基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法的Ddx3x肝脏条件性敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁(DEAD-box RNA helicase 3X-linked,Ddx3x)肝脏条件性敲除小鼠。方法设计特异的sgRNA序列,在Ddx3x基因外显子4~10两端插入LoxP序列,构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法对F0代和F1代小鼠进行基因鉴定。将Ddx3x-flox F1代小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏条件性敲除Ddx3x基因小鼠(Ddx3x^(Δhep))。采用PCR方法和Western blotting方法分别检测Ddx3x^(Δhep)基因小鼠目的基因与蛋白的表达。选取8周龄雄性野生型C57/6J小鼠、Ddx3x^(Δhep)小鼠、Ddx3x^(fl/fl)小鼠,测定血清ALT、AST水平评价肝脏肝损伤情况。结果对F1代小鼠基因PCR鉴定的结果表明,基因型符合Ddx3x^(fl/fl);F1代小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代与Ddx3x^(fl/fl)小鼠杂交,即获得Ddx3x^(Δhep)小鼠;PCR与Western blotting结果显示,目的小鼠肝组织中Ddx3x基因和蛋白表达显著降低。此外,Ddx3x^(Δhep)小鼠无胚胎致死现象,出生后生理状况良好。正常饲养条件下,Ddx3x^(Δhep)小鼠与Ddx3x^(fl/fl)小鼠及野生型小鼠相比,血清ALT、AST指标及体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法成功构建了Ddx3x^(Δhep)小鼠动物模型,为后续研究Ddx3x在肝脏中的生物学功能及作用机制奠定了良好的基础。

T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定

目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Western blot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠基因稳定遗传。与Spi1^(flox/flox)小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。

蛋白激酶D3血管内皮细胞条件性敲除小鼠的构建及表型分析

目的构建Prkd3血管内皮细胞条件性敲除小鼠并分析其表型,探讨血管内皮细胞上Prkd3条件性敲除小鼠的敲除效率及可能的表型。方法利用Cre/LoxP系统构建血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠模型,即分别构建Prkd3flox/flox小鼠和Cdh5-Cre工具小鼠,再将两者进行交配,筛选得到Prkd3血管内皮条件性敲除小鼠(Cdh5-Cre;Prkd3flox/flox,简称Prkd3ΔEC)。在血管内皮细胞内特异性敲除Prkd3,通过鼠尾PCR法进行基因型鉴定;分离肝血窦内皮细胞并用Western blot检测敲除效率,通过功能学及组织病理学方法评估内皮细胞中Prkd3缺失对肝脏的影响。结果成功构建Prkd3ΔEC,敲除效率大于90%。表型分析发现,Prkd3ΔEC小鼠表现出自发性肝纤维化,随年龄增长逐渐加重(P<0.05);通过HE染色和天狼星红染色发现肝脏中胶原纤维增多,血管周围的纤维成分明显增多(P<0.05)。表明血管内皮细胞中Prkd3缺失能够诱发自发性肝纤维化。结论成功构建了Prkd3ΔEC,该条件性敲除小鼠的肝脏存在自发性肝纤维化情况。

条件性敲除动物模型在神经发育障碍疾病中应用的研究进展

神经发育障碍疾病(NDDs)是指一组在发育时期出现行为和认知障碍,表现为学习和执行某些智力、运动或社交技能时出现明显困难的疾病。随着科学技术的发展,条件性基因敲除技术在NDDs的研究方面应用广泛。本文基于Cre-Loxp系统NDDs条件性基因敲除动物模型的构建方法及其在NDDs相关疾病中的应用进展进行阐述。

