UPLC/Q-TOF鉴定染料木素在小鼠血浆中的代谢产物

建立一套稳定、灵敏度高、重现性好和耗时短的鉴定小鼠灌胃染料木素单体后体内代谢产物的分析方法,检测染料木素在小鼠血浆中代谢产物的形式与含量。12只健康雌性小鼠按200 mg·kg-1灌胃染料木素单体,血浆预处理处理后,使用超高效液相色谱(UPLC)/四极杆-飞行时间串联质谱仪(Q-TOF)检测,以体积分数2.5 mM乙酸铵缓冲液(A)-乙腈(B)为流动相梯度洗脱,电喷雾离子源负离子条件下进行MS1和MS2全扫描,鉴定小鼠给药染料木素单体后血浆中的代谢产物。染料木素在小鼠血液中的代谢产物的主要存在形式是染料木素-葡糖醛酸,约占54.82%;其次是染料木素-硫酸酯,约占26.67%;也有一小部分(16.61%)以染料木素苷元的形式存在。UPLC/Q-TOF可快速、有效地鉴定出小鼠血浆中染料木素的代谢产物,为今后进行染料木素与人类健康效应相关的研究提供参考。

染料木素-川芎嗪共晶在Caco-2细胞模型中的转运研究

旨在考察染料木素(genistein,GEN)、川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)、染料木素-川芎嗪共晶(GEN-TMP)及染料木素与川芎嗪的物理混合物(GEN+TMP)在Caco-2细胞模型中的转运特征;建立Caco-2细胞模型,并以细胞跨膜电阻和标志物渗漏检查等指标进行验证,采用高效液相色谱法,考察并计算安全浓度下药物的累积转运量、表观渗透系数和外排率,并探讨P糖蛋白(P-gp)抑制剂维拉帕米、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP)抑制剂KO143和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)抑制剂MK571对转运的影响。结果显示,Caco-2细胞模型完整性与功能性良好,GEN浓度为40μg/mL时,GEN、TMP、GEN-TMP以及GEN+TMP的细胞存活率分别为90.06%、84.21%、97.60%和89.37%;GEN、TMP、GEN-TMP和GEN+TMP的表观渗透系数(P_(app))大于1.0×10^(-6)cm/s,属于吸收良好药物;GEN-TMP中GEN的累积转运量和P_(app)值分别为(2.78±0.11)μg和(8.61±0.33)×10^(-6)cm/s,比GEN的(1.92±0.15)μg和(5.96±0.47)×10^(-6)cm/s提高了44.79%和44.46%;GEN+TMP中GEN的累积转运量和P_(app)值与GEN无显著性差异。GEN只受BCRP的外排作用,GEN-TMP中的GEN同时受到P-gp和BCRP的外排作用,TMP、GEN-TMP和GEN+TMP中的TMP均受到MRP2的外排作用。结果表明,相同浓度下,GEN-TMP的细胞存活率高于GEN+TMP。GEN-TMP的吸收强于GEN和GEN+TMP中的GEN,共晶受外排蛋白的作用区别于GEN和GEN+TMP中的GEN,研究工作为共晶的转运研究提供了借鉴和参考。

基于三角芳香配体的金属有机框架对染料木素的吸附性能与机理

目的:提高染料木素的吸附率。方法:采用水热法合成2种含不同尺寸三角芳香配体的MOFs(MOF-808和PCN-777),通过系列表征确定MOFs的合成,比较其与线性二元羧酸配体构筑的MOF(UiO-66)对染料木素的吸附效果;考察孔隙特征、疏水性变化等对吸附性能的影响,利用X射线光电子能谱探究其吸附机理。结果:与线性配体构筑的UiO-66相比,三角芳香配体构筑的MOFs(MOF-808和PCN-777)的孔径分别从0.65 nm增大到1.81,3.55 nm,水接触角分别从47.91°增大到110.68°,128.23°。线性配体构筑的UiO-66对染料木素的吸附量为40.08 mg/g,吸附率为39.98%;而三角芳香配体构筑的MOFs(MOF-808和PCN-777)对染料木素的吸附量分别为61.80,81.75 mg/g,吸附率分别为61.63%,81.52%。结论:金属有机框架可用于染料木素的吸附富集,相较于线性配体,引入不同尺寸的三角芳香配体改变了MOFs孔径及疏水性,加强了MOFs的内部可及性并提供了更多吸附位点,从而提高了对染料木素的吸附效果。PCN-777对染料木素的吸附机理为金属螯合作用、π-π相互作用和疏水相互作用的协同。

