基于环境DNA宏条形码技术的南京不同林地陆生昆虫多样性差异分析初探

为探究环境DNA宏条形码技术在多种林分下昆虫生物多样性调查中的可行性,采用马氏网法,于2022年3—5月,对江苏省南京市六合区、高淳区和江宁区的人工林、杂木林以及天然次生林开展昆虫生物多样性调查。通过环境DNA宏条形码技术共注释到陆生昆虫11目100科330种465个分类操作单元(Operational Taxonomic Unit,OTUs)521219条序列,其中鳞翅目、双翅目和半翅目为优势种群。Chao1指数和ACE指数结果显示,天然次生林的物种丰富度最高,其次是杂木林和人工林。香农维纳(Shannon-Wiener)多样性指数表明天然次生林的生物多样性较好,杂木林次之,人工林较差。基于此,对环境DNA宏条形码技术在陆生昆虫多样性监测中的表现进行讨论,以期为陆生昆虫多样性监测方法提供新思路与技术参考。

DNA条形码技术在蛇类鉴别中的应用

从NCBI中GenBank数据库下载蛇类细胞色素b基因(Cytb)序列7329条,以MT765098.1序列为标准进行对比和修剪,获得蛇类Cytb序列4665条。对蛇类Cytb序列进行核苷酸饱和度、遗传多样性、种内和种间遗传距离计算,构建系统发育树。结果表明,基于Kimura–2–Parameter模型,蛇类平均种内遗传距离为3.3%,普遍小于6.7%,而平均种间遗传距离为19.96%,普遍高于9.3%,说明蛇类物种间遗传距离存在较大差异。根据蛇类物种间遗传距离,识别出蛇类23个物种的亚种,Pareas和Hydrophis属物种含有复合体,Atractus dunni、A.iridescen和A.occidentali互为姐妹物种。

柳树DNA条形码的筛选与鉴定研究

柳树具观赏、生物修复、生物能源等多种功能,对其开展DNA条形码评估在种质资源保护和利用方面具有非常重要的应用价值。通过对柳树样品进行ITS、ITS2、matK、rbcL和rpoC1片段扩增和测序,结合GenBank数据,共获得柳树22个种,63份样品共计396条序列。比较了5个DNA片段的通用性、序列特征、种内和种间变异,并基于Best Match(BM)、Best Close Match(BCM)、BLAST及Neighbor Joining(NJ)4种方法评估DNA条形码在柳树中的鉴定能力。结果表明,5个DNA条形码中,ITS在柳树种扩增效率和测序成功率高,种内和种间遗传变异明显,鉴定效率最高,建议作为首选的单位点DNA条形码;3个条形码组合中,ITS+ITS2+rbcL鉴定成功率最高,为78.16%,4个DNA条形码组合中,ITS+ITS2+matK+rbcL物种鉴别成功率最高,为88.28%,建议ITS+ITS2+matK+rbcL作为柳树分子鉴定最优条形码组合。

基于DNA宏条形码技术的斑海豹食性分析

野生动物食性研究是掌握动物生境需求的核心内容,对野生动物的保护和管理具有重要意义。在我国辽东湾斑海豹(Phoca largha)传统繁殖地和盘锦栖息地海域采集其粪便,选用12S rRNA作为分子标记进行粪便DNA扩增,利用高通量测序鉴定其食物组成。结果发现:在斑海豹粪便中共鉴定出鱼类16种,隶属5目8科13属。食物组成的相对丰度显示:梭鱼(Liza haematocheilus)为绝对优势的饵料食物(40.72%),其次为鰕虎科(Gobiidae)种类(23.18%)。属水平不同采样群体的相对丰度显示:2021年、2023年辽东湾北部冰区和2023年盘锦辽河口栖息地排在前3位的种类分别是梭属(Liza)31.91%、矛尾鰕虎属(Chaeturichthys)14.06%和缟鰕虎属(Tri⁃dentiger)8.39%,梭属42.37%、复鰕虎属(Acanthogobius)14.06%和矛尾鰕虎属11.17%,及梭属47.93%、矛尾鰕虎属13.93%和绵鳚属(Zoarces)12.18%,分别合计占斑海豹3个群体食物组成相对丰度的54.36%、67.60%和74.04%。研究结果与辽东湾北部的渔业资源优势物种一致,表明斑海豹为广食性物种,其食物组成主要取决于栖息海域、季节及主要猎物种类的丰度。

