枯草芽胞杆菌GXHZ16抑制烟草疫霉病菌的表达谱分析

烟草黑胫病由烟草疫霉菌Phytophthora nicotianae侵染引起,是烟草生产上一种分布广泛、为害严重的土传病害。本实验室前期从广西贺州富川烟区健康烟株根际土壤中分离筛选获得一株枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis GXHZ16,对峙培养发现该菌株对烟草疫霉菌具有良好的拮抗活性(抑制率65.79%)。为探究菌株GXHZ16对烟草疫霉菌的可能抑制分子机理,本研究分别针对枯草芽胞杆菌GXHZ16与烟草疫霉菌对峙培养36h(处理组)和0h(对照组)的混合样品,采用高通量转录组测序(RNA-Seq)技术结合生物信息学分析对峙培养36 h后枯草芽胞杆菌的基因差异表达谱及所涉及的信号通路变化。结果发现:对峙培养36 h后枯草芽胞杆菌GXHZ16有1607个基因发生了显著差异表达,包括810个上调表达基因和797个下调表达基因;其中筛选获得的显著表达基因特别是上调表达的基因(包括鞭毛装配、细菌趋化性相关基因以及与表面活性素、丰原素和制磷脂菌素合成相关的10个相关基因)可能均涉及枯草芽胞杆菌对烟草疫霉菌的抑制作用。进一步的GO富集分析显示,共有1343个差异表达基因被注释到不同的功能亚类中,涉及差异基因最多的为细胞组分类别中的细胞解剖实体。特别地,KEGG富集分析显示,共有551个差异表达基因归到数百个Pathway中,其中涉及差异表达基因最多的是微生物在不同环境中的代谢途径;其他主要代谢途径有鞭毛装配和淀粉蔗糖代谢等;此外,细菌趋化性通路和单环菌素生物合成通路也高度富集。总之,本研究从转录组水平分析获得了枯草芽胞杆菌(与烟草疫霉对峙培养后)的基因差异表达图谱及相关调控代谢途径;为进一步阐明芽胞杆菌抑制植物病原真菌的生防机制并提高枯草芽胞杆菌的生防效果奠定了基础。

1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其产脂肪酶特性

【目的】对1株产脂肪酶细菌MY016进行鉴定并对其产脂肪酶特性进行研究,为后期规模化发酵生产脂肪酶及其在畜牧业中的实际应用奠定基础。【方法】采用形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA测序分析,对实验室分离保存的1株产脂肪酶细菌MY016进行鉴定;通过菌落和芽胞计数、生长曲线测定,对MY016的生长特性进行分析;通过产脂肪酶量和酶活检测、脂肪酶基因扩增和系统进化分析,对MY016菌株的产脂肪酶特性进行探讨。【结果】产脂肪酶细菌MY016经形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA分析,被鉴定为枯草芽胞杆菌。MY016在培养2 h后进入对数生长期,生长迅速;培养10 h其菌液600 nm吸光度最高达到4.7,随后进入稳定期;12 h时活菌数约为5.3×10^(9)CFU/mL;培养22 h后开始二次生长,吸光度最高达5.2;培养46 h后进入衰退期。芽胞观察和计数结果显示,MY016菌株在接种16 h后开始形成芽胞,随着培养时间延长,芽胞形成率逐渐升高,直至72 h完全形成芽胞,芽胞数最高为1.9×10^(9)CFU/mL。产脂肪酶能力检测结果显示,MY016菌株在培养36 h时产酶量达到最大,为246.918 mg/L,然后总酶量逐步降低;48 h时总酶活达到最高,约为281.883 U/L。成功扩增了MY016菌株的脂肪酶基因,并构建系统进化树,结果显示MY016脂肪酶基因与其他芽胞杆菌的脂肪酶基因亲缘关系最近,表明其脂肪酶基因进化保守。【结论】产脂肪酶枯草芽胞杆菌MY016生长迅速、产酶量稳定,总酶活较高,适合后期规模化生产和在畜牧业中推广应用。