槐角苷及其苷元染料木素的生物活性研究进展

槐角苷及其苷元染料木素为中药槐角的主要化学成分,在槐角中含量高,具有多种生物活性作用。通过查阅大量国内外文献和相关图书资料,发现其在抗癌防癌、防治骨质疏松症、抗心血管疾病、抗氧化、抗炎、避孕、保护神经、抗辐射、增强免疫和抗哮喘等多方面的应用均具有重要意义,可为传统中医药的发展提供更广阔的前景。

PARP-1在染料木素作用小鼠卵泡发生进程中的表达特征

【目的】旨在探究PARP-1信号及其介导的PAR化修饰水平在染料木素促进卵泡发育和抑制卵泡闭锁进程中的相关性,丰富染料木素等类雌激素物质作用于雌性哺乳动物卵巢卵泡发生的作用机制,以期为种畜高产日粮配方的研制提供科学指导。【方法】以21 d雌性昆明小鼠为试验动物,采用腹腔注射25,50,100 mg/kg不同剂量染料木素,每日定点注射1次,连续7 d,采集卵巢组织和血清,采用免疫组织化学法检测PARP-1蛋白在卵巢组织内的表达特征,并运用Western blot对卵巢组织内PARP-1蛋白及pADPr进行定量。结合凋亡指示蛋白Cleaved-caspase3、雌二醇(E2)水平、类固醇合成酶CYP19A1和HSD17B1,综合分析PARP-1信号及其介导的PAR化修饰信号是如何参与染料木素抑制卵泡闭锁、促进卵泡发育进程。【结果】免疫组织化学染色显示,PARP-1阳染主要发生在原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡中的健康颗粒细胞核和卵母细胞,卵泡膜细胞次之,但在Cleaved-caspase3阳染的凋亡细胞中PARP-1不表达。Western blot结果显示,50 mg/kg染料木素处理组PARP-1解离片段(89 ku)的表达量较对照组显著降低(P<0.05),但PARP-1全段(116 ku)表达量在各剂量组无显著差异(P>0.05)。其次,50 mg/kg染料木素处理组的pADPr的表达量在15 ku以下、25 ku以及35~45 ku这3个区域内均显著低于对照组、25 mg/kg和100 mg/kg剂量组(P<0.05),100 mg/kg剂量组的pADPr仅在25 ku区域处表达量较对照组和25 mg/kg剂量组显著降低(P<0.05)。然而,较对照组,Cleaved-caspase3的表达量在25 mg/kg和50 mg/kg染料木素处理组呈现剂量依赖性下降,且在50 mg/kg剂量组差异显著(P<0.05);E2水平较对照组亦呈现剂量依赖性上升且差异显著(P<0.05),但雌激素合成酶CYP19A1和HSD17B1的表达无显著变化(P>0.05)。【结论】PARP-1广泛存在于哺乳动物卵巢内健康的颗粒细胞、卵泡细胞和膜细胞中,可能通过催化pADPr的合成,介导卵巢内的能量代谢、细胞凋亡以及类固醇激素合成等胞内活动,参与染料木素等类雌激素物质干扰卵巢卵泡发生进程。

