染色质构象调控真核基因的表达

真核基因的表达受到各种顺式调控元件、反式作用因子、染色质DNA以及组蛋白表观遗传修饰等多因素、多层次的调控。染色质三维空间结构的变化在调控真核基因表达方面也发挥了至关重要的作用。染色质构象的变化一方面可以使增强子等调控元件与靶基因相互靠近,从而促进基因表达;同时也可能通过形成空间位阻结构阻碍调控元件作用于靶基因,抑制基因表达。虽然染色质结构变化调控真核基因表达的机制仍缺乏较为精确的分子模型,但在组蛋白修饰、核小体定位、染色体领域以及染色质间相互作用等表观遗传学研究中,已经发现有诸多证据支持染色质构象在真核基因表达调控中的重要地位。文章主要综述了染色质结构及其构象的变化等对真核基因表达调控的影响。

大鼠老化过程大脑皮层及小脑神经元染色质构象分析

本文在前文~[2]的基础上进一步以MCN和DNaseⅠ为探针研究大鼠脑神经元终末分化后不同生理时期染色质构象,结果表明:<l>MCN酶解DNA产物PAGE显示脑老化过程大脑皮层及小脑神经元染色质核小体单体DNA分别保持在176bp和215bp水平,核小体连接DNA长度存在组织差异,但不受老化影响;<2>DNaseⅠ酶解DNA产物PAGE显示各年龄组大脑皮层及小脑神经元染色质DNA存在10bp间隔重复结构和相同的泳动区带分布特征,提示脑老化中染色质具有稳定的B型双螺旋结构和一致的螺线管卷曲形式。染色质DNaseⅠ降解率随年龄增加而降低,提示老化导致活性染色质区域减少,老化过程脑神经元染色质构象改变成为其转录功能减退的结构基础。

染色质构象捕获及其衍生技术

染色质的构象在基因表达调节方面起重要作用.介绍了染色质构象捕获、环状染色质构象捕获、3C碳拷贝、ChIP-loop、ChIA-PET和Hi-C等技术的基本原理及发展历程,对影响实验结果准确性的主要因素进行了分析.目的是为在三维层面研究基因的表达调控介绍新的研究手段,为功能研究提供新思路,也为相关技术的应用提供理论参考.

转基因鼠中人α类珠蛋白基因簇染色质构象调控变化

目的用人珠蛋白转基因鼠模型建立染色质构象捕获的技术体系,探讨人α类珠蛋白基因簇的染色质构象变化与基因表达调控的关系。方法使人α类珠蛋白转基因纯合子公鼠与KM母鼠交配,从怀孕14.5d的母鼠体内取出珠蛋白基因表达组织胎肝和非表达组织胎脑细胞,用甲醛交联固定细胞核内的染色质构象,限制性内切酶NcoⅠ消化后用T4DNA连接酶连接,解交联后提取并纯化连接的基因组DNA,在连接位点的两侧设计引物,用半定量PCR分析胎肝和胎脑中人α类珠蛋白基因簇染色质构象模式。结果以含HS40的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,表达的珠蛋白基因α2、α1的酶切片段与其交联效率明显高于胎脑,含有已关闭珠蛋白基因ζ的酶切片段与其交联效率与胎脑相当。以含α2的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,上游调控元件HS40和33与其交联效率明显高于胎脑;HS10和8与其交联效率略低于胎脑。结论在表达组织中,人α类珠蛋白基因簇上游远端调控元件通过形成染色质环与下游表达基因靠近,从而调控α类珠蛋白基因的表达;而在非表达组织中,无此染色质环形成。

染色质三维构象在精子发生中的研究进展

染色质是调节生物体遗传的重要物质,是维持细胞有序表达基因及蛋白质的重要载体。随着科学技术的不断进步,许多研究通过染色质构象捕获技术(High-Through Chromosome Conformation Capture,Hi-C)对染色质内部结构进行解析,对染色质区室、染色质疆域等有了更清晰的认识。在哺乳动物的精子发生过程中,染色质结构的改变对基因调控等起到了重要作用。精子发生是精原细胞增殖分化形成精子的过程,包括精原细胞的自我更新与分化、精母细胞的减数分裂以及精细胞的变形。本文主要阐述染色质三维构象捕获技术及其衍生技术、染色质的层级结构、精子发生过程中染色质三维构象变化的前沿进展,为精子发生的机制研究提供新思路。