枯草芽胞杆菌ZWZ-19可分散油悬浮剂的研制及对马铃薯腐烂茎线虫病的防治效果

为开发马铃薯腐烂茎线虫病的防治药剂,本研究利用前期获得的枯草芽胞杆菌ZWZ-19,制备一种可用于马铃薯拌种的可分散油悬浮剂。通过测定不同乳化剂对制剂稳定性的影响,结合制剂的悬浮率、倾倒性、粒径、静态表面张力及动态接触角等指标,筛选出ZWZ-19可分散油悬浮剂的最佳配方为:20%枯草芽胞杆菌母药、15%NP-10、3%有机土、0.5%乙二醇、3%白炭黑,大豆油补足至100%。该制剂热储前后悬浮率均高于95%,且有效成分分解率低于5%。田间试验结果表明,ZWZ-19可分散油悬浮剂对马铃薯腐烂茎线虫病的防效为69.61%,增产效果达到16.38%。

内生枯草芽胞杆菌WZ10对马铃薯枯萎病防效及功能测定

为明确枯草芽胞杆菌WZ10的生物学功能及对马铃薯枯萎病的室内防治效果。本研究利用Salkowski’s比色法和分光光度法、室内盆栽试验对菌株WZ10促生能力进行测定;通过室内防病试验和生理生化测定分析菌株WZ10的防病效果;并利用透明圈法对其解磷、解钾能力进行测定。结果表明,枯草芽胞杆菌WZ10具有产IAA和解无机磷能力,并对马铃薯植株的生长有明显的促生作用,与对照植株相比,接种菌株WZ10后马铃薯植株的株高、根长和鲜重均显著增加,分别提高了14.34%、19.75%和77.07%,马铃薯植株的PPO、POD、SOD酶活性和可溶性蛋白含量显著升高。同时,菌株WZ10对马铃薯枯萎病的室内防治效果达80.65%,显著高于30%甲霜·噁霉灵水剂处理。菌株WZ10具有较强的促生能力,且对马铃薯枯萎病具有显著的防治效果,该研究可为后续菌株WZ10功能开发和枯萎病病害防治奠定基础。

基于麦芽糖诱导型启动子在枯草芽胞杆菌中异源表达麦芽四糖淀粉酶及其酶学性质的研究

麦芽四糖淀粉酶(Maltotetraose amylase,Mta)可以从淀粉的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键形成麦芽四糖,目前在食品、医疗保健和造纸等领域具有重要应用。构建安全、高效的表达系统强化麦芽四糖淀粉酶的重组表达,进而降低以其为核心酶的麦芽四糖生物转化过程的生产成本具有迫切的现实需求。本研究将源自Pseudomonas saccharophila(DSM 654)的麦芽四糖淀粉酶基因mta在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中重组表达,利用麦芽糖诱导型启动子实现其安全高效表达,之后对重组酶进行分离纯化和酶学性质表征。结果显示,将携带麦芽糖诱导型启动子Pglv的表达载体转入B.subtilis WB800N中,成功构建工程菌后进行诱导表达,并且利用金属离子螯合层析技术成功获得了Mta纯酶。酶学性质研究结果显示其最适反应温度为55℃,最适反应pH为7.5。动力学常数Km为(1.26±0.17)g/L、kcat/Km为(2275.07±32.83)L/s·g,纯酶在4℃储存14 d后保留40%的酶活力。本研究成功构建出安全、高效表达重组麦芽四糖淀粉酶的表达系统,为其规模化制备和应用提供了新策略。

枯草芽胞杆菌对大肠杆菌返饲母猪繁殖性能和健康度的影响

旨在探究枯草芽胞杆菌对围产期母猪返饲大肠杆菌病料后繁殖性能和健康度的影响。选取20头预产期相近的大白母猪随机分为对照组和试验组,每组10头;在母猪产前第35天,对试验组母猪每头每日添加5 g枯草芽胞杆菌(2×10^(8)CFU/g)至断奶;在产前第21天,对两组母猪均进行大肠杆菌病料返饲;在产前1 d,每组随机采集5头母猪的耳缘静脉血用于检测免疫指标和抗氧化指标,记录母猪繁殖性能指标、子代生长性能指标和母猪围产期粪便指数、乳房健康指数及子宫内膜炎指数。结果:与对照组相比,添加枯草芽胞杆菌可以显著降低大肠杆菌返饲母猪的死胎数,提升活产数(P<0.05),显著降低母猪产前氧化应激和炎症水平及产前便秘、产后乳房炎和产后子宫内膜炎发生率(P<0.05),显著增加其子代断奶窝重和断奶时存活率(P<0.05)。综上,枯草芽胞杆菌可以有效提升大肠杆菌返饲母猪繁殖性能和围产期健康度,并降低其子代在哺乳期间的死亡率,为防控哺乳仔猪大肠杆菌性腹泻提供了新思路。