FGFR2条件性敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定

目的 构建成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblastgrowthfactorreceptor 2,FGFR2)条件性敲除载体,并对中 靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR2条件性敲除小鼠模型,研究FGFR2在小鼠骨骼、肺脏等组织、器官发育过程 中的作用打下基础。方法 在分析小鼠FGFR2基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了条件性敲除小鼠FGFR2外 显子7、8的基因打靶载体,采用电穿孔法在ES细胞中进行了打靶重组,G418与Ganciclovir被用于对电转的ES细胞进行正 负筛选,最后对ES细胞克隆进行了Southern与PCR鉴定。结果 将所构建的条件性打靶载体通过电穿孔转染入表达重组 酶(Cre)的AmI细菌,经PCR、酶切和测序鉴定,Cre酶能正确将条件性打靶载体的外显子7、8和选择性标记Neo基因经重 组剔除,电转了基因敲除载体的ES细胞经正负筛选后共挑取克隆83个;经5′端探针Southern杂交鉴定,发现4株阳性克 隆;该4株克隆再经3′端探针Southern杂交鉴定,发现2株阳性克隆;最后经Southern和PCR检测发现1株ES细胞克隆仍 保留外显子7、8两侧的loxP序列。结论 FGFR2条件性基因敲除ES细胞已成功构建。

基于生长素诱导降解系统条件性敲除弓形虫ATG6蛋白的研究

为构建生长素诱导降解系统的弓形虫条件性基因缺失虫株,本研究首先利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选获得Tg Ku80基因缺失虫株,然后采用该缺失虫株,利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选,将生长素诱导降解因子(AID)插入该弓形虫Tg ATG6基因序列的5’端得到TgATG6条件性敲除虫株TgATG6-i KD。PCR扩增及测序结果显示,以TgATG6-iKD虫株为模板可扩增出AID标签,而在野生型虫株中,不能有效扩增该靶序列,经测序验证也得到相符结果,表明AID标签序列能够高效定点插入到弓形虫Tg Ku80基因缺失虫株中;通过蛋白免疫印迹试验能够在TgATG6条件性敲除虫株检测到AID标签和TgATG6蛋白的融合表达;蛋白免疫印迹试验及间接免疫荧光实验结果显示,利用生长素(NAA)能够快速诱导融合表达蛋白的降解。本研究通过蛋白N端融合AID共表达,建立了高效条件性敲除弓形虫基因的方法,为进一步研究弓形虫相关基因的功能奠定基础。

Pumilio1/Pumilio2双基因条件性敲除小鼠模型的建立及基因型鉴定

目的建立及鉴定Pumilio1/Pumilio2(Pum1和Pum2)双基因条件性敲除的小鼠模型,为进一步研究PUF家族在哺乳动物精子发生中的生物学功能奠定基础。方法将构建的Pum1条件性敲除和Pum2条件性敲除的两个品系小鼠进行交配并繁殖,最终繁殖成功的子代小仔Pum1和Pum2两个基因均为纯合子。对子代以剪趾方式进行编号,提取子代小鼠脚趾或鼠尾基因组DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型。结果 Pum1和Pum2双基因条件性敲除的小鼠模型繁殖成功,同时获得更多PUF家族双基因条件性敲除的小鼠。结论成功建立了Pum1和Pum2双基因条件性敲除的小鼠模型;正确的交配繁殖策略和鉴定方法是获得PUF家族双基因条件性敲除小鼠的有效途径。

肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠的构建及鉴定

目的·构建肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠,并进行表型鉴定,为进一步研究C/EBPα在肾间质纤维化中的作用奠定基础。方法·利用C/EBPα^(flox/flox)和pepck-Cre^+转基因小鼠进行饲养和杂交;将繁殖产生的第1代小鼠再次进行交配,得到第2代小鼠。通过PCR鉴定出基因型为C/EBPα^(flox/flox).pepck-Cre^+的小鼠(C/EBPα^(-/-)小鼠)。采用RT-q PCR及免疫组织化学法分别检测肾组织中C/EBPαmRNA和蛋白表达水平。应用H-E染色、Masson染色观察6~8周龄C/EBPα^(-/-)小鼠及野生型(WT)小鼠肾脏组织形态学改变。结果·2种转基因小鼠繁殖产生的第2代小鼠基因型符合孟德尔遗传定律,交配后获得C/EBPα^(-/-)小鼠。与WT小鼠相比,C/EBPα^(-/-)小鼠肾脏中C/EBPαmRNA及蛋白表达水平下降,光学显微镜下肾脏组织形态无明显改变。结论·应用Cre-loxp系统可以成功地敲除小鼠肾小管上皮细胞中C/EBPα基因,且在基础情况下C/EBPα^(-/-)小鼠肾脏组织无明显形态学改变。