基于DNA条形码ITS对西藏不同地理居群红景天的鉴定研究

目的:对大花红景天和长鞭红景天进行2种DNA条形码的碱基序列分析,并构建系统进化树,为大花红景天的真伪鉴定提供参考。方法:提取3份样品基因组DNA,对内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)片段进行PCR扩增,双向测序,获得其序列信息;运用MEGA7.0对所有样品的ITS序列及GenBank共21条进行比对、计算种内种间遗传距离,构建Neighbor-Joining(NJ)系统进化树。结果:编号为A1~A14的大花红景天聚为一支,编号为K1~K7的长鞭红景天聚为一支;同时发现ITS序列信息变化与地域和环境明显相关。结论:将ITS序列作为DNA条形码能准确、快速地鉴别大花红景天,可为其种质资源鉴定及物种鉴别提供依据。

中国蓑鲉亚科鱼类DNA条形码及分子系统进化研究

为从分子水平分析我国蓑鲉亚科鱼类分类关系,通过PCR扩增及测序获得了我国8种蓑鲉亚科鱼类COⅠ基因部分序列,结合GenBank下载的6种蓑鲉,共计14种40个个体线粒体COⅠ基因序列,利用MEGA X计算了序列信息和遗传距离,利用基于最大似然法和邻接法构建分子系统进化树。结果显示:除盔蓑鲉(Ebosia bleekeri)和安狭蓑鲉(Pteroidichthys amboinensis)只有一个样本无法测定外,其余12种蓑鲉亚科鱼类的种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的69.17倍,显示COⅠ基因可作为蓑鲉亚科鱼类的有效DNA条形码基因。进化树上,蓑鲉亚科部分属并未能聚成属间单系,其中蓑鲉属(Pterois)与短鳍蓑鲉属(Dendrochirus)在进化树上形成多个分支。在蓑鲉属中,翱翔蓑鲉(P.volitans)与斑鳍蓑鲉(P.miles)聚为一支,两者关系较近,但COⅠ遗传距离为0.042,大于Hebert推荐的0.020作为最小区分物种的遗传距离,支持两者为两个独立物种的观点;触须蓑鲉(P.antennata)、辐蓑鲉(P.radiate)和黑颊蓑鲉(P.mombasae)聚为一支,独立于翱翔蓑鲉与斑鳍蓑鲉的分支之外,并与短鳍蓑鲉属(Dendrochirus)的花斑短鳍蓑鲉(D.zebra)以及盔蓑鲉属(Ebosia)的种类聚在一起,与近期有关蓑鲉亚科各种属分子聚类研究结果相似;但这3种蓑鲉是否可以从蓑鲉属中独立出来归为Pteropterus属,还需要后续更多的蓑鲉亚科鱼类样品研究验证。

DNA条形码技术在桃蚜寄生蜂鉴定上的应用

桃蚜(Myzus persicae)是桃树上最重要的害虫之一,为明确其寄生性天敌的物种多样性,该研究对江苏沿海地区桃园内桃蚜僵蚜进行采集,待僵蚜中寄生蜂成虫羽化后采用形态学和DNA条形码的方法相结合进行鉴定。目前调查共发现该地区桃蚜寄生蜂有2科5种,分别为蚜小蜂科(Aphelinidae)的短矩蚜小蜂(Aphelinus abdominalis)和褐带蚜小蜂(Aphelinus maculatus);茧蜂科(Braconidae)的细长径蚜茧蜂(Lipolexis gracilis)、棉蚜茧蜂(Binodoxys communis)和烟蚜茧蜂(Aphidius gifuensis)。该研究提取了5种寄生蜂的COI基因,通过构建进化树的方法,发现分子鉴定与形态学鉴定结果一致,证明了DNA条形码技术在鉴定寄生蜂这类小型昆虫中的准确性和广阔的应用前景。