负载染料木素纳米脂质体的制备及其体外抗炎活性研究

为了提高染料木素(Gen)的生物利用率以及为脂溶性生物活性物质在新型功能食品中的开发提供参考,采用薄膜分散法,以大豆卵磷脂和胆固醇为原料,制备了负载Gen的纳米脂质体(Gen@Lip),并对其基本指标、结构、储存稳定性、体外释放特性和抗炎活性进行分析。结果表明:制备的Gen@Lip的Gen负载量为36%,Gen@Lip的平均粒径为(242.73±2.03)nm,多分散指数为0.32,Zeta-电位为(-16.33±1.16)mV;结构表征结果证实Gen被有效包埋在Gen@Lip中;Gen@Lip具有良好的储存稳定性;Gen@Lip能够有效地通过胃进入到肠道实现缓释作用;相较于游离的Gen,Gen@Lip对Raw264.7细胞有更强的抑炎效果,且在使用范围(<100μmol/L)内无毒副作用。综上,所制备的Gen@Lip可提高Gen的生物利用率,并具有明显的抗炎效果。

6-羟基染料木素及其甲基化衍生物的合成和抗氧化与抗缺氧活性

目的:缺氧是一种常见的病理现象,通常由机体组织供氧不足或无法有效利用氧导致。羟基化及甲氧基化黄酮类化合物具有显著的抗缺氧活性。本研究旨在探索6-羟基染料木素(6-hydroxygenistein,6-OHG)及其甲基化衍生物的合成方法和抗氧化与抗缺氧活性。方法:以鹰嘴豆芽素A为原料,经甲基化反应、溴化反应、甲氧基化反应及去甲基化反应得到6-OHG及其4个甲基化衍生物[4’,6,7-三甲氧基-5-羟基异黄酮(化合物3)、4’,5,6,7-四甲氧基异黄酮(化合物4)、4’,6-二甲氧基-5,7-二羟基异黄酮(化合物6)、4’-甲氧基-5,6,7-三羟基异黄酮(化合物7)]。采用氢-1核磁共振波谱法(1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy,1H-NMR)和质谱法(mass spectrometry,MS)表征产物结构;高压液相色谱法检测化合物的纯度;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除实验检测化合物的体外抗氧化活性。将PC12细胞分为正常组、缺氧模型组、芦丁组(1×10-9~1×10^(-5)mol/L),以及常氧和缺氧条件下的目标化合物组(1×10-9~1×10^(-5)mol/L),采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞活力,筛选得到抗缺氧活性优异的目标化合物及其最佳抗缺氧活性时的药物浓度。分别用抗缺氧活性优异的目标化合物、芦丁的最佳药物浓度处理PC12细胞后,在光镜下观察细胞形态,采用流式细胞术测定细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的蛋白质表达水平。结果:6-OHG及其4个甲基化衍生物的结构无误,纯度均>97%。当浓度为4 mmol/L时,化合物7和6-OHG的DPPH自由基清除率分别为81.16%和86.94%,均高于阳性对照芦丁,而化合物3、4、6的清除率均低于20%。与正常组相比,缺氧模型组的细胞活力显著下降(P<0.01);与缺氧模型组相比,化合物3、4、6对缺氧条件下的细胞活力无显著影响;在所有实验浓度下,6-OHG组的细胞活力均显著高于缺氧模型组(均P<0.05);在给药浓度为1×10^(-7)或1×10^(-6)mol/L时,化合物7组的细胞活力显著高于缺氧模型组(均P<0.05)。6-OHG和化合物7的抗缺氧活性优异,最佳药物浓度分别为1×10^(-6)和1×10^(-7)mol/L。采用6-OHG(1×10^(-6)mol/L)和化合物7(1×10^(-7)mol/L)处理PC12细胞后,与缺氧模型组相比,细胞损伤明显减轻,细胞凋亡率显著下降(P<0.01),HIF-1α和VEGF蛋白质的表达水平显著下调(均P<0.01)。结论:优化后的合成路线可提高6-OHG的产率,通过甲基化和选择性去甲基化得到4个衍生物。6-OHG和其衍生物化合物7表现出优异的体外抗氧化和抗缺氧活性,该活性与其分子中存在的A环邻三酚羟基结构有关。

