原位末端转移酶地高辛标记法检测凋亡细胞

采用地高辛原位末端标记法（ＩｎＳｉｔｕＥｎｄＬａｂｅｌｉｎｇ，ＩＳＥＬ），建立了Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ细胞的原位检测体系。结果显示：小鼠胸腺细胞在体外培养８ｈ时，台盼兰拒染率为９４％～９５％，地塞米松刺激的胸腺细胞ＤＮＡ电泳呈典型的“梯形条带（Ｌａｄｄｅｒｐａｔｅｒｎ）”，ＩＳＥＬ标记的细胞阳性率为７４．４％，未经地塞米松刺激和未经培养直接标记的胸腺细胞阳性率分别为２８．６％和１０．２％。

末端转移酶原位标记法检测细胞凋亡

建立一种用末端转移酶标记对凋亡的细胞进行原位检测的方法。方法：在末端转移酶催化下，将地高辛修饰的核苷酸掺入凋亡细胞中的ＤＮＡ断裂缺刻，再用显色法检测被标记的ＤＮＡ，从而检出凋亡细胞。结果：本实验建立了一种灵敏、特异、有效的凋亡检测方法。结论：末端转移酶介导的原位标记法是研究凋亡的一个非常有用的工具。

原位DNA末端转移酶法检测细胞凋亡的影响因素

利用原位ＤＮＡ末端转移酶（ＩＳＴｄＴ）法检测肝硬变、肝癌组织标本及小鼠小肠粘膜上皮细胞凋亡。结果发现２５ｍｇＬ－１蛋白酶Ｋ消化１５ｍｉｎ，ＴｄＴ反应后采用中火档微波处理５ｍｉｎ可获最佳结果。

新型端粒末端转移酶疫苗有望治疗胰腺癌

2006年10月，英国权威临床杂志British Journal of Cancer（BJC）刊登了丹麦Pharmexa制药公司产品GV1001治疗胰腺癌的Ⅰ／Ⅱ期临床试验结果，充分肯定了GV1001治疗胰腺癌的效果。GV1001是一种端粒末端转移酶疫苗，研究显示广泛激活免疫系统的可打破肿瘤引起的免疫抑制，能控制肿瘤的发展，因此许多肿瘤，包括不含已知肿瘤抗原的肿瘤细胞都可以被端粒末端转移酶免疫疗法所杀灭。

末端脱氧核苷酸转移酶相互作用因子1及其在癌症中的研究进展

末端脱氧核苷酸转移酶相互作用因子1(TdIF1)是一种直接与末端脱氧核苷酸转移酶结合的蛋白质。TdIF1在非小细胞肺癌、口腔癌、乳腺癌中高度表达,且这种高表达可促进癌细胞的生长。文章就TdIF1的结构、功能以及在癌症进展中的作用进行综述,指出TdIF1可能是一种潜在的癌症促进因子,为其成为癌症诊断的潜在标志物及靶向治疗的新靶标提供参考。

基于末端脱氧核苷酸转移酶协同G-四链体核酶的恩诺沙星检测方法

基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)协同G-四链体核酶设计信号放大策略,建立了一种恩诺沙星电化学检测方法。目标物恩诺沙星与特异性核酸适体的结合触发TdT在电极表面的扩增反应,产生G-四链体核酶纳米线结构,进而发挥辣根过氧化物酶活性催化信号放大,实现恩诺沙星的高灵敏和高特异性检测。该方法对恩诺沙星的线性检测范围为0.5~50μg/L,检测限低至0.043μg/L。此外,该无标记电化学生物传感器简单快速,成本低,并成功应用于对实际食品样本的分析检测,显示出较好的应用潜能。

人端粒末端转移酶反转录酶及bcl-2在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达

端粒末端转移酶的激活与肿瘤的发生密切相关。随着对其研究的深入，人们逐渐认识到人端粒末端转移酶反转录酶（human telomerase revere transcriptase，hTERT）可能在端粒末端转移酶活性调节中发挥重要作用。但在病理性瘢痕的发生发展过程中，有关端粒末端转移酶激活的机制及其与bcl-2mRNA表达水平的关系鲜见报道。笔者通过检测hTERT、bcl-2mRNA在人病理性瘢痕成纤维细胞中的表达水平，旨在探讨在此过程中是否存在端粒末端转移酶激活机制及其意义。

