红瓤核桃JrbHLHA2转录因子靶向查尔酮合成酶基因JrCHS4调控种皮花青苷合成的功能研究

【目的】查尔酮合成酶(CHS)是植物花青苷合成途径中的第一个限速酶,探究红瓤核桃(Juglans regia L.RW-1)查尔酮合成酶(CHS)在种皮花青苷合成中的功能,为红瓤核桃的品种改良提供理论支撑。【方法】以红瓤核桃RW-1和普通核桃中林1号不同发育期的种皮为材料,根据qRT-PCR结果,筛选并克隆JrCHS4基因;克隆2种核桃JrCHS4的启动子序列,通过GUS染色和GUS蛋白定量分析启动子活性差异;通过酵母单杂交(Y1H)和双荧光素酶检测试验(LUC)验证上游bHLH转录因子对JrCHS4启动子的调控作用;通过农杆菌介导将JrCHS4瞬时转化烟草叶片,观察叶片颜色及花青苷含量的变化。【结果】花后60、120 d时仅JrCHS4在红瓤核桃种皮中的表达量显著高于普通核桃种皮且表达量差异最大,分别约为66.04、11970.93倍,花后90 d时除JrCHS4在2种核桃种皮中的表达量基本相同外,其他3个JrCHSs在红瓤核桃种皮中的表达量均显著低于普通核桃种皮,推测JrCHS4可能是红瓤核桃种皮花青苷合成的关键基因。GW-JrCHS4启动子与RW-JrCHS4启动子具有98.50%的同源性,含有许多响应激素如脱落酸、乙烯、赤霉素以及与逆境胁迫相关的顺式作用元件,与GW-JrCHS4启动子相比,RW-JrCHS4启动子缺失了1个MYB结合位点MYB1AT,插入了1个bHLH结合位点MYCCONSENSUSAT。GUS染色结果表明,RW-JrCHS4启动子诱导产生的蓝色深于GW-JrCHS4启动子诱导产生的蓝色;经GUS蛋白定量检测,RW-JrCHS4启动子活性显著高于GW-JrCHS4启动子活性,约是GW-JrCHS4启动子活性的1.17倍。酵母单杂交试验结果表明,JrbHLHA2可以特异性结合JrCHS4启动子;经LUC试验进一步验证,JrbHLHA2能够显著激活JrCHS4启动子的活性,其LUC/REN比值约是对照的2.45倍。瞬时转化JrCHS4的烟草叶片绿色变浅呈现轻微的红色,总花青苷含量得到了显著提高,约是对照的1.09倍,表明JrCHS4能够促进花青苷的生物合成与积累。【结论】红瓤核桃JrbHLHA2转录因子靶向查尔酮合成酶基因JrCHS4是调控红瓤核桃种皮花青苷合成的关键因素。

辣椒查尔酮合成酶基因CaCHS02的克隆及功能分析

查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)基因在植物黄酮类物质代谢过程中发挥重要作用。为研究查尔酮合成酶基因CaCHS02在辣椒(Capsicum annuum L.)中辣椒类黄酮代谢过程中的功能,本研究分析了CaCHS02基因的基因特征、蛋白特点和基因表达模式,并构建了CaCHS02过表达载体,通过农杆菌介导法获得瞬时过表达CaCHS02(35S:CaCHS02)的辣椒植株。结果发现,瞬时过表达CaCHS02的辣椒植株叶片中CaCHS02发生显著超量表达,其中编码类黄酮代谢途径中其他关键酶基因(CaCHS02、CaPAL、CaC4H、Ca4CL、CaCHI、CaFLS和CaF3H)的表达水平同步显著上调;超表达CaCHS02促进辣椒叶片中查尔酮合成酶酶活性、总黄酮含量和辣椒叶片的α-葡糖糖苷酶抑制活性的提升。研究表明,CaCHS02在辣椒类黄酮代谢过程中发挥正向调控功能,过表达CaCHS02提高了辣椒叶片的α-葡糖糖苷酶抑制活性。本研究为解析辣椒α-葡萄糖苷酶抑制剂生物合成机制奠定了基础,为选育高α-葡糖糖苷酶抑制活性的功能辣椒品种提供了理论支持。