基质刚度重构染色质对肿瘤细胞耐药性的影响

目的研究表明,肿瘤干细胞是肿瘤对临床化疗药物产生耐药性的元凶,但目前对其耐药性形成的力学机制所知甚少。本研究发现,肿瘤干细胞相比普通肿瘤细胞,细胞牵引力更低,染色质更疏松。而染色质构象又与DNA损伤修复效率密切相关。那么力学信号能否通过改变染色质构象调控肿瘤干细胞的耐药性,其机制仍需进一步探索。方法首先通过构建不同刚度的基质研究基质刚度对肿瘤细胞耐药性及DNA损伤修复的影响;通过细胞拉伸仪加力,调控染色质构象,探究其调控肿瘤细胞耐药的机制;随后通过RNA干扰,质粒过表达,RNA seq等方法探究力学信号调控肿瘤细胞染色质构象的机制;最后在体内验证力学干预逆转肿瘤耐药策略。结果初步证实基质刚度越高,肿瘤细胞耐药性越低,DNA损伤修复因子的表达和募集效率越高。相同浓度的化疗药物处理后,肿瘤干细胞DNA损伤程度显著低于普通肿瘤细胞。并且相较于普通肿瘤细胞,肿瘤干细胞的Ku70总量无明显变化,但更倾向于聚集在细胞核内。结论细胞外基质刚度可以作为一种力学信号影响肿瘤细胞的耐药性,目前实验结果表明力学信号可能通过调控Ku70在细胞内的定位,影响肿瘤细胞的DNA损伤修复能力,进而影响其耐药性。

多梳蛋白抑制复合体(PRC)在植入前胚胎发育过程中对染色质三维结构重建的影响

[背景]多细胞生物发育是一个极为复杂而协调的过程,伴随着组织特异性基因的时空特异性表达.近年来,人们逐渐意识到除转录因子及组蛋白翻译后修饰能影响邻近基因的表达外,染色质的三维(3D)结构组装同样对转录发挥重要调控作用.植入前胚胎及胚胎干细胞因具有分化为多种器官组织及持续增殖保持更新的能力,成为研究基因转录调控与染色质3D构象等表观遗传修饰相互作用的重要模型.[进展]多梳蛋白抑制复合体(polycomb repressive complex,PRC)在哺乳动物不同物种中都发挥多种功能,特别是在哺乳动物的植入前胚胎发生过程中其活性及基因组结合位点均发生显著变化.PRC不仅可以通过组蛋白修饰直接参与靶基因的转录调控,也可以协同其他转录因子,通过影响染色质微环境进而参与靶基因转录调控进程.本文重点探讨哺乳动物(人与鼠)的植入前胚胎发育过程中染色质3D构象剧烈变化的规律,并归纳PRC在上述过程中作用机制的新进展.[展望]考虑到PRC在不同细胞中参与转录调控过程的复杂性,未来需要进一步实验来研究PRC的不同组分在胚胎发育过程中细胞染色质3D构象构建中的贡献,特别要注意不同附属蛋白的功能代偿性及协同性.

三维基因组染色质构象捕获及其衍生技术

线性染色质经过多重折叠凝缩到真核生物的细胞核中,染色质的三维构象直接决定了真核生物的基因表达,因此染色质可以在局部或远程空间上发生互作调控基因转录。折叠成环状构象的染色质可以借助染色质构象捕获(Chromosome conformation capture,3C)技术来研究,基于3C技术扩展的4C/5C/Hi-C从单个位点延伸到全基因组捕捉三维构象,在此基础上,染色质构象核心技术可以与免疫共沉淀、核酸分子杂交、单细胞、基因组测序等技术偶联而产生新的衍生技术和应用,这极大地推动了染色质构象技术在基因时空特异性表达调控上的研究。文中将以3C和Hi-C等三维基因组核心技术为基础,重点介绍染色质构象捕获及其衍生技术的原理和前沿应用。

