柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

柯萨奇病毒A组10型研究进展

自2008年以来,由多种肠道病毒引起的手足口病已成为严重威胁中国婴幼儿健康的重大公共卫生问题之一。其中,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)是引起手足口病的主要病原体。但2011年以后,中国手足口病的流行趋势发生了变化,柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CVA10)和柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)引起的手足口病呈增多趋势,在部分地区已替代EV71和CVA16成为引起手足口病的主要病原体,已引起越来越多的关注。现就CVA10的病原学、流行病学、实验室诊断、动物模型及疫苗相关研究作一综述。

柯萨奇病毒A组10型免疫荧光检测方法的建立及其在灭活验证中的应用

目的建立检测柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CVA10)病毒颗粒的免疫荧光检测方法,使用该方法对病毒的灭活进行辅助验证。方法在非洲绿猴肾细胞(African green monkey kidney cell,Vero)、人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(human malignant embryonic rhabdomyoma cells,RD)、非洲绿猴胚胎肾细胞(African green monkey embryonic kidney cells,MA104)三种细胞上检测病毒滴度,绘制滴度曲线确定最敏感细胞;以兔抗CVA10多克隆抗体为一抗、Alexa Fluor®594偶联的山羊抗兔IgG为荧光二抗,对实验条件进行优化,建立检测CVA10的免疫荧光方法,并与灭活验证中细胞盲传实验结果进行比较。结果RD细胞为CVA10最敏感细胞,一抗最佳稀释度为1∶100,二抗最佳稀释度为1∶200。病毒感染RD细胞后24 h可检测到的病毒量下限为50 CCID_(50)/ml,感染4 d时的检测下限为0.5 CCID_(50)/ml。Vero细胞为CVA10的较敏感细胞,相同条件下,病毒感染Vero细胞后24 h可检测到的病毒下限为80 CCID_(50)/ml,5 d时的检测下限为1 CCID_(50)/ml。灭活验证中,免疫荧光结果与细胞盲传实验结果具有一致性。结论成功建立了CVA10的免疫荧光检测方法,该方法可辅助细胞盲传实验进行灭活验证。

一株柯萨奇病毒A组4型云南株的全基因组分析

目的了解中国云南2022年分离到的一株柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CVA4)病毒株的全基因组序列特征,探讨CVA4系统发育特征。方法对CVA4分离株194R3/YN/CHN/2022进行全基因组序列扩增测序,并应用Mega 7.0、Geneious 9.1.4及Simplot 3.5.1等软件拼接比对,构建CVA4分离株系统进化树,分析其全基因组序列特征。结果194R3/YN/CHN/2022分离株为CVA4,属于C2基因亚型,与我国近年的优势基因亚型一致。重组分析显示,在P2、P3非结构编码区,CVA4病毒分离株可能与EVA114原型株V13-0285、CVA16原型株G-10、CVA14原型株G-14发生过重组。结论云南分离的194R3/YN/CHN/2022属于CVA4中国流行的C2基因亚型,但发生了一定变异。

2021—2023年安徽省手足口病柯萨奇病毒A组16型分子分型研究

目的了解安徽省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)发病情况、柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)基因型别分布情况和VP1基因进化特征。方法通过中国疾病预防控制信息系统对2021—2023年安徽省HFMD发病情况和病原学检测情况进行统计。收集HFMD患者咽拭子样本,分离得到CVA16毒株,对其VP1区进行PCR扩增和基因序列测定,使用肠道病毒在线分型工具鉴定基因亚型,运用MegAlign比较核苷酸和氨基酸同源性,利用MEGA 6.0构建进化树,并分析VP1区氨基酸变异位点。结果2021—2023年安徽省累计报告HFMD病例155640例,年均报告发病率为84.83/10万。2021—2023年安徽省16个地市共报告HFMD实验室确诊病例12643例,其中CV-A16占18.16%(2296/12643),各年度构成比分别为25.81%(1127/4366)、33.69%(782/2321)和6.50%(387/5956)。2021—2023年安徽省共分离到HFMD CV-A16毒株72株,其中B1a和B1b基因亚型分别为58株(占80.56%)、14株(占19.44%)。两种亚型毒株与CV-A16原型株G-10的核苷酸和氨基酸同源性分别为73.80%~76.20%和90.60%~92.30%。进化树显示B1a基因亚型流行株在遗传进化上分为4个分支簇,B1b基因亚型流行株形成3个分支簇。72条VP1区基因序列与原型株比较发现了26个氨基酸位点发生变异。结论2021—2023年安徽省HFMD CV-A16主要流行的基因亚型为B1a和B1b,B1a为优势基因亚型,应加强对CV-A16流行毒株的分子监测。