枯草芽胞杆菌NRCB002发酵液的促生效应及高产乙偶姻发酵条件优化

[目的]本文旨在明确枯草芽胞杆菌发酵液组分对番茄幼苗生长的影响,针对有效代谢产物进行发酵条件优化,为制备高效微生物肥料提供技术支持。[方法]以枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)NRCB002为供试菌株,通过温室盆栽试验,明确NRCB002发酵液组分对番茄幼苗生长和根系形态的影响;以NRCB002菌株生长量及代谢产物乙偶姻产量为评价指标,通过单因素优化法确定碳源和氮源的种类、浓度、发酵温度和发酵时间,通过正交试验设计和极差分析优化无机盐成分。[结果]与去离子水和发酵培养基对照相比,重悬菌液、发酵菌液上清、发酵菌液及含乙偶姻的重悬菌液均显著提高番茄株高、茎粗、叶面积、根冠比、总根长、总根表面积、总根体积、侧根数、地上部和根部的干重;其中,发酵菌液上清及含乙偶姻的重悬菌液处理的番茄幼苗地上部干重显著高于重悬菌液的幼苗地上部干重;发酵菌液上清、发酵菌液及含乙偶姻的重悬菌液处理的番茄幼苗根部干重显著高于重悬菌液处理的幼苗根部干重。以80 g·L^(-1)蔗糖为碳源、以25 g·L^(-1)酵母浸粉为氮源时菌株NRCB002的生物量和乙偶姻浓度均较高;最优无机盐组合:KH_(2)PO_(4)1.5 g·L^(-1)、MgSO_(4)·7H 2O 1.0 g·L^(-1)和MnSO_(4)·H_(2)O 0.2 g·L^(-1);优选的发酵温度为37℃,发酵时间96 h。使用优化后的发酵条件,用1 L摇瓶进行发酵,NRCB002生物量(D 600)为15.70,乙偶姻浓度为29.65 g·L^(-1),分别是初始发酵培养基的3.4和11.8倍。[结论]菌株NRCB002发酵液对番茄生长具有良好的促生作用,乙偶姻是其发酵液中关键的促生物质。

枯草芽胞杆菌YB-05与申嗪霉素复配防治小麦茎基腐病

由假禾谷镰刀菌Fusarium pseudograminearum引起的小麦茎基腐病是一种重要的土传病害,生产上亟需一种安全有效的防控方法。本研究利用枯草芽胞杆菌YB-05与申嗪霉素复配,并评价该复配制剂对小麦茎基腐病的防治效果。结果显示当申嗪霉素浓度低于500μg/m L时,对YB-05的菌落生长无显著影响;室内盆栽及田间试验表明枯草芽胞杆菌YB-05菌液和1%申嗪霉素悬浮剂按照19:1(vt/vt)复配生物制剂20m L/kg拌种处理发病最轻,均超过了高剂量的单剂处理(枯草芽胞杆菌YB-0530m L/kg拌种处理和1%申嗪霉素2 mL/kg拌种处理)和4.8%适麦丹水悬浮剂2 mL/kg拌种处理,并且具有一定的促生和增产作用。其中,复配制剂室内防治效果为69.8%,在两次的田间调查中防治效果分别为57.8%和45.7%。由此可见,枯草芽胞杆菌与申嗪霉素复配具有协同增效的作用,可以减少化学农药的使用,具有较好的开发利用潜力。

枯草芽胞杆菌XF-1粗蛋白抑菌活性初步研究

枯草芽胞杆菌XF-1是一株对大白菜根肿病有良好防治效果及对多种植物病原真菌有抑菌效果的生防菌株。为了研究其可能的作用机制,本文用硫酸铵沉淀法提取了发酵液中粗蛋白,并在不同处理条件下对其抑菌活性进行了初步研究。该粗蛋白对蛋白酶K和胰蛋白酶及紫外照射均不敏感,对热稳定。经40、60、80℃和100℃处理20 min后,其抑菌作用基本上无变化;经121℃处理20 min后,抑菌活性保持60%。这些结果,为进一步研究XF-1菌株对根肿病的防治机制和进一步应用提供了试验依据。

