染色质免疫沉淀技术在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。与其他方法相比,染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想的方法。近年来这种方法与DNA芯片和分子克隆技术相结合,可用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况,这将有助于深入理解DNA-蛋白质相互作用的调控网络。总结了染色质免疫沉淀技术的方法,特别介绍了使用这些方法取得的最新进展。

抗人Elp3的N末端抗体制备及在染色质免疫沉淀中的应用

人Elp3(human elongator protein 3,hElp3)具有组蛋白乙酰转移酶活性,是与延伸中的RNA聚合酶Ⅱ结合的elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白的乙酰化修饰与基因的转录延伸.Elp3及其复合物功能异常与人类多种疾病相关.为运用染色质免疫沉淀等手段深入研究Elp3功能,PCR法克隆pYES2-hElp3质粒中编码hElp3的N端亲水区段(1～69氨基酸残基),构建原核表达载体pMXB10-hElp3-210,经IPTG诱导和几丁质柱纯化后,免疫兔制备多克隆抗体.ELISA检测显示,该抗体有较高的效价(不低于1∶2 500).免疫印迹实验结果表明,该抗体可与纯化的及HeLa细胞中的hElp3蛋白特异性结合.运用该抗体对转入elp3Δ菌株的人Elp3的染色质免疫沉淀实验结果表明,人Elp3可参与酵母SSA3基因的转录调控,这可能是人Elp3能够部分补偿酵母SSA3基因延迟表达缺陷的原因.

染色质免疫沉淀试验中基因组DNA超声破碎条件优化策略

染色质免疫沉淀试验中对共价交联的基因组染色质进行超声处理以获得适当大小的DNA片段是ChIPSeq和ChIP-chip成功的前提。影响基因组DNA破碎的因素很多,细胞浓度、细胞裂解方式、超声体积、探头深度、超声环境、超声时间和超声功率等都会对超声效果产生影响。如何获得各个可变参数的优化组合是一个需要多次摸索的过程,借鉴其它研究者已经建立的优化条件进行探索是一条比较省时简便的途径。本研究针对超声时间、细胞裂解方式、超声环境和超声功率等因素进行优化;利用优化的条件超声,得到适合大小的DNA片段;对这些片段进行染色质免疫沉淀试验,获得已知靶基因的特异性富集;证明超声优化条件是成功的。本研究提出的超声优化策略及获得的优化条件为后续ChIPSeq试验创造了前提条件,也对其他研究者具有借鉴意义。

染色质免疫沉淀技术及其在基因表达调控研究中的初步应用

目的验证抑癌基因表达产物p53蛋白在体内是否结合于p21WAF1/CIP1基因的启动子区,并检测p53蛋白对热休克蛋白hsp90β基因启动子区的结合情况。方法采用染色质免疫沉淀(ChIP)及PCR技术检测特异基因调节序列,Western印迹分析p53蛋白。结果在p53抗体免疫沉淀的DNA片段中含有p21WAF1/CIP1和hsp90β基因的启动子区p53蛋白结合序列,免疫沉淀样品中含有p53蛋白。结论p53蛋白在体内结合于p21WAF1/CIP1和hsp90β基因的启动子区,参与两基因的表达调控。

染色质免疫沉淀技术分析HePG2细胞TCF7L2蛋白与IDE基因转录启动子的结合

TCF7L2是一种重要的转录因子,通过Wnt信号途径,调节葡萄糖代谢.胰岛素降解酶(IDE)是细胞水平催化胰岛素降解的最关键的酶,与2型糖尿病(T2DM)高血糖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症密切相关.为了检测HePG2细胞内转录因子TCF7L2与IDE基因启动子区的结合情况,采用染色质免疫沉淀技术结合PCR技术检测IDE基因启动子序列.结果表明,在特异性TCF7L2抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出IDE基因启动子序列,因此证实在HePG2细胞内,TCF7L2蛋白可与IDE基因转录启动子的特异区域结合,进而可能参与IDE基因的表达调控.