柯萨奇病毒A组10型的生物学特征和免疫原性分析

目的 探究柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10, CV-A10)毒株在Vero细胞上合适的扩增条件,并评价该候选CV-A10疫苗病毒株的免疫原性。方法 将CV-A10按照感染复数(multiplicity of infection, MOI) 0.01、0.02、0.05分别接种于Vero细胞,在感染后不同时间点进行病毒样本采集,检测各时间点病毒样本的CV-A10 VP1基因拷贝数及病毒感染滴度,绘制病毒增殖动力学曲线。再使用密度梯度离心法对超滤浓缩的CV-A10病毒收获液进行纯化,SDS-PAGE凝胶电泳确定病毒主要结构蛋白VP1、VP2、VP3的完整性,电镜观察纯化后病毒颗粒的形状。将灭活后的CV-A10病毒液肌肉注射C57BL/6小鼠,分成2个免疫剂量组(25μg、10μg),于0、21 d进行初次免疫及加强免疫,每次免疫21 d后检测小鼠血清中和抗体水平,用ELISpot实验检测小鼠体内的T细胞免疫应答效果。结果 在CV-A10接种MOI=0.05的情况下收获病毒液,CV-A10能在感染Vero细胞后24~30 h达到增殖高峰,并且最高的感染性滴度均值在7.3 CCID_(50)/mL。在MOI=0.05的条件下对病毒进行大规模培养,通过密度梯度离心可观察到病毒颗粒条带;进一步对该病毒聚集带进行SDS-PAGE凝胶电泳,可观察到CV-A10主要结构蛋白VP1、VP2、VP3的蛋白条带;在透射式电子显微镜下可观察到完整的CV-A10病毒颗粒。将纯化的CV-A10抗原进行小鼠免疫,加强免疫后10μg剂量组和25μg剂量组的中和抗体几何平均滴度值(geometric mean titer, GMT)分别为30.9、108.3;通过ELISpot实验检测发现2个剂量组均能较好的诱导IL-4和IFN-γ特异性的细胞免疫反应。结论 CV-A10在MOI=0.05条件下可以快速增殖并获得较高滴度的病毒上清液,并获得成熟的病毒颗粒,该病毒灭活后可以在小鼠体内较好的诱导免疫原性,对后续CV-A10灭活疫苗的开发具有一定的指导作用。

柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。

柯萨奇病毒B组1型感染动物模型研究进展

柯萨奇病毒B组1型(coxsakievirus B1,CVB1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVB1感染后的机体免疫反应、病毒毒力机制、药物疫苗研发等问题的解决具有重要意义,同时也能为临床治疗提供部分依据。本文通过对CVB1病毒感染构建的不同动物模型进行总结,以期望为建立合适的动物模型以及开展相关研究提供参考。

柯萨奇病毒A组10型感染RD细胞的转录组学分析

探讨柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV⁃A10)感染人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞的基因表达谱变化,为深入理解CV⁃A10致病机制提供重要基础数据。本研究将CV⁃A10以感染复数(MOI)为0.1的剂量感染RD细胞12 h后提取总RNA,通过RNA⁃Seq技术获取RD细胞中的全部转录本信息,基于生物信息学的方法对差异表达基因进行GO(gene ontology,GO)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析。结果显示,共筛选到2610个差异表达基因,其中表达上调的基因有1582个,表达下调的基因有1028个。随机选取8个差异表达基因,经RT⁃qPCR验证后发现,其变化趋势与转录组数据一致。GO和KEGG富集分析结果显示,差异表达基因主要聚焦于细胞内信号转导、mRNA加工、抗病毒免疫反应等过程。结果表明,CV⁃A10感染可能会引起RD细胞发生自噬。

柯萨奇病毒A组6型中国株的分子进化和时空传播分析

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是手足口病的主要病原体,可引起非典型手足口病和中枢神经系统疾病,对儿童造成严重的疾病负担,尚无上市的疫苗和抗病毒药物.基于3288条CV-A6中国株VP1序列,利用Nextstrain平台的augur病原体生物信息分析包,构建了CV-A6的时间尺度分子进化树,确定了进化分支和分支突变,分析了分支突变与抗原表位之间的联系.进一步分析了CV-A6中国株各分支在中国七大地理区域的时空分布和优势分支,绘制了主要分支的时空传播路线.结果发现,CV-A6中国株主要分为B、C和D三个进化分支以及D2、D3a和D3b三个子分支,抗原表位处的突变形成了新的进化分支,促进了病毒的流行.华南和华东是CV-A6中国株的主要起源地,华南和华东相互输出、华东输出全国是中国株的主要传播模式.对CV-A6中国株的分子进化和时空传播分析,为CV-A6引起的手足口病等疫情的监测、预警和防控提供了重要支持.