1株枯草芽胞杆菌体外拮抗6种肠道致病菌的研究

目的研究枯草杆菌BS3株对大肠埃希菌等6种肠道致病菌的拮抗作用。方法通过在体外BS3菌株分别与大肠埃希菌等6种致病菌混合培养后,观察不同时间内各菌的菌量变化。结果BS3菌株与6种肠道致病菌混合培养24、48、72和96h,其菌量逐渐增加;6种致病菌的菌量随着培养时间延续逐渐减少,其中产毒性大肠埃希菌、致病性大肠埃希菌和宋内志贺菌与对照组比较差异更明显。结论BS3菌株在培养生长过程中,可抑制大肠埃希菌等6种肠道致病菌的生长。

产蛋白酶枯草芽胞杆菌益生菌种的筛选与应用

本研究从健康鸡体内分离、选育出一株可产中性蛋白酶的枯草芽胞杆菌 ;将其作为益生素生产菌种 ,制备了微生态制剂———益生素 ;并对该菌的生物学性状、产酶性状和饲喂效果进行了系统研究。研究表明该枯草芽胞杆菌培养48小时 ,培养液中含蛋白酶活力可达 1 0 32 .56U ml;Bulb C小鼠腹腔注射和海兰白蛋公雏鸡口服试验均表明 ,该菌对动物安全 ;连续传代及体外保存一年生物性状稳定。饲喂实验表明 ,该益生素能明显促进肉用仔鸡的生长发育 ,到实验期末 ,提高肉用仔鸡体重 7.32 % ,肉用仔鸡的累积饲料转化率提高 8.96 %。对肉用仔鸡 ,合适的添加剂量为 0 .1 %(W W) (含H1菌 7.1 0× 1 0 5CFU g饲料 )

防治番茄灰霉病的枯草芽胞杆菌BAB-1粉尘剂研制

目前我国农药登记的微生物杀菌剂主要为水剂和可湿性粉剂两种剂型。为了克服常规喷雾导致温室大棚内湿度增加给防病带来的不利影响,本文以枯草芽胞杆菌BAB-1为有效成分开展了粉尘剂研究,通过对载体和助剂的筛选,明确了最佳的载体、助剂种类及其比例,最终确定100亿CFU/g枯草芽胞杆菌BAB-1粉尘剂的配方为:滑石粉20%、分散剂GY-D900 2%、菌株BAB-1原药补足至100%。该制剂具有很好的悬浮效果(30 min时悬浮率>50%)。室内盆栽试验表明,菌株BAB-1粉尘剂对番茄灰霉病防效达到57.14%~71.43%,对黄瓜灰霉病的保护作用优于治疗作用,施用1次的防病效果分别为48.80%和1.65%;温室大棚试验结果表明,该制剂在番茄大棚中施用3次后对灰霉病的防效达到79.04%,对照化学药剂嘧菌酯800倍水溶液的防效为82.55%。该研究结果为枯草芽胞杆菌BAB-1粉尘剂的进一步产业化开发和应用提供了科学依据。

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。

枯草芽胞杆菌对斑节对虾饲养池水净化作用的初步研究

将枯草芽胞杆菌 (Bacillussubtilis)制剂施放于斑节对虾 (Penaeusmonodon)饲养池 ,利用血清学鉴定和TCBS培养基平板计数 ,分别监测养殖池水中B .subtilis和弧菌 (Vibrio)的消长情况 ,并定期测定养殖水体的pH值、总碱度、COD值和亚硝酸盐、H2 S浓度等水化学指标 ,研究了B .subtilis制剂对斑节对虾饲养池水水质的净化作用。结果表明 ,在饲养池中添加B .subtilis制剂后 ,池水的COD值、亚硝酸盐、H2 S浓度比对照池有显著降低 ,而总碱度显著上升 ,pH值维持在 8.0 2～ 8.6 0之间 ,表明B .subtilis制剂对净化斑节对虾饲养池水水质和调节养殖水体微生态结构稳定具有明显的作用。

滴灌条件下枯草芽胞杆菌S37和S44对棉花黄萎病的防治效果

采用拌种和随水滴施2次的方法测定了2株芽胞杆菌对棉花黄萎病的防治效果。结果表明,在滴灌条件下2株枯草芽胞杆菌对棉花黄萎病均表现出较好的防治作用,在小区试验中,S37和S44对棉花黄萎病的防治效果分别为29.86%和42.81%,产量分别增加了25.22%和34.73%。在田间试验中,S37在143团和147团的防病效果分别为51.3%和55.1%,增产效果分别达到7.43%和17.62%,S44在143团和147团的防病效果分别为35.2%和39.3%,增产效果分别达到5.56%和15.51%。