低氧诱导因子-1α条件性敲除载体的构建

目的 通过建立低氧诱导因子 1α(hypoxiainduciblefactor 1α ,HIF 1α)条件性敲除载体 ,并在体外验证引入的LoxP介导的同源重组等情况 ,为最终建立HIF 1α条件性敲除小鼠模型奠定基础。方法 以含有neo、tk基因的pLoxPneo载体为基本骨架 ,用涵盖 3、4、5、6号外显子的HIF 1α基因组片段 ( 7.6kb)为构建载体的同源DNA片段 ,通过引入LoxP等步骤 ,最终建立旨在条件性敲除HIF 1α第 5号外显子的条件性敲除载体。结果 经酶切 ,测序和在体外细菌中用cre介导的重组等方法证明成功地构建了HIF 1α的条件性敲除载体。结论 成功地构建了HIF 1α的条件性敲除载体 ,为今后进一步获得HIF

成年新生神经元NMDA受体NR2B亚型基因条件性敲除模型建立

目的:建立成年神经发生中新生颗粒细胞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚型基因条件性敲除模型。方法:运用逆转录病毒基因标记技术,结合Cre-1oxp重组酶系统,在ROSA26-LacZ基因报告小鼠体内研究逆转录病毒RSV-pGFP:T2aCre的Cre酶重组的发生以及其转化效率。在NR2Bfl/fl转基因小鼠中建立成年新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型。结果:在逆转录病毒注射后14 d,观察到LacZ标记的神经元及β-gal和Cre免疫荧光双标阳性细胞,在海马齿状回颗粒下层、颗粒层以及hilus区表达;同时在嗅球颗粒层也可见LacZ表达。28 dCre转化效率高达98.3%。在NR2Bfl/fl转基因小鼠,14 d时分别在嗅球和齿状回的颗粒细胞层,观察到GFP和Cre同时标记的阳性新生颗粒细胞。结论:成年神经发生中起源于海马齿状回颗粒下层和侧脑室旁脑室管膜下区的新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型建立。

用重组工程技术快速构建Shank3条件性敲除载体

目的:构建Shank3条件性敲除载体,最终用于构建Shank3条件性敲除小鼠。方法:用重组工程技术来快速高效地构建条件敲除载体。结果:成功构建得到Shank3条件性敲除载体。结论:重组工程技术是一个用于构建条件性敲除载体成熟而高效的方法。

精子特异性锌指蛋白146条件性敲除小鼠的构建及鉴定

目的探讨构建精子特异性RNF146敲除小鼠及其鉴定方法。方法从NCBI网站上检索小鼠RNF146的基因序列,分析外显子与各剪接体的关系以及起始密码子和终止密码子所在区域,选择条件性基因敲除片段。构建基于Cre/Lox P系统的RNF146条件性敲除杂合子(RNF146^(flox/+))小鼠(F1代)。取F1代RNF146^(flox/)+杂合子小鼠自交,PCR鉴定其后代基因型,挑选RNF146纯合子敲除(RNF146^(flox/flox))雌鼠与精子特异性Cre转基因雄鼠AQP2-Cre进行杂交。PCR检测其后代基因型,选取AQP2-Cre阳性的RNF146杂合子雄鼠(AQP2-Cre;RNF146^(flox/+))与RNF146纯合子(RNF146^(flox/flox))雌鼠回交后筛选AQP2-Cre阳性的RNF146纯合子小鼠(AQP2-Cre;RNF146^(flox/flox))即为精子特异性RNF146敲除小鼠。选取9~10周龄(体成熟)的精子特异性RNF146敲除小鼠,从附睾和输精管中分离精子,以AQP2-Cre;RNF146^(flox/+)小鼠为对照,Real-time PCR及Western blot分析精子中RNF146表达水平确认敲减效率。结果RNF146基因四号外显子被选为敲除区域来构建基于Cre/Lox P系统的条件性敲除小鼠。F1代杂合子(RNF146^(flox/+))小鼠自交后代中约1/4个体为RNF146^(flox/flox);AQP2-Cre转基因工具鼠与纯合子(RNF146^(flox/flox))雌鼠交配后代中具有AQP2-Cre;RNF146^(flox/+)基因型的小鼠约占1/2;AQP2-Cre;RNF146^(flox/+)雄鼠和RNF146^(flox/flox)雌鼠交配后代中近1/4为AQP2-Cre;RNF146^(flox/flox)小鼠。成年AQP2-Cre;RNF146^(flox/flox)小鼠精子中RNF146 m RNA(Real-time PCR)和蛋白表达水平(Western blot)分别降低77.3%(P<0.001)和89.2%(P<0.001)。结论成功构建精子特异性RNF146条件性敲除小鼠AQP2-Cre;RNF146^(flox/flox)。