基于环境DNA宏条形码的汉江上游黄金峡段鱼类多样性研究

2020年,采用环境DNA宏条形码对汉江上游黄金峡鱼类多样性进行研究,并对比历史调查数据,构建汉江上游黄金峡段鱼类名录。从9个采样点中共检测出20种鱼类,占名录的45.45%;鲤鱼(Cyprinus_car-pio)、鲫鱼(Carassius_auratus)、圆吻鲴(Distoechodon_tumirostris)和银鮈(Squalidus_argentatus)为优势种;黄金峡上、下游Shannon指数存在显著性差异(P<0.01,n=9),上游鱼类Shannon指数明显大于下游,黄金峡水利枢纽是造成鱼类多样性空间差异的主要原因。环境DNA检测出的鱼类组成与过去传统方法监测的结果相近。环境DNA宏条形码技术是一种新兴的生物监测手段,可以辅助传统鱼类监测方法,快速检测汉江上游鱼类多样性及其空间分布。

淡水鱼类环境DNA宏条形码引物的筛选及其在千岛湖的应用

基于环境DNA(eDNA)技术的鱼类多样性监测方法因具有灵敏度高、对目标生物无伤害以及成本低等特点,近年来在国内外得到了广泛应用。eDNA方法的有效性往往取决于宏条形码引物的选择,尽管目前已经有一些鱼类环境DNA宏条形码引物,但较少有研究综合评估这些引物的检出效果。本研究评估了来自COI、Cytb、12S rRNA和16S rRNA基因的29对鱼类e DNA宏条形码引物(包括本研究设计的2对和从国内外文献中引用的27对引物),首先基于计算机模拟PCR(in silico PCR)进行了初步分析,随后通过高通量测序对其中效果较好的17对引物开展了更进一步的验证,结果显示:计算机模拟PCR结果良好的引物在进行高通量测序时并非全部表现良好,表明引物的筛选不能仅仅依靠计算机模拟PCR;具有更长扩增片段长度的宏条形码引物并没有获得理想中更好的扩增效果,表现效果好的引物大多是扩增片段长度处于200~300 bp之间的引物;相对于COI和Cytb而言,12S rRNA引物与16S rRNA引物均具有良好的扩增效果,适宜作为鱼类环境DNA宏条形码而用于鱼类多样性研究;同时,鉴于当前的鱼类DNA条形码数据库尚不完备以及不同引物的特性不同,使用多对引物将大大增加物种的检出概率和e DNA研究的可信性。本研究展示了eDNA在评估生物多样性方面的潜力,有助于将来的鱼类eDNA研究,从而为鱼类多样性的保护提供参考。

海三棱藨草及其近缘种的DNA条形码研究

海三棱藨草[×Bolboschoenoplectus mariqueter(Tang&F.T.Wang)Tatanov]的分类学地位至今尚无定论。为明确海三棱藨草的分类学地位并探讨其与近缘种的关系,该研究分别利用1个核基因(ITS)和5个叶绿体基因(mat K、ndh F、rbc L、trn L和trn L-trn F)的DNA条形码序列对海三棱藨草及其近缘种的4种21批样品进行扩增和测序,通过采用相似性搜索算法对单一序列和序列组合的物种鉴定效率进行评价,并基于贝叶斯推断方法构建系统发育树进行鉴定分析。结果表明:(1)ITS+mat K序列组合的物种鉴定效率最高,为71.4%,可实现海三棱藨草及其近缘种的种间区分、鉴定。(2)基于ITS+mat K序列组合构建海三棱藨草及其近缘种的系统发育树,发现同一物种的样品聚集度较好,海三棱藨草与三棱草属[Bolboschoenus(Asch.)Palla]的物种聚为一支,明显与水葱属[Schoenoplectus(Rchb.)Palla]物种分开,并且海三棱藨草与海滨三棱草[Bolboschoenus maritimus(Linnaeus)Palla]形成单系。综上所述,ITS+mat K序列组合可作为海三棱藨草及其近缘种物种鉴定的最佳条形码序列,研究结果不支持海三棱藨草为天然杂交种的观点,而应将其归入三棱草属中,海三棱藨草应为海滨三棱草的异名。该研究结果为海三棱藨草及其近缘种的分类学研究提供了分子依据。

