(30.67±2.68)%、(42.84±1.41)%,而CD4+CD25+T淋巴细胞中Foxp3+细胞的比例4组分别为(65.55±1.41)%、(86±1.72)%、(70.29±1.39)%、(92.3±1.99)%,实验3组的淋巴细胞CD4+CD25+、Foxp3+的表达水平较实验1组和实验2组明显升高(均为P<0.01)。结论在imDC和淋巴细胞混合培养时加入TGF-β1、抗CD3抗体、抗CD28抗体可明显刺激imDC诱导扩增Treg,是体外诱导扩增Treg的理想方案之一。

IFN-γ刺激培养未成熟树突状细胞免疫耐受效应机制研究

目的通过γ-干扰素(IFN-γ)刺激培养未成熟树突状细胞,研究在体外IFN-γ诱导未成熟树突状细胞免疫耐受的效应机制。方法采用经典的GM-CSF+IL-4诱导方案,以获得细胞表面缺乏共刺激分子的大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞,经IFN-γ刺激培养后,通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养,流式细胞仪检测表面MHCⅡ类分子及共刺激分子CD80、CD86,DC表面相对特异性标记OX62的情况,将脾脏分离淋巴细胞分为3组,即对照组、imDC组和imDCIFN-γ组,采用MTT法检测各组淋巴细胞增殖情况,Anneix-V-Flous检测各组淋巴细胞凋亡,ELISA法检测体外培养脾细胞上清液Th1/Th2型细胞因子,观察体外CD4+T细胞Th亚群的分化情况。结果 IFN-γ刺激培养的未成熟树突细胞通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养后低表达表面MHCⅡ类分子(14.01%)及共刺激分子CD80(4.78%)、CD86(19.79%),同样低表达DC表面相对特异性标记OX62(15.31%,P<0.05,n=4);MTT法检测共培养的脾淋巴细胞imDC组i、mDCIFN-γ组与对照组增殖差异有统计学意义(P<0.05,n=5);但imDCIFN-γ组凋亡率为(12.9±0.02)%,与对照组和imDC组相比均明显增高(P<0.05,n=5);Th1型细胞因子明显向Th2型细胞因子偏移。结论 IFN-γ刺激培养的未成熟树突状细胞对外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽摄取及提呈能力明显下降;抑制T细胞增殖,促进T细胞凋亡;并且促使Th1型细胞因子向Th2型细胞因子漂移,诱导形成免疫耐受。

恒河猴骨髓来源未成熟树突状细胞的培养及鉴定

目的建立一种体外诱导恒河猴骨髓CD34+细胞分化为树突状细胞(DC)的方法,并对其细胞形态及表面标志进行鉴定。方法用免疫磁珠分选系统(MACS)分选恒河猴骨髓细胞,收集高纯度的CD34+造血干细胞;加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α),诱导其分化为骨髓来源的树突状细胞,并采用电镜观察细胞形态。用树突状细胞表面标志CD1a及成熟树突状细胞(mDC)表面标志CD83流式抗体染色后分析。结果细胞因子诱导6d后成功培养出表面呈绒毛状和树枝状突起的典型DC样细胞,流式细胞术分析结果显示92.35%的细胞为DC,27.61%的细胞为m DC。结论用此方法可在体外培养出高纯度且典型的恒河猴骨髓源性未成熟树突状细胞(im DC),为进一步研究其生物学特性及功能奠定了基础。

不同方法对未成熟树突状细胞体外诱生的研究

目的筛选最佳体外诱生大鼠未成熟树突状细胞(imDC)的方法。方法用低剂量(0.2ng/mL)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombination rat GM-CSF,rrGM-CSF)体外诱导imDC;用常规剂量(5ng/mL)的GM-CSF加大鼠白细胞介素-4(recombinationratIL-4,rrIL-4)(5ng/L)体外诱导imDC;rrGM-CSF+rrIL-4再加大鼠白细胞介素-10(recombination rat IL-10,rrIL-10)(10ng/mL)体外诱导imDC;第13天收获细胞,观察形态;流式细胞仪检测表面抗原;混合淋巴细胞培养(MLR)检测DC刺激同种异体T淋巴细胞的能力,培养上清白细胞介素-12(IL-12)的浓度和细胞增殖情况等方面进行考察,对比筛选。结果低剂量GM-CSF组和IL-10组DC与GM-CSF+IL-4组DC相比,符合imDC的特点;GM-CSF+IL-4组DC表现成熟DC的特点,但细胞增殖情况低剂量GM-CSF组明显低于GM-CSF+IL-4+IL-10组,两组相比差别具有显著性。结论GM-CSF+IL-4+IL-10组是最佳诱导imDC的方法。

未成熟树突状细胞对肝纤维化抑制作用的研究进展

肝纤维化是一种常见的病理过程,涉及慢性肝病中各种病因的持续性肝损伤和随后的炎症反应,被认为是一个中间阶段,如果及时去除致病因素或许可以逆转,否则可能会发展为肝硬化、肝细胞癌,最终导致肝功能衰竭。纤维化的发展与我们免疫系统的激活密不可分,首当其冲的就是树突状细胞(DC)。成熟的DC(mDCs)可以激活免疫系统,刺激炎症反应的出现,未成熟树突状细胞(imDCs)则起到免疫调节,诱导免疫耐受的作用,有趣的是imDCs还能够对肝纤维化的消退起一定的作用,而mDCs则会加速纤维化的进展。文章就imDCs的诱导产生,肝纤维化的发展机制以及近年来imDCs抑制肝纤维化的相关研究作一综述。