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。

黄秋葵查尔酮合成酶基因AeCHS的克隆与表达分析

采用同源序列克隆和RT-PCR技术,首次克隆得到黄秋葵查尔酮合成酶基因(CHS)cDNA全长序列。序列分析表明,该序列全长1175 bp,包括一个1170 bp的完整ORF,编码389个氨基酸,命名为AeCHS。生物信息学分析表明,本研究所获得的AeCHS氨基酸序列与同科植物黄蜀葵和陆地棉的同源性较高,分别达99.23%和97.44%,AeCHS推断的氨基酸序列含有CHS蛋白的标签序列GFGPG以及4个保守活性位点Cys164、Phe215、His303、Asn336。实时荧光定量PCR分析黄秋葵果实、花、叶片不同发育时期AeCHS基因的表达量,结果表明AeCHS基因在上述植物材料中表现出不同的表达模式:花>果实>叶片,具体到不同植物组织,AeCHS基因在生长6 d的果实、盛开的花朵以及植株顶端第4片叶子中的表达量较高。

大豆查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆、表达及其在雪莲提取液中的代谢产物分析

以栽培大豆北丰12为材料,利用PCR方法克隆查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)全基因,采用SOE法克隆得到去掉内含子的查尔酮合成酶基因,核酸序列分析表明,该基因编码区长1170bp,编码390个氨基酸,与已报道的GMCHS8(GenBank:AY237728)的cDNA序列相似率达到97%。构建pET-GMCHS工程表达质粒,通过大肠杆菌E.coliBL21(DE3)高效表达系统表达大豆CHS。通过12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在42.9kDa的一条蛋白质特异表达带。液相色谱分析大肠杆菌E.coliBL21(DE3)高效表达系统在雪莲提取液中的代谢产物,样品和空白对照样对比,样品在273nm,3.0min出现新的吸收峰,质谱分析结果表明CHS利用雪莲提取液中代谢中间产物合成了新的黄酮类物质。

草地早熟禾查尔酮合成酶基因PpCHS1克隆、功能与表达分析

以草地早熟禾转录组数据为基础,克隆得到PpCHS1基因cDNA序列。其包含查尔酮合成酶基因(CHS)家族保守区域,与山羊草、大麦等植物的查尔酮合成酶基因相似度高;属于疏水性蛋白,Ⅲ型聚酮合酶,具有同源二聚体结构,亚细胞定位结果显示基因编码的蛋白定位于细胞质。通过对PpCHS1进化和表达分析表明,其功能可能与花发育相关并能促进黄酮类物质的合成,受紫外线和高盐的诱导,同时在外施MeJA下持续高表达,推断PpCHS1可能参与非生物胁迫与生物胁迫的防御。

天然棕色棉查尔酮合成酶基因(GhCHS1)的克隆和实时定量表达分析

根据植物查尔酮合成酶基因保守区序列设计引物,以发育18d的天然棕色棉纤维为材料,用RT-PCR结合RACE技术分离得到了一个查尔酮合成酶基因的全长cDNA(GenBank登录号:EU921263),将该基因命名为GhCHS1。实时荧光定量PCR检测显示,GhCHS1基因在棕色棉纤维细胞中优先表达,且在棕色棉纤维中的表达量远高于其近等基因系白色棉,但是该基因在绿色棉中几乎检测不到。这些试验结果暗示,该基因可能在棕色棉纤维色素形成中发挥重要作用。