药用蛇及其水提物的DNA微型条形码鉴别研究

目的:建立药用蛇及其水提物的DNA微型条形码鉴别方法。方法:通过比对药用蛇及常见11种混伪品的16S rRNA序列,建立约220 bp的蛇类DNA微型条形码,并与16S rRNA标准条形码比较,对药用蛇原料及水提物进行测序鉴定。采用MEGA-X软件分析遗传距离并以邻接法(NJ)构建系统发育树。结果:DNA微型条形码引物对药用蛇原料及水提物的扩增率为100%,鉴定率为100%。药用蛇及其混伪品的种内平均遗传距离均小于种间平均遗传距离,且各物种在NJ系统发育树中具有良好的单系性,并与16S rRNA标准条形码原料的鉴定结果一致。结论:该研究建立的蛇类DNA微型条形码可有效实现药用蛇原料及水提物等制品的物种鉴别,为保障蛇类原料、临床汤剂及配方颗粒等药品的安全性和有效性提供了技术支撑。

基于环境DNA宏条形码的青岚湖自然保护区鱼类组成及分布特征

为探究在不同引物、不同参考数据库下环境DNA技术检测结果的差异,于2021年4月,采用环境DNA宏条形码技术分析了青岚湖鱼类多样性。选取16S rRNA及Cytb 2种引物,NCBI及本地数据库2种数据库,分别进行比对注释。结果表明:在青岚湖29个采样点中,共检测到7目15科43属64种鱼类,其中在16S-NCBI情形下获得4目9科19属20种鱼类,在16S-本地数据库情形下获得6目13科27属38种鱼类,在Cytb-NCBI情形下获得4目6科16属19种鱼类,在Cytb-本地数据库情形下获得2目5科15属20种鱼类。在青岚湖29个采样点中,鱼类更多地分布于湖面宽阔的中间地带(如S31附近),且南部较北部更少,鱼种的分布呈现一定的空间相似性。就研究区域而言,选择16S rRNA引物及本地数据库可以获得更全面的鱼类物种。通过与青岚湖鱼类历史数据比对发现,环境DNA技术在研究区域具有较强的适用性,如能选择适当的引物和本地数据库,可以更全面地反映研究区域的物种组成情况。

药用植物DNA条形码与分子标记技术的研究进展

目的对药用植物DNA条形码技术和分子标记技术的研究进展进行综述,为药用植物鉴定、遗传育种及种质资源保护的进一步研究奠定基础。方法查阅总结近年来国内外文献,对DNA条形码技术和分子标记技术的特征、种类及在药用植物中的应用情况进行总结。结果DNA条形码和分子标记技术已经被广泛应用于药用植物中。DNA条形码技术能够迅速且精确地对药用植物进行鉴定,克服了传统鉴别方式的缺陷;分子标记技术则以其操作简便、敏感度高、结果精确等优势,在促进药用植物的科学研究中获得了广泛的应用。结论DNA条形码和分子标记技术的出现对药用植物的鉴定产生了积极的影响,为种质资源的保护、鉴定、亲缘关系分析和遗传进化提供了依据,随着科技的不断进步,DNA条形码和分子标记技术也将不断精确,并对中医药现代化产生更加深远的影响。

沪地龙COⅠ条形码和特征序列鉴定

目的:补充线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)条形码鉴定沪地龙的种内、种间遗传信息并提取特征序列用于辅助鉴别,提高COⅠ条形码鉴定沪地龙基原的准确度。方法:收集不同产地沪地龙和其他品种蚯蚓,采用COⅠ条形码方法鉴定并获得鉴定序列,使用MEGA 7.0软件对所得序列进行系统发育树分析,计算各品种的种内、种间遗传距离,提取沪地龙3个基原的特征序列。结果:通俗环毛蚓与威廉环毛蚓的遗传距离为0.074,两者与栉盲环毛蚓间的遗传距离分别为0.187、0.194。经筛选整理后,共获得22个蚯蚓种类的271条序列,其中测序合并后得到序列218条、GenBank下载参考序列53条。发育树结果表明,不同蚯蚓种类在科与种一级均单独聚为一类,而属一级中,巨蚓科(Megascolecidae)腔蚓属(Metaphire)与远盲蚓属(Amynthas)未能较好区分。在通俗环毛蚓中提取了2条特征序列,威廉环毛蚓和栉盲环毛蚓中各提取了1条特征序列。结论:COⅠ条形码能够鉴定沪地龙与其他蚯蚓,特征序列能辅助提高沪地龙基原鉴定的效率和准确度。