p53凋亡刺激蛋白2基因肝脏条件性敲除小鼠的构建和鉴定

目的采用Cre-LoxP系统构建p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)基因肝脏条件性敲除小鼠。方法利用自行设计的sgRNA序列,在ASPP2基因两端插入LoxP序列,构建ASPP2-flox小鼠。采用PCR法和测序法对F0代和F1代小鼠进行基因型鉴定。将ASPP2-flox F1小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏敲除ASPP2基因小鼠。采用PCR法进行基因型鉴定。采用Westernblot和免疫组化法检测ASPP2基因肝脏敲除小鼠肝脏ASPP2蛋白表达。结果对F0代和F1代动物基因行PCR和测序结果表明,构建ASPP2-flox小鼠成功;F1代杂合子的基因型为ASPP2^(fl/-);将F1代杂合子与Alb-Cre小鼠进行杂交后,回交ASPP2^(fl/-)小鼠,其基因型为ASPP2^(fl/fl) Cre^(T),即为ASPP2肝脏条件性敲除小鼠;经Western blot和免疫组化法检测显示ASPP2^(fl/fl) Cre^(T)小鼠肝脏ASPP2蛋白表达显著减少。结论基于Cre-LoxP系统成功构建ASPP2基因肝脏条件性敲除小鼠,为后续实验作了良好的基础。

小鼠Pkd2基因条件性敲除打靶载体的构建

[目的]构建小鼠Pkd2条件性基因敲除打靶载体,为建立Pkd2基因条件性敲除小鼠模型奠定基础。[方法]以正常小鼠(129x1/SvJ)基因组DNA为模板,扩增小鼠Pkd2基因一段包括第9号外显子的长为9.3kb的序列,通过引入LoxP和Neo基因等步骤,建立条件性敲除Pkd2第9号外显子的条件性基因打靶载体。[结果]经多个限制性核酸酶酶切鉴定和测序证实,所构建的Pkd2基因条件性敲除打靶载体符合设计要求。[结论]成功构建小鼠条件性Pkd2基因敲除打靶载体,为建立Pkd2基因条件性敲除小鼠模型奠定基础。

神经系统SARM1条件性敲除小鼠的构建及其应用

目的:构建SARM1基因在神经细胞中条件性敲除小鼠模型,为探究SARM1基因在神经系统中的功能提供研究工具。方法:运用ES细胞打靶的方式构建SARM1^(flox/flox)转基因小鼠,并将其与表达Nestin-Cre重组酶的工具鼠进行杂交以产生神经元特异性SARM1基因敲除小鼠。然后使用PCR对敲除小鼠进行基因型鉴定,使用Western blot验证基因敲除效果。通过对小鼠进行旷场与高架十字迷宫试验来评估小鼠的情绪行为和焦虑水平。结果:SARM1蛋白主要表达于中枢神经系统,在神经元中高表达。PCR结果表明,成功构建了神经元特异性SARM1基因敲除小鼠。Western blot结果显示,与正常小鼠对比,SARM1^(Nestin)-CKO小鼠的脑组织中SARM1蛋白表达显著降低(P<0.05),并且SARM1基因敲除不影响小鼠的正常生长发育,也不影响脑组织的一般形态和神经细胞的数量。同时发现该条件性敲除小鼠不存在明显的焦虑样表型。结论:成功构建了SARM1基因在神经细胞中特异性敲除的小鼠动物模型,可为探讨SARM1基因在神经精神疾病中的作用提供重要研究平台。