枯草芽胞杆菌在油菜根茎叶的定殖动态和生防作用研究

采用常规方法跟踪枯草芽胞杆菌Tu-100在缩影系统油菜根际的定殖情况。Tu-100在油菜不同根段部位的定殖密度从上到下呈现了逐渐递减的规律。随着接种后时间的延长而逐渐下降。在根段8 cm以外的根区几乎检测不到接种菌。在油菜播种后3d,定殖密度可达最高水平(8.3×105个/g),然后急速下降,30d后保持相对稳定的较低水平(1.3×102个/g)。在油菜三片真叶时喷雾接种一次,20d后,在茎和叶上不能检测到所接种的Tu-100,并且抗菌核病的能力也逐渐减弱。

枯草芽胞杆菌YN145分离鉴定及抑菌活性

为挖掘用于稻瘟病防治的微生物资源,从感病水稻品种湘早籼24号的健康植株茎叶中用稀释分离法获得527个菌株。采用平板对峙法筛选出对稻瘟病菌具有拮抗作用的菌株60个,其中菌株YN145对稻瘟病菌菌丝生长抑制率达84.31%。经形态学和生理生化鉴定及16S rDNA序列分析,将菌株YN145鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis。生物活性测定表明,该菌株继代培养25代后,对稻瘟病菌菌丝抑菌效果仍在80%以上。菌株YN145发酵离心上清液经40、60、80、100和120℃处理30 min后,对稻瘟病菌的抑制率分别为91.50%、92.35%、91.78%、90.93%和86.97%;同样发酵上清滤液分别在pH 3、5、7、9和11处理30 min后,对稻瘟病菌的抑制率分别为91.50%、92.92%、92.92%、92.35%和92.63%。表明抗菌物质能耐高温、耐酸碱,菌株YN145作为稻瘟病生防制剂研发具有一定的价值。

添加枯草芽胞杆菌和营养物净化养殖污水的研究

利用室内试验,研究了加入营养物促进枯草芽胞杆菌净化养殖废水的方法。实验表明外源枯草芽胞杆菌比土著细菌对去除废水中溶解有机物和总氨氮有更强的能力,净化过程可以分为2个连续的阶段:溶解有机物的降解和总氨氮的去除。从起始日到第2d,细菌直接溶解有机物为碳源和氮源,48hCOD去除效率达(57.7±5.5)%,与对照组有显著性差异。在第2d到第5d,碳和磷相对于氮的不足限制了细菌增殖和去除总氨氮;葡萄糖和(或)磷酸盐的加入显著影响总氨氮去除效率,而加入复合维生素和(或)微量元素对其没有影响。同时加入葡萄糖和磷酸盐时,总氨氮去除效率大于85%,并形成悬浮的白色菌胶团。净化养殖废水时,水体中C∶N和N∶P质量比建议分别为5.4∶1和5￣7∶1。水中最高的细菌水平没有超过108CFU·mL-1,估计与细菌菌胶团的形成有关。

枯草芽胞杆菌R31在香芽蕉根部的定殖能力测定

枯草芽胞杆菌R31在田间和温室对香蕉枯萎病表现出一定防效,为探索其防效产生的机制,利用耐受300μg/mL利福平和遗传稳定的突变株R31*测定其在巴西蕉和广粉一号粉蕉根际的定殖能力,进行盆栽灌根接种试验。结果显示,每株苗接种50 mL 1.78×108 CFU/mL的菌液,接种后60 d,标记菌株在香蕉根际土、根表、根内和球茎中的含量分别为4.14×106 CFU/g(干土)、1.09×107 CFU/g(鲜重)、4.66×104 CFU/g(鲜重)、1.23×103 CFU/g(鲜重);同样处理的粉蕉40 d后,根际土和根表的菌量分别为9.87×105 CFU/g(干土),7.9×104 CFU/g(鲜重)。表明突变株R31*在根际土和根表能成功定殖,但在根内和球茎的定殖量则较少,且根际土和根表的定殖量与接种浓度和每天最高气温有关。

枯草芽胞杆菌Tu-100对几种作物的促生效果

盆栽试验结果表明,枯草芽胞杆菌Tu-100对油菜、小麦、辣椒、西瓜、大豆和玉米苗期有不同的促生效果,在植物干重上分别比对照增加9.47%、1.37%、2.27%、19.23%、9.21%和6.67%。对水稻的盆栽产量增加12.82%。对大豆的结瘤数和鲜瘤重呈现负增长。植物促生根际细菌对不同的作物保持着不同的亲和性。