败酱草及其近缘种叶绿体全基因组分析和DNA条形码构建

目的:基于败酱类药材基原植物的叶绿体基因组序列分析开发特定的DNA条形码,准确鉴别败酱草及其近缘种。方法:采用Illumina高通量测序技术对败酱科败酱属植物白花败酱、黄花败酱和异叶败酱的叶绿体基因组进行测序;采用生物信息学软件对基因组进行组装注释、特征分析、序列比较和系统发育分析;基于叶绿体基因组高突变区构建特异性DNA条形码进行验证。结果:3种败酱属植物叶绿体基因组呈四分体结构,全长分别为159585、158919、158919 bp,编码的基因数分别为130、132、132,包含8个rRNA基因和37个tRNA基因,蛋白质编码基因数分别为85、87、87。ccsA、ndhG、rpl23、ndhF序列作为特异性DNA条形码成功扩增16份样品,黄花败酱、白花败酱和少蕊败酱聚类在同一支,异叶败酱和糙叶败酱聚类在另一支。通过ccsA、ndhG、ndhF序列可进一步鉴别糙叶败酱和异叶败酱。结论:ccsA、ndhG、rpl23、ndhF序列可作为补充特异性DNA条形码区分败酱草及其近缘种。

基于粪便DNA宏条形码的人工草地放牧绵羊采食组分研究

准确获取食草动物食性数据有助于了解草地放牧家畜的营养状况,同时也对掌握草地植物群落的动态变化具有重要意义。本研究通过从滩羊粪便样本中提取DNA,利用ITS2条形码和粪便DNA宏条形码技术(fDNA metabarcoding),基于出现频率(Frequency of occurrence,FO)和相对序列丰度(Relative read abundance,RRA)两个指标快速分析获得粪便中的物种组成。分析获得的滩羊食物组成包含28个植物类群,主要有藜属(Chenopodium sp.)、苜蓿属(Medicago sp.)、蒿属(Artemisia sp.)等隶属于13科23属,其中27个鉴定到种水平,物种鉴定分辨率高达96%。藜属FO和RRA均最高,分别为100.0%和31.5%,其次为紫花苜蓿(Medicago sativa),分别为100.0%和26.9%。基于两种算法分析得到的食物比例具有差异性和一致性,其中紫花苜蓿是放牧滩羊的主要采食来源,但摄入比例需要校正。研究证明了基于ITS2片段的粪便DNA宏条形码技术在食草家畜快速准确食性分析中的可行性,为此类研究提供了有力借鉴。建议采用该技术时应完善潜在摄食植物DNA条形码数据库,准确分析目标家畜在特定区域内的采食种类。

基于水体及胃含物DNA宏条形码技术的斑鳠幼鱼食性分析

为摸清斑鳠(Mystus guttatus)幼鱼的食性和生物学特征,为其资源保护和种群恢复提供科学依据,采用DNA宏条形码技术分析了贵州省罗甸县斑鳠保种场河道中的斑鳠幼鱼胃含物及水体的物种特征。结果显示:1)在斑鳠幼鱼胃含物中共鉴定出109种生物,分属于15个门,12大类。从门水平看,节肢动物门相对丰度最高,其次是轮虫动物门、绿藻门、脊索动物门。从属水平看,中镖水蚤属(Sinodiaptomus)相对丰度最高,其次是臂尾轮虫属(Brachionus)、鲃属(Barbus)和Paralamyctes。2)在斑鳠幼鱼生存的河道中,共获得193个物种,分属于18个门。从门水平来看,节肢动物门相对丰度最高,其次是绿藻门。从属水平来看,中镖水蚤属的相对丰度最高,其次是衣藻属(Chlamydomonas),占比较高的还有臂尾轮虫属、筒壳虫属(Tintinnidium)和单壳缝藻属(Monoraphidium)。节肢动物门、轮虫动物门和绿藻门在斑鳠幼鱼胃含物中和水体中都是相对丰度较高的类群。在水体中,脊索动物门相对丰度较低(第15位),而在胃含物中列第4位。研究揭示了斑鳠幼鱼食性选择受水域环境食物的易得性及其喜好性两方面的影响。从能量收支效益的角度来看,斑鳠幼鱼在摄食过程中遵循以最小的能量投入获取最大收益的原则,利于幼鱼存活与生长。