条件性敲除CD4^+T细胞的多巴胺D2受体对帕金森病模型小鼠的影响

目的:研究CD4+T细胞上的多巴胺D2受体(dopamine receptor D2, DRD2)对帕金森病(Parkinson′s disease,PD)模型小鼠的影响。方法:条件性敲除CD4+T细胞DRD2基因的雄性小鼠(CD4-Cre Drd2fl/fl)、C57BL/6小鼠通过腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)制备PD模型,注射7 d后,用旷场实验法来测量小鼠运动的平均速度,再无菌取小鼠脾脏,制备单个核细胞悬液,用Trizol法提取细胞总RNA,然后用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测小鼠脾脏单个核细胞中的促炎因子白细胞介素(interleukin, IL)-17、干扰素γ(interferonγ, IFN-γ)和抗炎因子IL-4、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的表达。用流式细胞术来检测脾脏中CD4+T细胞占单个核细胞的百分比。结果:CD4-Cre Drd2fl/fl PD模型小鼠旷场运动速度较野生型PD模型小鼠减慢,脾脏中CD4+T细胞占单个核细胞的百分比较野生型PD模型小鼠降低,脾脏单个核细胞中IL-17、IFN-γ的mRNA表达均高于野生PD模型小鼠,IL-4、TGF-β1的mRNA表达没有明显变化。结论:条件性敲除CD4+T细胞DRD2基因加重了PD模型小鼠的病变及外周炎症的变化。

软骨细胞条件性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型点突变小鼠的获得及其表型初步分析

目的获得在软骨细胞中条件性敲除PTEN基因的FGFR3增强型点突变小鼠并进行初步表型分析。方法通过PTEN条件性基因敲除小鼠（Pten^flox/flox小鼠），与软骨细胞特异表达Cre重组酶的小鼠（Col2αCre）交配，获得在软骨细胞中特异敲除PTEN基因小鼠（Co12αCre：Pten^flox/flox）；同时，利用Pten^flox/flox小鼠与FGFR3增强型点突变小鼠（Fgfr3^G369C/小鼠，即ACH小鼠）交配，子代杂合子小鼠（Pten^flox/＋：ACH）之间再交配，获得Pten^flox/flox：ACH小鼠；通过Col2αCre：Pten^flox/flox和Pten^flox/flox：ACH交配即可获得在软骨细胞中特异性敲除PTEN基因的FGFR3增强型点突变小鼠（Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH）。采用PCR对小鼠基因型进行鉴定，免疫荧光染色检测PTEN基因的敲除效率，通过X光平片摄影对小鼠的表型进行初步分析。结果获得了在软骨细胞中敲除PTEN的FGFR3点突变小鼠，免疫荧光染色证实Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠软骨细胞中PTEN蛋白因为基因敲除而表达很低。初步的表型分析显示：Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠身长、尾长均较Pten^flox/flox：ACH小鼠长（P〈0．05，n=5）。Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠表型，较Pten^flox/flox：ACH小鼠的侏儒表型有所缓解。结论采用基于Cre／LoxP系统的条件性基因敲除策略，获得了在软骨细胞中敲除PTEN基因的FGFR3增强型突变小鼠，表型分析初步显示，软骨细胞特异性敲除PTEN基因可部分缓解由FGFR3增强型点突变所导致的小鼠侏儒表型。该小鼠的获得，为研究P13K／AKT信号通路在FGFR3突变介导的软骨生长抑制中的作用提供了实验动物平台。