柯萨奇病毒A组10型VP1的生物信息学分析

目的 柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)是引发手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的重要病原体之一,此研究运用生物信息学方法预测分析其病毒蛋白(viral protein, VP)中VP1的理化性质、结构特征以及抗原表位。方法 通过ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、PDBsum、ProSA-web预测分析CV-A10 VP1的理化性质和结构特征。应用DNAstar、ABCpred、Bepipred 2.0、ElliPro、DiscoTope-2.0、NetMHCpan-4.1、NetMHCIIpan-4.0、Consurf、VaxiJen v.2.0、AllerTOP v.2.0、ToxinPred2、IEDB immunogenicity预测分析CV-A10 VP1的抗原表位。结果 CV-A10 VP1为碱性、不稳定的亲水性蛋白,其二级结构以无规则卷曲为主。该蛋白还存在多个潜在B、T细胞抗原表位以及基于潜在表位之上的优势抗原表位。结论 CV-A10 VP1蛋白有多处可诱导特异性体液免疫和细胞免疫的潜在位点,研究为其实验鉴定、分子流行病学研究和疫苗研发提供了重要支持。

宁夏回族自治区2013年手足口病患者柯萨奇病毒A组10型分离株VP1区基因特征分析

目的：了解宁夏回族自治区（宁夏）手足口病（HFMD）患者中柯萨奇病毒A组10型（Cox A10）分离株的VP1区基因特征。方法收集2013年real-time PCR 检测非EV71和非Cox A16肠道病毒标本280份，用RD细胞进行肠道病毒分离培养，分离到的毒株采用RT-PCR扩增其VP1区基因并进行核苷酸序列测定，测序结果利用BLAST进行型别鉴定。对鉴定为Cox A10的所有毒株进行VP1区基因同源性分析和进化分析。结果从280份标本中共分离到肠道病毒36株，其中有6株鉴定为Cox A10，核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0%～99.8%和99.0%～99.7%。与A、B、C、D各基因亚型代表株之间的核苷酸同源性分别为76.3%～77.2%、81.6%～83.1%、94.4%～98.9%和80.0%～82.3%，氨基酸序列同源性分别为92.3%～93.0%、94.0%～95.3%、98.0%～99.7%和90.6%～94.0%。系统进化显示，6株Cox A10宁夏株与C基因型代表株处于同一分支。结论 Cox A10是引起宁夏2013年HFMD的常见病原体，本次分离到的Cox A10均属于C基因型。

我国大陆地区柯萨奇病毒A组10型流行株基因特征分析

目的分析我国大陆地区柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)流行株基因结构及引起重症手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)毒株的序列特征.方法从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库下载我国大陆地区各省份或地区不同年份的流行株序列信息,使用MEGA5.2软件构建系统进化树,应用Simplot软件进行重组分析,应用MegAlign软件对引起厦门2015年重症手足口病暴发的毒株进行比对分析.结果我国大陆地区在2010年之前曾有LineageC毒株流行,2010年之后流行的毒株均属于Lineage E,且表现为E2和E3毒株共同流行的趋势.未见已报道的CV-A10大陆流行株与其他血清型人类肠道病毒发生重组.引起不同症状的毒株在序列同源性上未见显著差异,而引起厦门2015年重症HFMD暴发的毒株在5′-UTR区128~130位点处存在3个核苷酸位点(ACT)缺失.结论应加强CV-A10的监测和流行病学研究,为CV-A10疫苗及多价HFMD疫苗的研发奠定基础.