浙江沿岸日本鳀幼鱼渔业兼捕鱼类的DNA条形码鉴定

为全面了解日本鳀幼鱼渔业兼捕种类,探究线粒体细胞色素氧化酶亚单位I(COⅠ)基因片段在幼鱼鉴定方面的有效性,本实验采用DNA条形码辅助形态分类的方法,以2021年浙江沿岸日本鳀幼鱼渔业兼捕所得192尾鱼为研究对象进行条形码研究,最终鉴定出48种鱼类,隶属2纲11目36科46属,其中46个种类鉴定到种,2个种类鉴定到属,并成功鉴别11个形态学误判鱼种。研究共获得152条COⅠ序列,平均长度为654 bp(634~656 bp);种间平均遗传距离(0.2523)为种内平均遗传距离(0.0034)的74倍,表明基于COⅠ基因可以有效鉴定幼鱼;自动条形码间隙检索ABGD分析产生48个OTUs,与形态学分类结果一致;基于COⅠ基因构建系统发育树,同一种类的个体均聚为一支,物种可以有效区分,但在科级和目级水平的聚类关系不清晰,DNA条形码鉴定结果与形态学鉴定结果基本一致。研究表明,DNA条形码可作为鉴定浙江沿岸日本鳀幼鱼渔业兼捕鱼类的有效方法,弥补了传统形态学鉴定方法的不足。作为一种便捷、高效的物种识别工具,该技术可以有效提高渔业资源评估中鱼种组成的准确性。研究结果为浙江沿岸鱼类多样性及产卵洄游研究奠定了基础,同时为日本鳀幼鱼渔业的可持续利用提供科学依据。

基于ITS条形码的滇鸡血藤及混伪品分子鉴定

目的:基于内转录间隔区(ITS)序列,运用DNA条形码技术对滇鸡血藤药材及其混伪品进行序列比对分析,根据单核苷酸多态性位点构建滇鸡血藤单倍型数据库,建立快速、准确鉴定滇鸡血藤的分子鉴定方法。方法:以滇鸡血藤及其混伪品为材料,利用DNA提取试剂盒,分别提取滇鸡血藤及其混伪品的总DNA,对ITS序列进行聚合酶链式反应扩增及测序分析,使用DNAMAN软件统计其片段长度及变异位点个数,使用MEGA软件对数据进行分析比对,计算Kimura2-parameter遗传距离,并利用邻接法建立系统发育树进行分析。结果:滇鸡血藤ITS序列片段长度为675 bp,共包括19种单倍型,与其主要混伪品的差异位点为212、223、224 bp,系统发育树显示,ITS序列能够区分滇鸡血藤及其混伪品。结论:ITS条形码可以作为区分鉴定滇鸡血藤及其混伪品的分子条形码,包含19个单倍型的单倍型数据库覆盖了滇鸡血藤全部的单倍型。

浮游藻类环境DNA宏条形码监测引物的比较与验证

环境DNA(eDNA)宏条形码技术通量高、重复性好,在未来生态环境监测中有巨大的应用潜力。目前,浮游藻类环境DNA监测仍处在发展阶段,尚缺乏统一的浮游藻类扩增引物。利用同一个野外环境样本,比较8对通用引物在浮游藻类环境DNA监测中的差异,为初步建立规范化的浮游藻类环境DNA监测方法提供支撑。结果表明,不同引物对浮游藻类扩增存在明显偏好性,靶向扩增16S rDNA的引物主要检出硅藻,其次是隐藻和绿藻;靶向扩增18S rDNA的1391、AD3和ANF 3对引物具有较高的浮游藻类扩增效率和物种辨识度,分别检出67、62、63个浮游藻属,其检出的浮游藻类的相对丰度排序均为硅藻>绿藻>隐藻>金藻>甲藻,可以作为通用引物用于浮游藻类环境DNA宏条形码监测。