条件性敲除APC基因小鼠肠道腺瘤模型的构建

腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因是家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)的致病基因,APC基因的突变导致小鼠多处产生肿瘤,但肠道条件性敲除APC基因后,小鼠的表型并不清楚。该研究利用Cre-LoxP重组酶系统,在肠道绒毛和隐窝上皮细胞条件性敲除APC基因,并对小鼠表型进行鉴定和分析。将Villin Cre小鼠和APC^(fl/fl)小鼠合笼得到Villin Cre;APC^(fl/+)小鼠;有意思的是后者进一步与APC^(fl/fl)小鼠合笼,却没有得到Villin Cre;APC^(fl/fl)小鼠。进一步解剖Villin Cre;APC^(fl/+)小鼠,发现其自发产生肠道肿瘤,并能携瘤生存,免疫组化显示瘤体组织激活了Wnt信号通路。结果表明成功地构建了小鼠肠道条件性敲除APC基因腺瘤模型,为进一步研究APC基因在肠道发育以及肠道肿瘤的作用提供了优良的工具。

条件性敲除Fam20C对小鼠牙周膜内MMP-1及TIMP-1表达的影响

目的:探讨3.6 kb Col1α1启动子驱动下敲除Fam20C对小鼠牙周组织的影响。方法:取4周龄和12周龄3.6 kb Col1α1-Cre;Fam20C^(fl/fl)小鼠和同窝正常对照小鼠下颌骨组织蜡块,常规制作下颌磨牙区石蜡切片,分别进行HE染色、Masson染色和免疫组织化学染色。观察两组小鼠磨牙区牙骨质、牙槽骨和牙周膜的组织学变化,测量光密度值分析牙周膜内MMP-1和TIMP-1的差异表达,SPSS 26.0统计软件对各组数据行独立样本t检验。结果:与正常对照小鼠相比,4周龄Fam20C敲除小鼠磨牙区细胞牙骨质变薄;磨牙间牙槽骨高度降低;牙周膜胶原纤维束直径减小,部分纤维束排列疏松无序;牙周膜内MMP-1阳性表达显著增加(P<0.05),TIMP-1阳性表达少量降低(P>0.05),MMP-1/TIMP-1比值显著增加(P<0.05)。12周龄Fam20C敲除小鼠较4周龄敲除小鼠牙周组织病变严重,细胞牙骨质显著减少;磨牙间牙槽骨高度明显降低;牙周膜胶原纤维束更加纤细稀疏、排列紊乱,根颈部下方大量胶原纤维束断裂,与牙骨质和牙槽骨表面脱离;牙周膜内MMP-1和TIMP-1的差异表达趋势与4周龄组一致。结论:3.6 kb Col1α1启动子驱动下敲除Fam20C可能通过上调牙周膜内MMP-1/TIMP-1比值导致小鼠牙周病变。

条件性敲除软骨组织中FGF9基因小鼠模型的建立

目的:利用Cre-LoxP系统建立可调控的软骨组织条件性敲除成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor,FGF9)小鼠模型。方法:构建针对小鼠Fgf9基因2号外显子的重组载体,电穿孔转染胚胎干细胞(ES细胞)。选择药物G418和Ganc,筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定。利用显微注射将ES细胞注入C57BL/6J小鼠囊胚,移入假孕小鼠子宫,获得含Neo的flox杂合小鼠。该小鼠去Neo后,与ColⅡ-Cre转基因小鼠杂交,并以他莫昔芬诱导,其后代软骨细胞内flox纯合、Cre阳性小鼠的flox区域被敲除。结果:Fgf9基因flox杂合子小鼠无明显异常,可稳定繁殖。该flox小鼠与ColⅡ-Cre转基因小鼠交配后,成功建立条件性敲除软骨组织中Fgf9基因小鼠模型。结论:利用Cre-LoxP系统,可成功建立Fgf9基因条件性敲除小鼠模型,为后续研究FGF9在骨软骨发育及骨关节稳态维持中的功能奠定了基础。