染料木素邻苯二甲酰亚胺衍生物合成及其抗乳腺癌活性研究

目的研究染料木素邻苯二甲酰亚胺衍生物的体外抗乳腺癌活性及其作用机制。方法合成染料木素邻苯二甲酰亚胺衍生物,通过MTT法检测其对癌细胞株MCF-7、MBA-MD-231、MBA-MD-435增殖抑制作用;并通过分子对接的方法探讨染料木素邻苯二甲酰亚胺衍生物与雌激素受体α(ERα)的作用方式。结果合成了3个染料木素邻苯二甲酰亚胺衍生物,并对其生物活性及抗乳腺癌机制进行了验证。结论染料木素邻苯二甲酰亚胺衍生物具有较强的抗乳腺癌活性,可能与竞争性抑制ERα等机制有关。

染料木素抗阿尔茨海默病的机制研究进展

随着世界人口的老龄化,阿尔茨海默病(AD)的发病率不断上升。目前,AD已成为现代医学面临的最严重问题之一。染料木素是一种黄酮类的植物活性物质,由于其结构与雌激素相似,可以模拟雌激素的作用,具有多种生物活性,因其具有多途径靶向性和低毒性等特点,被认为是AD的一种有效的潜在治疗药物。本文对染料木素的药动学进行介绍,并从其类雌激素作用、抗氧化、抗炎、抗β-淀粉样蛋白、调节胆碱能神经传递和抑制Tua蛋白磷酸化等多个方面对染料木素在AD中的神经保护作用及作用机制进行综述。

染料木素自微乳的制备与质量评价

目的:研究并优化染料木素(GEN)自微乳的制备方法。方法:通过对GEN在各辅料中溶解度的比较、乳化剂乳化能力的考察和伪三元相图构建进行处方筛选,以粒径、分散系数(PDI)为指标采用星点设计-响应面法进行工艺优化,并对其理化性质进行考察。结果:染料木素自微乳最佳配方为IPM 14.39 mg,吐温-8076.51 mg,PEG4009.1 mg,GEN 50 mg,形成O/W型微乳,包封率为97.15%;平均粒径为(12.17±0.13)nm、Zeta电位为(-12.5±1.13)mV、PDI为(0.178±0.008);在温度稳定性考察中,自微乳保持澄清透明状态,染料木素的含量变化RSD值小于2%;体外溶出度在10 min累计释放量超过80%。结论:染料木素自微乳制备工艺简单;包封率高达97.15%;稳定性良好,可较长时间保持澄清透明且染料木素的含量相差不大,RSD值小于2%;在10 min时累计释放量超过80%,有效提高染料木素的溶解度。

染料木素的磷酰化结构改造及与溶菌酶的弱相互作用

采用改进的Atherton-Todd反应对染料木素进行磷酰化结构改造,得到了4种新的磷酰化产物,并通过ESI-MS,NMR进行了结构确认,结果发现磷酰化试剂对染料木素羟基的磷酰化具有较好的选择性,反应主要发生在染料木素7位羟基;进一步利用ESI质谱技术,对4种磷酰化染料木素与大分子溶菌酶的弱相互作用进行测定,显示所有的磷酰化产物均与溶菌酶形成非共价复合物。

染料木素磺酸钠制备及其抗脂质过氧化作用

染料木素(G)是具有明显的抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化等活性的异黄酮类化合物,其脂溶性和水溶性均较差,生物利用度不高。通过对其磺化,合成了它的3′-磺酸钠(G1)和3,′6-二磺酸钠(G2)2种水溶性衍生物,用IR、1H NMR等测试技术对其结构进行了表征,比较了G、G1和G2的抑制脂质体过氧化作用。结果表明,G1和G2的抗氧化活性强于G。