拟南芥N末端乙酰转移酶Naa50参与调控根细胞有丝分裂

N末端乙酰转移酶Naa50在调控拟南芥生长发育方面至关重要。为探究Naa50是否通过调控细胞有丝分裂来影响植物生长发育,将naa 50-1突变体与H2B-YFP株系杂交,利用H2B-YFP标示细胞分裂过程中染色体的分离行为。结果表明,与野生型相比,拟南芥naa 50-1突变体根尖分生区细胞有丝分裂指数下降,染色体畸变率明显增加,微核率上升,且处在分裂中期的细胞比例增加。将naa 50-1突变体与CYCB1-CUS株系杂交,检测根细胞中CYCB1蛋白表达,发现naa 50-1突变体中CYCB1蛋白表达量明显增加。PI染色分析表明,naa 50-1突变体根部存在部分死细胞。以上结果表明,在细胞有丝分裂过程中,Naa50促进遗传物质平均分配到两个子细胞中,促进细胞从分裂中期向后期转换;Naa50通过调控细胞分裂进而参与植物生长发育的调控。

N末端乙酰转移酶Naa20抑制植物发育时相的转变

蛋白质N末端乙酰化修饰是真核生物中重要的蛋白质修饰类型,该修饰由一系列进化保守的N末端乙酰转移酶催化完成。为了探究N末端乙酰转移酶Naa20在植物发育进程中的作用,对拟南芥Naa20基因的突变体进行表型观察,发现naa20突变体相较于野生型表现出营养生长阶段幼年态向成年态转变的提前,并且开花时间也提前。转基因互补分析表明,naa20突变体发育时相转变提前是由于Naa20基因表达缺失引起的。遗传分析表明,naa20 hst双重突变体表现出与hst单突变体相似的幼年态向成年态转变提前和开花时间提前的表型。酵母双杂交试验表明,Naa20蛋白与Naa25蛋白具有直接的相互作用。以上结果表明,Naa20与Naa25存在于同一个复合体,通过下游调控HST进而抑制植物发育时相的转变,在植物营养生长时期转变和生殖生长转变过程中发挥了重要的作用。

末端脱氧核酸转移酶介导的功能核酸生物传感器研究进展

末端脱氧核酸转移酶(TdT酶)是一种DNA聚合酶,可以催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端,并且该反应无需特定的模板。目前,基于末端脱氧核酸转移酶可对模板核酸链的末端进行延伸这一特性,搭载不同的信号输出及扩增方式,构建了一系列的生物传感技术,如电化学生物传感器、荧光生物传感器、表面离子共振生物传感器等。对各类传感器的基本设计原理和应用进行了阐述。根据TdT酶的性质设计的一系列生物传感器具有简单、快速、廉价、灵敏度高、特异性好等优点,实现了对金属离子、病原体、蛋白质等的检测。最后对TdT酶介导的生物传感器目前的研究现状进行了总结并且对TdT酶未来的发展方向进行了展望。

尿液中端粒末端转移酶可有效诊断膀胱癌

由于目前对检测早期膀胱癌可用的无创方法既无有效的敏感性,又缺乏特异性,不能作为常规检查应用,所以发现新的分子标记物就成为最具挑战性的目标之一。为能在排泻出的尿液中应用一种相对简单、廉价和精确的方法来检测出端粒末端转移酶的活性,以便应用于大规模筛查膀胱癌, 意大利的Sanchini等开展了一项病例对照研究,并发表于 JAMA杂志。