染色质构象解析技术——Hi-C及染色质构象信息提取

真核生物染色质在核内的空间组织形式能影响DNA的空间分布,因而对基因转录、DNA复制等生物学过程具有调节作用。目前对这种空间上高度有序的基因组结构的认识还是粗糙的、碎片式的和不完整的。近年,利用染色质构象捕获技术发展起来的衍生技术——Hi-C技术,是一种研究全基因组范围的染色质相互作用以及探明全基因组的三维结构的分析技术。利用Hi-C技术能够对染色质内部或所有染色质之间的相互作用进行精细分析,从而把基因表达调控引入到空间的、全局性的研究层面,为全面解析与DNA有关的生物学过程的机理开启新的契机。本文主要阐述染色质构象解析技术Hi-C的实验原理、数据处理以及染色质构象信息提取,包括染色质内相互作用情况分析、全基因组基因活性分类、拓扑关联结构域(TAD)和染色质环(chromatin loop),介绍染色质构象信息与基因调控研究方面的国际前沿进展。

基于染色质交互数据的基因组组装方法

伴随着高通量DNA测序技术的不断推陈出新和价格持续下调,如何将scaffolds定位于染色体逐渐成为完整参考基因组获得的关键。高通量染色质构象捕获技术(High-throughput chromosome conformation capture,简称Hi-C)的出现为基因组组装过程中scaffolds快速锚位提供了契机。相比于传统的基因组组装方法,基于染色质交互组装基因组的策略实验操作简易、实验和时间成本较低、正确率及分辨率高,在基因组相对复杂的多倍型和高度杂合的物种中有着更大的应用前景。但由于技术本身的限制,该方法还存在分辨率、背景噪声等问题需要解决,有待进一步改进和提高。

不同龄大鼠大脑神经细胞核染色质10nm和30nm纤维核小体排布特征分析

目的：观察不同年龄大鼠大脑神经细胞核染色质１０ｎｍ和３０ｎｍ纤维核小体排布特征，探讨老化过程导致大脑神经细胞核转录活性衰退的分子机制。方法：选用微球菌核酸酶（ＭＣＮ）为染色质结构识别探针，经蔗糖密度梯度离心、凝胶电泳，可显示不同龄大鼠大脑染色质结构特征的变化。结果：幼年鼠、成年鼠和老年鼠大脑染色质１０ｎｍ纤维核小体重复长度分别保持在（１７６±４）、（１７５±６）和（１７８±７）ｂｐ水平上；而３０ｎｍ抗酶解寡聚体核小体数目为：酶解３０％染色质时，分别是（３９±０．４７）、（４２±０．２６）和（４６±０．０２）；酶解５０％染色质时，则是（１８±０．１２）、（２１±０．４１）和（２６±０．２７）。结论：大鼠大脑细胞核１０ｎｍ染色质纤维核小体重复长度不受老化过程影响；３０ｎｍ纤维抗酶解寡聚体大小与年龄呈正相关，提示大鼠老化过程大脑染色质构象发生不利于ＭＣＮ酶解的变化。

植物三维染色质构型研究进展

染色质在细胞核内的缠绕、折叠及其在细胞核内的空间排布是真核生物染色质构型的主要特征。在经典DNA探针荧光原位杂交显微观察的基础上,基于新一代测序技术的Hi-C及ChIA-PET染色质构型捕获技术已经被广泛应用于动物及植物细胞核染色质构型的研究中,并以新的角度定义了包括:染色体(质)域(chromosome territory)、A/B染色质区室(compartment A/B)、拓扑偶联结构域(topological associated domains,TADs)、染色质环(chromatin loops)等在内的多个更为精细的染色质构型。利用以上两种主流技术,越来越多的植物物种染色质构型特征被鉴定、分析和比较。本文系统分析和总结了近年来以植物细胞为模型的细胞核染色构型领域取得的重要成果,包括各级染色质构型特征的组成、建立机制和主要影响因素等。在此基础上,分析了目前研究植物染色质构型技术的瓶颈和突破性的技术进展,并对后续研究主要关注的问题和研究内容进行了展望,以期为相关领域的研究提供更多的理论参考和依据。

四维细胞核体调控基因表达的数学理论

多尺度三维基因组结构驱动基因表达和细胞命运决定.尽管在一维线性基因组层面上的研究取得了显著进展,但三维空间基因组动态结构如何在功能上影响时空基因表达的变化仍不清楚.近年来,测序技术和影像技术的发展,使得四维核体基因组学的研究取得一系列进展.在本文中,讨论了三维基因组结构的多尺度性、其对基因表达的复杂调控以及时空动力学.接着对这一复杂的染色质结构动力学、表观修饰动力学和基因表达动力学进行理论建模,提出了可预测的多尺度耦合系统的建模框架.最后,讨论了未来关于四维核体动力学的研究方向.