猕猴桃查尔酮合成酶基因CHS密码子偏好性分析

为了解猕猴桃查尔酮合成酶基因(Chalcone Synthase,CHS)的密码子使用特征,采用CodonW、SPSS、MEGA软件和EMBOSS在线程序等分析猕猴桃CHS密码子偏好性,并构建单双子叶植物CHS系统发育树。研究结果表明,猕猴桃CHS有效密码子数(ENc)、总G和C含量(GC)和密码子第3位上G或C含量(GC3s)分别为57.21、0.533和0.607;同义密码子相对使用度(RSCU)大于1.0的密码子数为30,但不存在偏好性极强的密码子;聚类分析结果发现,基于密码子使用偏好性分类可将单双子叶进行准确归类,而CHS序列相似性聚类结果并不理想;密码子使用频率分析表明,猕猴桃CHS与模式生物拟南芥和大肠杆菌基因组间密码子使用偏好性差异相对较小。研究认为,猕猴桃CHS密码子偏好性较弱,但倾向使用G和C,且以G或C结尾的密码子;单双子叶植物CHS间存在严格的密码子使用法则;此外,拟南芥和大肠杆菌可能是猕猴桃CHS遗传转化和异源表达较为理想的受体系统。

百合查尔酮合成酶(chs)基因的cDNA克隆与分析

根据报道的查尔酮合成酶基因的保守序列,设计了特异简并引物,以东方百合Sorbonne盛开的花瓣总RNA为模板,逆转录合成cDNA第一链,用特异引物对此双链cDNA进行PCR扩增,将扩增后的基因片段回收克隆后,送至上海博亚生物公司测序,目的序列长873 bp,与已发表的百合中CHS基因的同源性达到91%,说明克隆的片段属于查尔酮合成酶基因,GenBank上登陆号为DQ471950。

金花茶查尔酮合成酶基因CnCHS的克隆及遗传转化研究

根据已发表的金花茶查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因(CnCHS)序列设计全长扩增引物,以金花茶花瓣总cDNA为模板进行PCR扩增,成功获得了该基因cDNA全长。将扩增所得全长产物连接PMD18-T载体后转化大肠杆菌E.coli DH5α,提取质粒后经酶切、测序鉴定后,将其与双元表达载体pCAMBIA1300连接,成功构建了CnCHS基因的正义表达载体pCAM-CnCHS。将该重组表达载体转化农杆菌EHA105后,利用农杆菌介导法将CnCHS基因转入烟草,获得转基因烟草18株。利用PCR法及Southern blotting对所获得的转基因植株进行鉴定,结果显示CnCHS基因成功整合到烟草基因组中,阳性率达67%,并获得了单拷贝转基因植株。这些结果表明本研究成功构建了金花茶CnCHS基因对烟草的遗传转化体系,为深入研究CnCHS基因的功能及其对花色的调控效应奠定了基础。

七彩红竹查尔酮合成酶IhCHS1基因的克隆与分析

通过已报道查尔酮合成酶基因的保守序列设计特异引物,扩增得到七彩红竹(Indosasa hispida cv.rainbow)查尔酮合成酶(Chalcone Synthase,CHS)基因片段,再以RACE法获得CHS基因全长cDNA序列。该cDNA全长1953 bp,含1542 bp的开放阅读框,编码含513个氨基酸残基的蛋白质。多序列比对结果表明IhCHS1推断的蛋白与节节麦(Aegilops tauschii)等禾本科植物的CHS相似性在87%以上,临位法构建系统发生树显示IhCHS1与禾本科植物CHS亲缘关系较近。RT-PCR结果显示IhCHS1在幼嫩红秆中大量表达。

苦荞中查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆

获得完整的苦荞查尔酮合成酶基因(CHS)信息并评价其进化地位,对分子辅助选育高黄酮含量的苦荞品种具有重要的指导意义。用RACE法克隆苦荞CHS基因,用生物信息学手段分析预测苦荞CHS基本理化性质和同源性,用临接法构建了该酶的系统发生树。获得1250bp的CHScDNA全长,含241bp的3’UTR和185bp的5’UTR;等电点(pI)和分子量(Mr)分别为5.33和35340.75Da;克隆获得975bp的开放性阅读框(ORF)。预测该基因编码含325个氨基酸残基的蛋白,氨基酸同源比对结果表明,苦荞CHS与蓼科的虎杖相似性很高;临接法构建的系统发生树结果表明,苦荞CHS与其他双子叶植物有共同的起源,与蓼科的金荞麦、甜荞、虎杖及石竹科的满天星亲缘关系较近。成功获得苦荞CHS基因的cDNA全长,克隆出完整的ORF,并确定了苦荞中该酶的进化地位和方向。