2013-2022年江苏省柯萨奇病毒A6型全基因组序列特征分析

目的 研究江苏省2013-2022年分离到的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析,以期从分子流行病学特征的角度解释CV-A6取代肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16成为江苏省引起手足口病(HFMD)主要病原的原因。方法 选取2013-2022年间江苏省地区流行的35株CV-A6毒株进行全基因组测序,采用DNASTAR、MEGA7.0和Similarity plots3.5.1等软件对获取的全基因组序列进行比对、相似性分析、系统进化分析和基因重组分析,对P1编码区和3D区主要氨基酸变异位点进行分析。结果 35株CV-A6江苏毒株的全基因组核苷酸和氨基酸序列相似性分别为87.5%~99.6%和97.0%~99.8%,与CV-A6原型株Gdula/USA/1949的全基因组核苷酸序列相似性仅为80.3%~81.0%,氨基酸序列相似性为94.7%~95.3%。基于VP1序列的系统进化树结果显示,2013-2022年江苏省有34株CV-A6分离毒株分属于D3a基因亚型,1株分属于D2基因亚型;基于3D区进化树划分不同重组模式,2013-2022年江苏省流行的CV-A6出现过4个重组进化分支:RF-A、RF-L、RF-K和RF-C型。重组分析结果显示:江苏省流行的CV-A6毒株与CV-A6原型株Gdula/USA/1949在结构蛋白序列上具有较高的相似性。而在非结构蛋白和非编码区则与其他EV-A原型株序列相似性更高。而氨基酸突变位点分析结果显示,与原型株Gdula/USA/1949相比,P1区和3D区多个氨基酸位点变异频繁,可能会使得衣壳蛋白的结构、潜在的受体结合位点产生变化。结论 通过对2013-2022年江苏省CV-A6的全基因组序列分析,有助于了解江苏省CV-A6基因重组及遗传进化关系,解释了近年来CV-A6成为手足口病的主要病原体的可能原因,对CV-A6的防控工作提供了基础资料。

辽宁省首株柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

研究引起辽宁地区手足口病的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CV-B5)基因组特征。对2018年从辽宁省688份肠道病毒核酸阳性的标本中分离到的1株CV-B5进行高通量测序,并对其全基因组进行遗传进化分析。结果表明,CV-B5辽宁分离株与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为78.5%~97%,氨基酸序列同源性为75.3%~96.7%。基于全基因组的进化分析将CV-B5流行株分为A~D四个基因型,辽宁分离株属于D基因型。通过重组分析发现其在P3区的3D区段发生重组。首次在辽宁地区手足口病患儿中分离出CV-B5,辽宁省分离株(LN2018-23-21/CHN/2018)可能为重组株。

云南省昆明地区2022年柯萨奇病毒A16型的VP1区分子特征

目的对昆明市某医院2022年从手足口病患儿分离的柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的全VP1基因区分子特征分析。方法对昆明市某医院2022年从手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)患儿200份临床样品粪便标本进行处理,分别通过RD细胞和Vero细胞分离,对经3次培养后仍产生细胞效应(cytopathogenic effect,CPE)的细胞培养液提取病毒核酸,然后用通用引物222/224经RT-PCR扩增并测序,序列经BLAST比对确定其血清型,对鉴定为柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的再用特异引物CA16VP1F/CA16VP1R扩增其全VP1区并测序和拼接。下载CVA16病毒标准序列,采用Geneious 5.4.1和MEGA 6.05等软件对本研究CVA16的全VP1区的核苷酸和氨基酸序列分析。结果经鉴定后共检出22株从Vero细胞分离CVA16和6株RD细胞分离的CVA16毒株,进一步通过特异引物扩增获得21株可用的CVA16VP1全长序列,基于全VP1基因系统进化分析,这21株CVA16全属于B1a基因型。21株CVA16全长VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为91.9%~99.6%和89.2%~99.3%;与中国CVA16 B1a基因型的其他株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.7%~96.3%和89.2%~97.0%。与CVA16 B1b其他参考株对比,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在84.3%~87.2%和89.2%~97.0%。与其它CVA16的B1a基因亚型相比较发现21个氨基酸位点出现变异。结论2022年中国云南省昆明某医院引起HFMD的CVA16毒株属于B1a基因型,应继续监测以明确其流行特征。

柯萨奇病毒B组3型上海分离株的基因特征分析

为探讨上海市不同来源的柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CVB3)菌株的循环动态变化及基因特征,本研究对分离自上海市环境污水、健康儿童和急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中的CVB3菌株进行VP1区基因序列测定,并对照全球CVB3代表株进行序列相似性分析和系统发生学分析。结果显示,1989-2021年上海市不同来源的CVB3分离株共有120株,属于D、E基因亚型。上海CVB3分离株的核苷酸和氨基酸相似性差异较大,分别为78.7%~100%和93.3%~100.0%。2016年首次从上海环境污水中分离到E基因亚型CVB3,2021年再次分离到该基因亚型。2021年上海环境污水中的E基因亚型CVB3分离株与2020年的广东手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)病例CVB3分离株VP1区的核苷酸相似性较高,但上海暂未有该基因亚型感染病例报道。因此,仍须长期对环境污水和不同肠道病毒感染病例进行监测,以提高肠道病毒监测的敏感性,为肠道病毒相关疾病的诊疗提供数据支撑。