基于末端脱氧核苷酸转移酶扩增DNA-铜纳米簇荧光传感检测L-组氨酸

利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)扩增形成聚胸腺嘧啶(T)DNA模板,制备了聚T铜纳米簇(TS-CuNCs),构建了一种用于L-组氨酸(L-His)检测的荧光传感分析新方法。TdT酶在d TTP存在下合成聚T单链DNA核苷酸序列。由于胸腺嘧啶和Cu^(2+)之间的亲合力,聚T单链DNA作为合成铜纳米簇(CuNCs)的模板,加入还原剂后形成CuNCs,荧光强度增强。在L-His存在下,L-组氨酸的咪唑基与Cu^(2+)螯合形成L-His-Cu^(2+)配合物,因而进入聚胸腺嘧啶序列中的Cu^(2+)量减少,使得合成的CuNCs数量减少,导致荧光信号减弱。实验结果表明,体系荧光响应信号与L-His浓度的对数值在5.0×10^(-9)~5.0×10^(-4)mol/L范围内呈线性关系,检出限达到3.4×10^(-9)mol/L。本方法用于实际尿液样品中L-组氨酸检测的回收率为97.4%~104.6%,在生物医学及临床诊断中具有潜在应用价值。

基于末端脱氧核糖核酸转移酶的纳米界面上DNA的生长策略及用于恩诺沙星的适配体传感器构建研究

在纳米金(Au nanoparticles,AuNPs)表面通过组装巯基DNA制得AuNPs-DNA生物探针后,末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdTase)催化探针DNA的3′-OH 端,实现DNA的生长,并得到生长产物长单链DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)。通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像(Atomic force microscope,AFM)对探针及ssDNA进行表征,结果表明TdTase能够实现纳米界面上DNA的高效生长,卷曲状态下链长可达850 nm。进一步将这种DNA的生长策略与适配体(Aptamer)技术相结合。首先在纳米金表面组装适配体片段1,在醛基化的磁珠颗粒表面组装适配体片段2,以此构建针对恩诺沙星的适配体生物传感器(Aptasensor)。该传感器对ENR在10 ~1.0×10 5 ng/mL具备良好的响应性能,检出限为1.0 ng/mL,能明显区分环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等对照组信号。研究表明,基于TdTase的适配体传感器操作便捷,具备良好的靶分子响应性能和特异性,可为食品安全检测等领域提供新的研究思路。

p27kip1基因转移对食管癌细胞生存素表达和端粒酶活性的影响

背景:p27kip1是新近发现的一种抑癌基因,早期研究表明p27kip1基因转移能显著抑制食管癌细胞和人食管癌裸鼠移植瘤的生长,表明该基因疗法可能是食管癌治疗的新途径,但其抑癌机制尚未完全阐明。目的:研究p27kip1基因转移对食管癌细胞生存素(survivin)表达和端粒酶活性的影响,从而阐明p27kip1的抑癌机制,为p27kip1基因治疗食管癌提供理论依据。方法:将携带p27kip1基因的重组腺病毒(Ad-p27kip1)和LacZ重组腺病毒(Ad-LacZ)分别转染食管癌细胞系Eca9706,观察细胞形态变化,以免疫细胞化学染色和蛋白质印迹法检测p27kip1和生存素的表达,以端粒重复序列扩增程序(TRAP)聚合酶链反应(PCR)-酶联免疫吸附测定(ELISA)检测端粒酶活性。结果:经Ad-p27kip1转染后,Eca9706细胞变圆,呈葡萄串样聚集以致脱落。细胞p27kip1表达明显增强,生存素表达降低,端粒酶活性显著受抑制。结论:p27kip1基因抑制食管癌细胞生长的作用机制可能与下调生存素表达和抑制端粒酶活性有关。