应用染色质免疫沉淀技术分析DNMT3b和HDAC1蛋白与SLC22A18基因启动子的结合

目的建立优化的染色质免疫沉淀技术(ChIP),分析乳腺癌细胞MDA-MB-231中DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)与SLC22A18基因启动子区的结合情况。方法建立并优化ChIP实验技术,运用ChIP技术检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-dc)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)分别单独和联合作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,用Dnmt3b和HDAC1特异性抗体沉淀DNA,聚合酶链式反应(PCR)检测SLC22A18基因5'端特异性序列,免疫印迹法(Westernblotting)检测Dnmt3b和HDAC1蛋白的表达情况。结果获得了优化的ChIP实验条件,Dnmt3b和HDAC1抗体沉淀的染色质片段中扩增出SLC22A18基因5'端特异性序列。5-aza-dc、TSA单独用药可抑制DNMT3b、HDAC1与SLC22A18启动子区特异序列的结合,5-aza-dc和TSA联合作用可以明显抑制DNMT3b、HDAC1与SLC22A18启动子的结合;Western blotting结果表明,5-aza-dc、TSA单独及联合用药不影响DNMT3b和HDAC1蛋白的表达。结论 DNMT3b和HDAC1在MDA-MB-231细胞内结合于SLC22A18基因启动子的特异区域,参与该基因的表达调控。

染色质免疫沉淀技术分析肺腺癌A549细胞中p53蛋白与p21^(CIP1)和Bim基因转录启动子的结合

为了检测肺腺癌A549细胞内抑癌蛋白p53与CDK抑制蛋白p21CIP1和Bim基因转录调控区的结合情况,采用染色质免疫沉淀技术,用p53特异性抗体沉淀DNA,PCR检测p21CIP1和Bim基因5′端特异性序列。结果表明,在抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出p21CIP1和Bim基因5′端的特异性序列。因此证实在A549细胞内,p53蛋白可与p21CIP1和Bim基因转录启动子的特异区域结合,进而参与两基因的表达调控。

运用染色质免疫沉淀技术筛选AP-2α的靶基因

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域.染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,简称ChIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法.对与ChIP有关的实验条件进行了优化,获得了较优的实验条件,并运用ChIP实验筛选出了转录因子activatorprotein-2alpha(AP-2α)的未知靶基因,对于进一步研究AP-2α的功能和调控网络打下了基础.

运用染色质免疫沉淀技术筛选出AP-2α的靶基因GALK1

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。与其他方法相比,染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是一种近来研究体内DNA与蛋白质相互作用的最好方法之一。本研究利用ChIP克隆方法,找出了AP-2α所调控的新的下游靶基因GALK1,并应用Lucifer-ase assay和RT-PCR实验进行了初步的验证。这一新发现,有利于我们进一步研究转录因子AP-2α的功能。

染色质免疫沉淀分析胰岛β细胞中TCF7L2与GPR40的结合

目的探讨转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子的相互作用。方法采用染色质免疫沉淀(CHIP)技术,在胰岛βTC6细胞株中,用TCF7L2特异性抗体沉淀DNA,聚合酶联式反应(PCR)检测GPR40基因5′特异性序列。结果在TCF7L2特异性抗体免疫沉淀的DNA片段中,扩增出GPR40基因5′特异性序列。结论在胰岛βTC6细胞中,转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子存在特异的结合区域,TCF7L2可能参与GPR40的表达调控。

紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术及其应用

紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术(UV laser crosslinking and chromatin immunoprecipitation,UV-X-ChIP)是研究蛋白质与DNA的相互作用及鉴定转录因子靶DNA的一条新途径。该技术结合DNA芯片、Southern杂交及DNA文库的构建可用于研究蛋白质与DNA的相互作用及高通量筛选已知转录因子在全基因组范围内的结合位点,这为转录因子调控网络的绘制奠定基础。笔者对紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术及应用作一综述。

染色质免疫沉淀技术分析红藻氨酸处理后的大鼠大脑皮质神经元中p53与p21基因启动子的结合

目的检测红藻氨酸(KA)处理后的大鼠大脑皮质神经元中p53蛋白与p21基因启动子的结合情况。方法原代培养大鼠大脑皮质神经元经KA或对照溶剂(双蒸水)处理后,采用染色质免疫沉淀(ChIP)及聚合酶链反应(PCR)技术检测神经元中p53蛋白与p21基因启动子区p53反应元件1(RE1)及反应元件2(RE2)的结合情况,Western印迹检测免疫沉淀中的p53蛋白以验证ChIP抗体特异性。结果 KA处理组,p53抗体沉淀的染色质中包含p21基因启动子区含有p53 RE1的DNA序列,免疫沉淀样品中含有p53蛋白。结论 KA处理后神经元内p53蛋白与p21基因启动子区p53 RE1结合增加。