青花菜查尔酮合成酶基因BoCHS的克隆、表达及序列分析

根据NCBI数据库中发布的查尔酮合成酶基因序列设计PCR简并引物,以青花菜(Brassica oler-acea var.italica)子叶cDNA为材料,克隆到了青花菜查尔酮合成酶基因,基因命名为BoCHS,序列已提交到NCBI数据库,登录号为GU266209。该基因的编码区全长为1182bp,编码393个氨基酸。序列比对结果表明,BoCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别。RT-PCR检测表明,经霜霉病菌(Hyaloperonospora parasitica)侵染后,子叶中BoCHS的表达量增加,其中以72h和96h的表达量最大。

油果实中查尔酮合成酶基因PsCHS的克隆表达分析及其启动子的分离

从成熟果实均一化全长cDNA文库中分离了编码CHS基因的全长cDNA序列,命名为PsCHS,根据其序列设计引物,采用Genome Walking方法从基因组DNA中分离获得PsCHS基因上游的调控序列,命名为PsCHSp,PsCHS基因全长1 442bp,其中ORF 1 176bp,编码392个氨基酸;采用APA-Walking技术,获得该基因的5ˊ端调控区,经在线软件预测,启动子序列含有典型的结构特征元件TATA-box和CAAT-box,还包含光响应元件、厌氧诱导元件、胚乳表达相关元件、MYB结合位点以及激素响应元件;RT-PCR结果显示,PsCHS基因在果实发育的前期表达量较高,花后40d表达量最高,随后开始下降,果实成熟期表达量较低。分离获得的PsCHS基因属于查尔酮合成酶基因家族成员之一,查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74)是类黄酮合成途径中的一个重要酶,该基因可能对类黄酮的合成起到调控作用。

矮牵牛中查尔酮合成酶基因A (chsA)2个启动子的克隆和分析(英文)

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是类黄酮类物质生物合成途径中的第一个关键酶,其控制基因chs为超家族基因.根据前人报道的矮牵牛查尔酮合成酶基因A(chsA)启动子的保守序列设计1对特异性引物,从矮牵牛基因组DNA中通过1次PCR同时扩增出长为550 bp和354 bp的启动子(分别命名为PchsA-L和PchsA-S,GenBank登录号:EF199747和EF199748),其中PchsA-L与PchsA-S相比,除个别碱基有差异外,在88～269 bp多出一段182 bp的序列,其中103～201 bp含有典型的内含子特征.应用DNAStar软件分析表明2条序列均含有普通启动子的保守序列TATA box、CCAAT box、capsite(CCATAA),并含有花中特异表达启动子的特征序列TACPyAT box、anther box(TAGAAGTGACAGAAAT)、G-box(CACGTG)、box1元件(ATGTCACGTGCCATC)和box2元件(TGTGTTGAAGGTTTGCTA).对克隆启动子所用的矮牵牛后代群体进行分析,130个单株中只含有PchsA-S的有13株,只含有PchsA-L的有20株,同时含有2个启动子的有97株.2个启动子在后代中发生了分离,但其分离比并不符合1∶2∶1.克隆启动子所用的矮牵牛有14条染色体,为二倍体.DNA印迹表明2个启动子在基因组中均是多拷贝.qRT-PCR分析显示:未经过紫外光处理的花中以及经过紫外光处理的花中,PchsA-L启动子驱动的chsA基因与PchsA-S启动子驱动的chsA基因表达都未见明显差异;在紫外光处理的幼苗叶片中表达量相应地比紫外光处理的花中的表达量增高;在紫外光处理的幼苗叶片中,PchsA-L启动子驱动的chsA基因比PchsA-S启动子驱动的chsA基因表达量显著增高;而未经过紫外光处理的幼苗叶片中,PchsA-L启动子驱动的chsA基因、PchsA-S启动子驱动的chsA基因都没有检测到明显的表达信号.结果表明:在矮牵牛中chsA基因存在2个独立的启动子PchsA-L和PchsA-S;启动子PchsA-L中182 bp类内含子特征的序列具有显著提高chsA基因在紫外光处理的幼苗叶片中表达量的功能.