HPLC法测定染料木素自微乳中染料木素的含量

目的：建立染料木素自微乳中染料木素含量的HPLC测定方法。方法：采用Diamonsil C18色谱柱（150mm×4．6mm，5μm），甲醇-0．05％磷酸（60：40）为流动相，流速1．0mL·min^-1，检测波长260nm，柱温为25℃。结果：染料木素在1．18-11．8mg·L^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0．9998），平均回收率为99．27％，RSD为1．40％。结论：该方法操作简便、结果准确、重现性好，可用于染料木素自微乳的质量控制。

小鼠血浆中染料木素水溶性代谢产物和染料木素脂肪酸酯的分离及测定

本文建立了小鼠灌胃染料木素单体后血浆中水溶性染料木素代谢产物和染料木素脂肪酸酯的分离及测定方法。血浆样品经乙酸乙酯萃取后上Sephadex LH-20柱,分别用体积比1∶1的正己烷/氯仿和甲醇洗脱,染料木素脂肪酸酯用脂肪酶酶解后转化成染料木素,水溶性代谢产物用葡萄糖醛酸酶及硫酸酯酶水解成染料木素,然后采用液相色谱串联飞行时间质谱(Q-TOF LC/MS)检测染料木素。血浆中染料木素在10～10000 ng/mL范围内线性关系良好,检测限为1 ng/mL。10批次小鼠血浆中水溶性代谢产物平均为526.006 ng/mL,染料木素脂肪酸酯平均为58.976 ng/mL。采用SephadexLH-20柱具有良好的分离效果,脂肪酶水解染料木素脂肪酸酯稳定、专一性强,用Q-TOF LC/MS检测染料木素快速、灵敏。

染料木素磺酸钠减轻慢性脑缺血大鼠神经细胞焦亡的研究

目的:探讨染料木素磺酸钠(Genistein-3′-sodium sulfonate,GSS)对慢性脑缺血大鼠大脑皮层细胞焦亡的影响。方法:采用改良型双侧颈总动脉结扎法(Bilateral carotid artery ligation,2-VO)制备慢性脑缺血大鼠模型。将大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(2-VO+Vehicle)、治疗组(2-VO+GSS)3组,应用ELISA方法检测各组大鼠血清中IL-1β的活性变化;并应用Real time-PCR和Western Blot方法检测大鼠大脑皮层组织中IL-1β、NLRP3、Caspase-1、GSDMD的mRNA及(或)蛋白表达水平。结果:与假手术组相比,模型组大鼠外周血清中IL-1β含量显著升高(P=0.0429);与模型组比较,治疗组大鼠外周血清中IL-1β含量下降,但差异无统计学意义(P=0.0733)。对各组大鼠大脑皮层组织中IL-1β的mRNA及蛋白表达水平观察发现,与假手术组比较,模型组大鼠大脑皮层IL-1β的mRNA表达水平及蛋白表达水平均升高,差异有统计学意义(P=0.0255,P<0.0001);与模型组比较,治疗组大鼠大脑皮层IL-1β的mRNA表达水平及蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P=0.0200,P<0.0001)。与假手术组比较,模型组大鼠大脑皮层中NLRP3、GSDMD和Caspase-1 P20的mRNA水平(P=0.0443,P=0.0229,P<0.0001)及蛋白表达水平(P=0.0003,P=0.0007,P=0.0741)均升高;与模型组比较,治疗组脑皮层中NLRP3、GSDMD和Caspase-1 P20的mRNA水平(P=0.0012,P=0.0044,P=0.0058)及蛋白表达水平(P=0.0084,P=0.0268,P=0.0385)均降低。结论:GSS可通过抑制神经细胞焦亡减轻慢性脑缺血损伤。

新型含1,2,3-三氮唑的染料木素糖缀合物的合成

以染料木素为起始原料,经两步反应制得中间体7-O-炔丙基染料木素(3);以Cu I为催化剂,3与叠氮乙酰基糖经Click反应合成了7-O-[1-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-糖苷)-1H-1,2,3-三氮唑-4-甲基]-染料木素(5a^5c);5a^5c经去乙酰基制得三种含1,2,3-三氮唑的氮苷染料木素糖缀合物(6a^6c)。3,5和6均为新化合物,其结构经1H NMR,13C NMR和HR-MS表征。