全反式维甲酸调控K562细胞红系分化的表观遗传机制

全反式维甲酸(ATRA)是早幼粒细胞分化的有效诱导剂,其对红系分化过程的作用尚不完全清楚。为研究ATRA在红系分化进程中的作用及其表观遗传调控机制,本文以诱导白血病细胞K562向红系分化为模型,对ATRA干扰红系分化过程的调控机制进行研究。首先利用血红素(he-min)诱导K562细胞向红系分化;流式细胞术结果显示,ATRA影响细胞向红系分化过程中的谱系变化,阻滞细胞分化进程;ATRA处理分化中的细胞后,红系分化相关基因表达水平降低;而通过3C、FAIRE和ChIP技术对其中的表观遗传机制进行探究发现,ATRA处理细胞后,β-珠蛋白家族基因座位内的染色质可及性降低,LCR与其靶基因启动子之间的相互作用频率降低;而基因座位染色质可及性降低导致了红系相关转录因子GATA1、LDB1、LMO2和TAL1在LCR及珠蛋白家族基因座位的启动子区的富集频率降低。上述结果表明,ATRA处理分化中的细胞导致红系分化相关基因的染色质可及性降低,更加封闭的染色质结构阻碍了LCR招募转录因子与基因启动子区的结合,进而抑制β-珠蛋白家族基因表达,这种动态的变化过程阐明了ATRA调控红系分化的表观遗传机制。

基于密度聚类的染色质拓扑相关结构域识别方法

高通量染色质构象捕获(Hi-C)技术的快速发展为染色质结构分析提供了丰富的基因组位点间交互作用数据,但目前基于Hi-C数据的已有拓扑相关结构域(TAD)识别方法存在准确率低、参数敏感等问题。在此背景下,本文设计并实现了一种基于空间密度聚类的TAD识别方法。该方法首先对原始Hi-C数据进行预处理,得到归一化后的Hi-C接触矩阵数据;然后计算位点之间的距离矩阵,基于位点的核心距离和可达距离生成可达性图,并提取聚类簇;最后基于聚类结果和TAD提取边界。该方法能够识别出内聚性更高的TAD结构,且TAD边界处富集了更多的ChIP-seq因子。实验结果表明,本文方法在TAD识别中更准确,更具有现实意义。

三维基因组学在神经精神疾病领域的研究进展

神经精神疾病影响着全球数千万人的生活,成为日益严重的社会问题。遗传是介导神经精神疾病发生的重要因素之一。但是,人群全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)检测出的疾病风险位点大多位于基因组的非编码区域,是目前进一步鉴定疾病风险基因及推动发病机制研究的瓶颈所在。三维基因组学(three-dimensional genomics)关注染色质空间构象及基因组序列的远程相互作用,相关技术的开发和应用为建立疾病风险位点与靶向基因间的关联提供直接证据,拓展了疾病风险基因的鉴定。与此同时,疾病风险位点与基因相互作用的细胞特异性为理解疾病的发生机制提供了全新思路。最后,染色质空间构象重塑可调控集群基因的转录表达,可能参与介导疾病的表型复杂性及异质性。本文在简单介绍三维基因组学的基础概念和应用的基础上,重点总结及分析其在神经精神疾病领域的研究进展,主要包括精神分裂症(schizophrenia, SCZ)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)和孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD),为相关疾病的发病机制研究提供新思路。

老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质的构象研究

目的 观察老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质的构象特征。 方法 选用微球菌核酸酶 (MCN)和脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)作为染色质结构识别探针 ,经琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) ,显示老年大鼠和青年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核染色质的结构变化。 结果 老年大鼠下丘脑、垂体染色质核小体重复DNA长度分别为 (190± 7)bp和 (171± 8)bp ,而青年大鼠分别为(193± 9)bp和 (170± 5 )bp ;DNaseI酶解DNA产物PAGE显示各年龄组染色质DNA均存在 10bp间隔重复结构和相同的电泳区带分布特征 ;DNaseI染色质降解率老年大鼠明显低于青年大鼠。 结论 (1)老年大鼠和青年大鼠下丘脑、垂体染色质核小体重复DNA长度未发现随龄变化特征 ,但呈明显组织差异 ;(2 )染色质DNA均以B型双股螺旋构象形式存在 ;(3)老年大鼠染色质DNA抗DNaseI酶解能力增强。