分离自手足口病和疱疹性咽峡炎患者的柯萨奇病毒A组10型病毒的基因特征及差异分析

目的比较2株分离自手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)和疱疹性咽峡炎(herpangina,HA)患者粪便样品中的柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CA10)全基因组差异及基因特征,探讨基因突变可能导致的临床症状差异。方法收集昆明市儿童医院经实时荧光定量PCR检测结果为CA10阳性的HFMD及HA患者粪便样品,在敏感细胞人横纹肌瘤细胞(rhabdomyoma,RD)上培养并分离出CA10。设计特异性引物扩增获得CA10全基因序列,通过BioEdit软件比较分离自HFMD及HA患者的CA10基因序列核苷酸与编码氨基酸之间的差异。从NCBI基因库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载CA10 VP1基因序列作为参考序列,系统进化树分析分离获得的昆明CA10流行株的进化情况及来源。结果分离自HFMD和HA患者的CA10-HFMD和CA10-HA的VP1区域核苷酸同源性为99.1%,氨基酸同源性为99.8%,且存在2个非同义突变位点;全基因序列核苷酸同源性为98.9%,编码区氨基酸同源性为99.5%,且存在12个非同义突变位点。系统进化分析表明2个昆明CA10分离株均位于G基因谱系,且与KF999765(北京)和JX473455(深圳)株亲缘关系最近。结论来源于HFMD和HA患者的CA10分离株在核苷酸和氨基酸水平上相似性较高,且属于同一基因谱系。基因突变导致的氨基酸变异可能影响病毒的毒力从而导致患者症状的差异。

不同细胞对柯萨奇病毒A组10型毒株的敏感性及滴度检测影响因素分析

目的探讨不同细胞对柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株的敏感性和滴度检测影响因素,为临床样品分离、病毒培养及保存使用提供基础数据。方法10株已在非洲绿猴肾(African green monkey kidney,Vero)细胞分离并培养2代的CV-A10毒株,检测其在Vero细胞、人胚肺二倍体细胞(human embryonic lung diploid cell,KMB17)、人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞及人喉癌细胞(human laryngeal carcinoma cell,HeP-2)上的感染性滴度,并对毒株进行蚀斑纯化和冻融处理。结果CV-A10毒株均能适应Vero细胞、KMB17细胞及RD细胞,不能适应HeP-2细胞。RD细胞上第1天即开始病变,第4天达到增值高峰,感染性滴度最高,达到7.75 lgCCID50/ml;KMB17细胞上病变最慢,第3天发生病变,第5天达到增值高峰,滴度为4.85 lgCCID50/ml。毒株在37℃放置3 d感染性滴度明显下降,4℃放置3 d,-30℃和-80℃放置30 d感染性滴度均无影响。结论RD细胞是CV-A10毒株最敏感的细胞,HeP-2细胞不敏感。CV-A10毒株反复冻融次数不宜超过5次,保存温度越低越好并避免4℃和常温下长时间放置。

一株Vero细胞适应的柯萨奇病毒A组10型毒株遗传稳定性研究

目的探讨一株手足口病相关柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株R6-19/XY/CHN/2017在Vero细胞中的适应性,及其连续传代的遗传稳定性。方法对R6-19/XY/CHN/2017毒株在Vero细胞上进行连续适应传代培养后,对适应前病毒及适应后的第1、5、10、15代次毒株的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒感染性滴度、全基因组核苷酸序列及氨基酸序列等进行比较分析。结果该毒株能较好地在Vero细胞上适应,不同代次的感染性滴度在7.85 lgCCID50/ml^8.17 lgCCID50/ml。与适应前毒株比较,其5′UTR及编码区共有7个碱基发生改变,VP4和VP1编码区分别有1、3个氨基酸发生改变;而适应后病毒各代次在CPE、病毒感染力特点等无明显区别,且各代次全基因核酸序列中,只有第15代的VP1蛋白编码区发生一个碱基突变。结论 CV-A10株R6-19/XY/CHN/2017能在Vero细胞较好地适应,并具有良好的遗传稳定性,这将为后续CV-A10疫苗的研发和相关机制研究提供参考。