RP-HPLC测定染料木素-4′-葡萄糖苷及其有关物质

目的 建立染料木素-4′-葡萄糖苷的含量测定方法。方法 采用反相高效液相色谱法。DiamonsilC18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-水（用磷酸调节pH至2.73）（25∶75），流速1.0mL·min^-1，检测波长261nm，柱温35℃。结果 染料木素-4′-葡萄糖苷在0.5055-101.1mg·L^-1内峰面积与浓度呈良好线性关系（r=1.0000，n=6），平均回收率99.2%（RSD=1.1%，n=9），日内精密度RSD〈0.5%，日间精密度RSD〈0.7%，最低检测限0.2ng。同时对样品中所含染料木素、染料木素-7-葡萄糖苷和染料木素-7，4′-二葡萄糖苷等微量有关物质的分离和检测也获得满意的结果。结论 该方法简便、可靠，可用于染料木素及其苷类的质量控制。

7-O-[ω-(N-L-氨基酸甲酯)-烷基]-染料木素的合成与表征

染料木素具有多种生理活性,以染料木素和L-氨基酸为原料,经过染料木素烷基化、氨基酸酯化、偶联3步反应,合成了一系列新的标题化合物,并对8个标题化合物进行了1HNMR、HRMS和IR结构表征。

大豆黄酮和染料木素对体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖及抗氧化水平的影响

通过体外细胞培养的方法探讨大豆黄酮(Daidzein,Da)和染料木素(Genistein,Ge)对奶牛乳腺上皮细胞增殖及抗氧化水平的影响。试验分空白对照组、10 ng/mL雌二醇(E2)组、不同浓度Da和Ge(1、10、100、1000ng/mL)组,培养72 h后,采用MTT法检测细胞增殖情况。结果表明,10、100 ng/mL Ge组和100、1000 ng/mL Da组同空白对照组比较可显著促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖(P<0.05),但均显著低于E2组(P<0.05)。另取处于对数生长期的乳腺上皮细胞加入不同浓度Da和Ge(1、10、100、1000 ng/mL)继续培养24 h,检测细胞培养液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量。结果表明,100、1000 ng/mL Da组及1001、000 ng/mL Ge组较空白组显著提高了T-SOD活性(P<0.05),显著降低了MDA含量(P<0.05);100、1000 ng/mL Da组及10、100、1000 ng/mL Ge组显著提高了NO含量(P<0.05);1000ng/mL Da组及100、1000 ng/mL Ge组显著提高了GSH-PX活性(P<0.05)。可见,Da和Ge在一定浓度范围内均有促进奶牛乳腺上皮细胞增殖及抗氧化水平提高的作用。

染料木素和大豆苷元对去卵巢大鼠胆固醇代谢的影响

目的 观察大豆异黄酮的两种主要苷元染料木素(Gen)和大豆苷元 (Dai)对去卵巢大鼠胆固醇代谢的影响。方法 Wistar大鼠 70只 ,随机分成正常组、模型组、雌激素组、大剂量G组、小剂量G组、大剂量D组、小剂量D组 ,每组 10只。除正常组外 ,其余各组均切除双侧卵巢。术后 1wk开始给药 ,给药 6wk后处死动物 ,测定血清总胆固醇(sTC)、血清低密度脂蛋白胆固醇 (LDL C)、血清高密度脂蛋白胆固醇 (HDL C)、肝组织中胆固醇 (hTC)含量。结果 切除卵巢 7wk后大鼠sTC ,LDL C ,hTC均增高。雌激素可降低去卵巢大鼠sTC、LDL C和hTC ,对HDL C作用不明显 ;染料木素可降低sTC、hTC、升高HDL C ,但对LDL C作用不明显 ;大豆苷元可降低sTC、hTC、LDL C ,但对HDL C作用不明显。结论 染料木素和大豆苷元均可降低去卵巢大鼠sTC和hTC水平 ,但作用途径不同 ;