微RNA-342-3p/末端尿苷酰转移酶1/凝血酶敏感素-2通路在胰腺导管腺癌中的作用及机制

目的探讨微RNA(miR)-342-3p/末端尿苷酰转移酶1(TUT1)/凝血酶敏感素-2(THBS2)通路在胰腺导管腺癌中的作用及miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA表达与患者临床病理学参数的关系。方法选择2008年5月至2021年3月在遂宁市中心医院行根治性手术切除的胰腺导管腺癌标本(n=80)和对应癌旁正常组织标本(n=20)为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测胰腺导管腺癌组织和癌旁正常组织中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA的表达。将对数生长期人胰腺导管腺癌细胞株PANC-1细胞分为对照组(转染miR-NC)、miR-342-3p过表达组(转染miR-342-3p mimic)、miR-342-3p抑制剂组(转染miR-342-3p inhibitor)、Vector组(转染pCS4-HA vectors)、TUT1组(转染pcDNA3-Flag-TUT1)、阴性对照组(转染sh-NC慢病毒载体)、TUT1沉默组(转染pGCshL-TUT1载体)、miR-342-3p过表达+TUT1组(同时转染miR-342-3p mimic和TUT1)、miR-342-3p过表达+THBS2组(同时转染miR-342-3p mimic和THBS2)、TUT1+THBS2组(同时转染pcDNA3-Flag-TUT1和THBS2)。采用细胞计数试剂盒-8检测10组细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测10组细胞的凋亡情况,采用双荧光素酶报告系统检测miR-342-3p与TUT1的靶向关系,采用Western blot法检测对照组、miR-342-3p过表达组和miR-342-3p抑制剂组PANC-1细胞中TUT1、THBS2蛋白的表达。结果胰腺导管腺癌组织中miR-342-3p TUT1、THBS2 mRNA的相对表达量显著低于癌旁正常组织(P<0.05)。不同年龄、不同肿瘤大小、淋巴结是否转移和不同肿瘤分期患者癌组织中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);高分化癌组织中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表达显著高于中+低分化癌组织(P<0.05)。培养0 h时,各组PANC-1细胞的增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养24、48、72 h时,TUT1组细胞的增殖能力均显著低于Vecort组,细胞的凋亡率显著高于Vecort组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,TUT1沉默组细胞的增殖能力显著高于阴性对照组,细胞凋亡率显著低于阴性对照组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,miR-342-3p抑制剂组的细胞增殖能力显著高于对照组(P<0.05),miR-342-3p过表达组的细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.05)。培养24 h时,miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组与miR-342-3p过表达组的细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养48、72 h时,miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组的细胞增殖能力均显著低于miR-342-3p过表达组(P<0.05)。miR-342-3p抑制剂组细胞的凋亡率显著低于对照组(P<0.05),miR-342-3p过表达组细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组细胞的凋亡率显著高于miR-342-3p过表达组(P<0.05)。miR-342-3p过表达组细胞中野生型TUT1报告基因的荧光素酶活性显著高于对照组(P<0.05),突变型TUT1报告基因的荧光素酶活性与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-342-3p过表达组细胞中TUT1和THBS2蛋白的相对表达量显著高于对照组(P<0.05),miR-342-3p抑制剂组细胞中TUT1和THBS2蛋白的相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。结论激活miR-342-3p/TUT1/THBS2通路可抑制PANC-1细胞增殖,促进其凋亡,进而抑制胰腺导管腺癌的发展,miR-342-3p/TUT1/THBS2通路有望成为诊治胰腺癌的潜在靶点。