染色质免疫沉淀法筛选转录因子Nanog调控的目的基因

目的:利用染色质免疫沉淀法筛选转录因子Nanog调控的目的基因。方法:用甲醛固定胚胎干细胞,利用超声将其染色质随机断裂成0.5～1.0kb的染色质片段,通过免疫沉淀富集与Nanog结合的DNA片段,回复交联后分离纯化DNA片段,最终用凝胶迁移阻滞实验验证Nanog与DNA片段的结合。结果:我们发现fzr为Nanog调控的目的基因,并通过电泳迁移率变动分析证明了二者的结合。结论:Fzr在细胞周期调控中发挥重要作用,这为阐明Nanog的作用机理奠定基础。

一种简便的染色质免疫沉淀法的建立

染色质结构和基因表达调节是当前国际前沿研究的热点 .染色质免疫沉淀法是研究染色质结构的首选方法 ,它不仅可用来研究体内反式因子与DNA的相互作用 ,也可以用来研究组蛋白修饰与基因表达的关系 .综合国外相关文献 ,建立了一种简便的染色质免疫沉淀法 ,并通过对诱导前后的MEL细胞中 β 珠蛋白基因簇组蛋白H3乙酰化的研究 ,证实了其可操作性 .结果表明 :高敏位点HS2和活跃基因 βmaj的启动子区域存在较高的组蛋白乙酰化水平 ,且诱导前后变化显著 ,而不活跃基因Ey的启动子区域则几乎检测不到组蛋白的乙酰化 ,且诱导前后无明显变化 .

采用染色质免疫沉淀联合芯片技术分析 胃癌全基因组蛋白H3K27三甲基化水平

目的：研究胃癌细胞全基因组蛋白H3K27的三甲基化水平。方法：收集我科2007年10月-2008年1月间8例胃癌患者的病灶组织和正常胃黏膜组织，采用染色质免疫沉淀联合芯片技术（ChIP-chip）在全基因组范围内对两种组织细胞的组蛋白H3K27进行高通量的检测。随后采用染色质免疫沉淀-实时定量聚合酶联反应（ChIP-qPCR）验证芯片结果，定量反转录聚合酶联反应（qRT-PCR）检测H3K27显著差异基因的mRNA表达水平。用统计软件进行基因筛选。结果：经两种组织细胞组蛋白H3K27三甲基化水平对比，筛选出234个基因存在H3K27显著差异，肿瘤细胞中有71个基因显示有H3K27三甲基化程度增高，161个基因H3K27甲基化程度降低；ChIP-qPCR验证结果与CpG岛芯片检测结果一致。结论：和正常胃黏膜组织细胞相比，胃癌细胞多个基因组蛋白H3K27三甲基化存在显著改变。ChIP-chip检测技术有利于进一步揭示胃癌发生的分子机制，发现新的基因治疗靶点。

染色质免疫沉淀技术研究进展

DNA与蛋白质之间的相互作用是研究染色质水平上基因表达调控机制的重要领域。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是研究体内DNA-蛋白质相互作用的较为理想的分析手段。该文介绍了染色质免疫沉淀技术的原理、应用以及最新研究进展。

体内甲醛交联及染色质免疫沉淀——研究DNA和蛋白质作用的新方法

甲醛交联及染色质免疫沉淀作为研究体内DNA和蛋白质相互作用的一种新方法,在染色质结构研究中获得了广泛的应用。该方法利用甲醛固定活细胞中的DNA与蛋白质,通过免疫沉淀分离复合物,从而分析蛋白质及其体内的DNA结合序列。

染色质免疫沉淀ChIP技术检测传代培养细胞Grb10组蛋白乙酰化水平

目的检测传代培养过程鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10中组蛋白乙酰化水平的改变。方法应用染色质免疫沉淀ChIP技术和荧光定量PCR(Q-PCR)分析,检测传代培养细胞中印迹基因Grb10组蛋白乙酰化水平。结果应用ChIP和Q-PCR检测出印迹基因Grb10组蛋白乙酰化水平上升。结论 ChIP技术与实时荧光定量PCR技术的结合,通过免疫共沉淀作用和后续PCR定量分析,可以有效地检测目的基因的组蛋白修饰水平;鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的乙酰化水平受体外传代培养的影响。