3种小麦作物查尔酮合成酶(CHS)及其基因的生物信息学分析

对已在NCBI上注册的普通小麦、蓝粒小麦、天蓝偃麦草查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)核酸和氨基酸序列进行分析。利用生物信息学软件研究3种作物查尔酮合成酶的酶学特性,对其组成成分、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、分子进化、蛋白质二级结构和结构域进行预测和推断。3种作物查尔酮合成酶基因长度均约为1.2kb,编码394个氨基酸,三者氨基酸同源性很高,在蛋白质的其他预测中,发现三者均为不稳定蛋白,疏水性较强,二级结构以α-螺旋为主,但其他结构中有所差异,在进化树中可以看出蓝粒小麦与长穗偃麦草亲缘关系较近。通过分析发现,小麦类作物查尔酮合成酶有着与其他植物中该酶相同的特性,为进一步研究其他特殊的小麦类作物相关酶及其基因提供理论依据。

芥蓝查尔酮合成酶基因BaCHS的克隆与序列分析

查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成途径的关键基因,在植物发育和逆境反应中起着重要作用。根据已发表的查尔酮合成酶基因序列设计全长引物,以芥蓝(Brassica albograbra)叶片基因组DNA和花蕾cD-NA为模板,克隆到了芥蓝查尔酮合成酶基因全长序列,命名为BaCHS。该基因DNA全长为1 263 bp,具一个长度为75 bp的内含子,编码区长度为1 188 bp,编码395个氨基酸。序列比对结果表明,BaCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别。

不同植物查尔酮合成酶CHS基因的生物信息学分析

采用生物信息学方法对GenBank中已登录的10种不同植物中的查尔酮合成酶基因的核苷酸序列及所推测的氨基酸序列的理化性质、信号肽、跨膜结构、亲/疏水性、功能结构域以及其二级结构进行了详细的分析,构建了不同植物CHS的系统进化树。结果表明,10种植物中CHS基因的开放阅读框的全长在1.2 kb左右,大约编码399个氨基酸;不同植物中的CHS的氨基酸序列均包括1个N-糖基化位点(32NMSS),4个蛋白激酶c磷酸化位点(69TIR、158SVK、202TFR、359SAK)和1个查尔酮合成酶活性位点(161RLMMYQQGCFAGGTVLR),均不存在信号肽、无跨膜结构域,是一个疏水性蛋白。

诸葛菜(Orychophragmus violaceus)查尔酮合成酶基因OvCHS的克隆与序列分析

根据GenBank发布的基因序列,设计PCR引物,分别从诸葛菜(Orychophragmus violaceus)的花瓣基因组DNA和cDNA克隆到查尔酮合成酶基因,并定名为OvCHS,序列已上传至NCBI数据库,登陆号为EF408918。序列分析表明,OvCHS基因的基因组全长为1263 bp,具一个75 bp的内含子,编码区全长为1188 bp,编码395个氨基酸。与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)查尔酮合成酶基因AtCHS比较发现,两基因编码区有135个碱基不同,相似性为88.64%,氨基酸序列中仅16个氨基酸残基的差异,相似性达95.95%。

柳杉属3个查尔酮合成酶(CHS)新基因的克隆及其序列特异性分析(英文)

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是黄酮类物质合成的第一关键酶。为了获得CHS基因,我们在ACGM标记所扩增的PCR片段内设计锚定引物,并结合RACE技术首次克隆了柳杉属3种植物的CHS基因,包括柳杉(Cryptomeria japonica var.sinensis,CjsCHS)、短茸柳杉(C.japonicacv.Araucarioides,CjaCHS)和日本柳杉(C.japonica,CjCHS),并对其进行分析。结果表明:3个基因长都为1 176bp,编码391个氨基酸,它们都含有CHS高度保守活性位点以及CHS标签序列GFGPG,其编码蛋白的相似度达99%,与其他植物相似度在79%以上,表明CHS基因在进化上具有相对保守性。