胃癌腹膜转移与腹腔灌洗液中端粒酶活性的关系

目的：探讨胃癌患者腹腔灌洗液中端粒酶活性与胃癌腹膜转移的关系。方法：应用端粒重复扩增（ＴＲＡＰ）－酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）法检测４６例胃癌和１４例胃溃疡患者腹腔灌洗液中的端粒酶活性，同时对４６例胃癌患者行腹腔灌洗液脱落细胞学检测。结果：１４例胃溃疡患者腹腔灌洗液中端粒酶活性均为阴性。胃癌患者腹腔灌洗液中端粒酶活性阳性率在ＰＴ３期胃癌为５５．６％，在ＰＴ４期胃癌为９９．３％；在浆膜未受累组、受累面积＜１０ ｃｍ２组、１０．１～２ ０ ｃｍ２组和＞２０ｃｍ２组分别为５．３％、２５．０％、７６．９％和１００．０％；在无肉眼可见腹膜转移灶（Ｐ０）组为４２．９％，在肉眼可见腹膜转移灶（Ｐ１～３）组为１００．０％。而腹腔灌洗液中脱落细胞学检测阳性率在ＰＴ３和ＰＴ４期胃癌分别为２２．２％和６１．５％；在浆膜未受累组、受累面积＜ １０ ｃｍ２组、 １０．１～２０ ｃｍ２组和＞ ２０ ｃｍ２组分别为０、０、３８．５％和７０．０％；在Ｐ０组为１９．０％，在Ｒ１～３组为１００．０％。ＴＲＡＰ－ＥＬＩＳＡ方法的阳性率比脱落细胞学检测显著增高（４７．８％比２６．１％，Ｐ＜０．０５）。结论：腹腔灌洗液中的端粒酶活性与胃癌腹膜转移呈正相关，

联合检测端粒酶和CK20诊断大肠癌外周血微转移的研究

目的联合检测细胞角蛋白20(cytoker-atin20,CK20)表达和端粒酶的活性,初步探讨它们在检测大肠癌微转移中的意义。方法用RT-PCR法,检测52例大肠癌患者术前和术后不同时间外周血中的CK20的表达。用端粒重复片段扩增方法检测相应患者外周血中的端粒酶的活性。结果52例患者外周血中检出CK20表达及端粒酶活性检测阳性率按不同时间段分别为61·9%与57·7%(术前),69·1%与72·1%(术后24h),34·6%与30·9%(术后早期化疗结束后)。两者的阳性表达均与患者Duke’s分期存在显著性相关。结论端粒酶和CK20均可作为标志物来检测大肠癌患者外周血中微转移。

一个新的人类乙酰转移酶基因hNATL的克隆与表达谱研究

从小鼠cDNA序列入手,依据同源分析的电子克隆方法得到一个包含N末端乙酰转移酶结构域的人类新基因hNATL(Human NAT Like)。hNATL的cDNA长1803bp,编码区621bp,Genbank 登陆号AY632082。hNATL编码的蛋白长206个氨基酸残基,包含有N乙酰转移酶结构域。hNATL 基因定位于人染色体17q25．2区,包括6个外显子和5个内含子。基因表达汇编分析结果显示, hNATL在人脑和生殖腺中高表达。Northern杂交显示,在成年小鼠中hNATL在心脏,脾脏和卵巢中出现表达。整体原位杂交的结果显示,hNATL特异表达于E7．5和E8．5的小鼠胚胎脑部和HH10期鸡胚胎的头部。上述结果提示,hNATL对胚胎期脑的发育和成体中重要器官行使正常功能发挥十分重要的作用。

管花肉苁蓉麦角甾苷对衰老小鼠端粒酶活性和免疫功能的影响

目的观察管花肉苁蓉麦角甾苷(CTWA)对实验性衰老小鼠心、肝和脑组织中丙二醛(MDA)含量、端粒酶活性和免疫功能的影响。方法小鼠sc 10%D-半乳糖10mL·kg-1,每天1次,连续8周,建立亚急性衰老模型。给药组小鼠从造模第9周起,分别ig给予CTWA 10,20和40mg·kg-1,每天1次,连续2周。硫代巴比妥酸比色法检测MDA含量;PCR-ELISA法检测端粒酶活性;[3H]TdR掺入法测定淋巴细胞增殖反应;中性红实验测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能;放射免疫法测定外周血白细胞介素2(IL-2)含量。结果模型组小鼠心、肝和脑MDA含量明显增加,心和肝端粒酶活性明显降低,淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量均显著下降。给予CTWA 2周,小鼠心、肝和脑MDA含量明显降低,CTWA 40mg·kg-1组小鼠心和脑组织端粒酶活性明显升高,淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量明显升高。结论CTWA能拮抗自由基损伤,增强衰老小鼠心和脑组织端粒酶活性和机体免疫功能,这些可能与CTWA的抗衰老作用有关。