CTCF和cohesin参与人成纤维细胞中HOXA基因簇染色质高级构象的组织

位于人体不同部位的成纤维细胞具有细胞特异性的HOX基因表达模式,可以作为区分不同成纤维细胞的依据之一.在个体发育的过程中,建立或维持不同HOX基因表达模式的机制始终是引人关注的问题.本实验室前期工作在NT2/D1人畸胎瘤细胞中证明了CTCF/cohesin介导的染色质高级构象在维甲酸诱导的HOXA基因共线性开启过程中发挥了重要作用.为了进一步研究原代细胞中CTCF/cohesin对HOXA基因的调控作用,本研究选取了来自体轴不同部位并且HOXA基因表达模式互补的人胚肺和包皮成纤维细胞,对HOXA基因簇中CTCF和cohesin的结合水平以及相关的染色质高级构象进行了检测.与人胚肺成纤维细胞相比,包皮成纤维细胞中的cohesin结合水平较低,相关的染色质高级构象比较"开放",并且主要表达5′端的HOXA基因.本研究还发现CTCF结合位点CBSA56处于HOXA基因簇染色质高级构象中的核心位置,并且该位点参与的染色质相互作用在两种成纤维细胞中呈现出明显的差异,说明CBSA56是一个关键的CTCF结合位点.以上结果表明,CTCF和cohesin参与了人原代成纤维细胞中HOXA基因簇染色质高级构象的组织和HOXA基因的表达调控,并且提示细胞类型特异性的染色质高级构象与HOXA基因的空间共线性表达模式之间存在协同关系.

叶酸调控鸡脾和胸腺IGF2表达的表观遗传机制探究

本试验旨在研究胚期注射叶酸对肉鸡脾和胸腺中IGF2基因表达的影响,并进一步探究其调控基因表达的表观遗传学机制。选择重量和大小相近的种蛋360枚,随机分为4组,在孵化期第11天(E11)分别注射0(对照)、50、100和150μg的叶酸。每个处理选取体重相近的48只1日龄雏鸡,随机分为6个重复,每个重复8只鸡,在饲养的第21和42天取胸腺和脾组织。用RT-PCR方法检测组织中IGF2的相对表达量;重亚硫酸盐修饰克隆测序法(BSP)检测IGF2启动子区域(-648/-479bp)甲基化水平;DNase I-qPCR方法检测IGF2启动子区域(-847/-616bp)染色质构象。结果表明,胚期注射100和150μg叶酸显著提高了受精蛋孵化率(P<0.05);胚期注射150μg叶酸显著提高了42日龄脾中IGF2的表达量(P<0.05)、降低了42日龄脾中该基因启动子区的甲基化水平(P<0.05),并且也显著增加了42日龄脾中IGF2启动子区的染色质可接近度(P<0.05);然而在21日龄时各叶酸处理组对脾中IGF2的表达均无显著影响(P>0.05)。与脾组织不同,150μg叶酸处理组显著提高了21日龄胸腺中IGF2的表达(P<0.05),对42日龄胸腺中该基因的表达却没有显著影响(P>0.05),并且与对照组相比,150μg叶酸处理组中21日龄胸腺组织IGF2启动子区的染色质可接近度也显著增加(P<0.05)。由此可见,在种蛋孵化第11天注射叶酸可通过影响基因启动子区的甲基化水平和染色质构象来调控组织中IGF2的表达,并且存在组织器官和时间特异性。

珠蛋白基因的转录调控与红细胞分化发育研究进展

红细胞是具有重要生理功能的血液细胞。成年人的红细胞主要来源于分布在胸骨、椎骨、肋骨等扁骨内的红骨髓。红骨髓中的髓系多能干细胞分化成红系定向祖细胞，红系定向祖细胞在促红细胞生成素（EPO）的作用下，能增殖分化为原红细胞。原红细胞经过有丝分裂、增殖成为网织红细胞，进而发育成为成熟红细胞。红细胞成熟时没有细胞核和细胞器，胞质内充满血红蛋白，具有携带氧气和二氧化碳的功能。