烤烟烟碱含量标记基因NtMPO1和NtARF6的鉴定

为了鉴定有效的烟碱含量标记基因,测定89个烤烟品种叶片烟碱含量,筛选出高、中、低烟碱烤烟品种,然后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定高、中、低烟碱烤烟品种中烟碱合成、转运和调控相关的共25个基因的相对表达量,分析基因表达量与烟碱含量的相关性,筛选烟碱含量候选标记基因,后续以云烟87和K326为材料,通过设置不同氮素浓度(2.5、5.0、7.5 mmol/L NaNO_(3))、采取不同部位(上、中、下部)叶片和打顶前后10 d叶片创制烟碱含量差异材料,测定烟碱含量及其候选标记基因的相对表达量,验证烟碱含量候选标记基因的有效性。结果表明,从89个烤烟品种中筛选出高、中、低烟碱烤烟品种各4个,这些烤烟品种的烟碱含量与NtMPO1基因相对表达量呈极显著负相关,与NtARF6基因相对表达量呈极显著正相关,两者可以作为烟碱含量标记基因的候选基因。烟碱含量候选标记基因的验证试验结果表明,与正常供氮处理相比,高氮处理叶片烟碱含量显著增加,NtMPO1基因相对表达量显著降低,NtARF6基因相对表达量显著提高;低氮处理烟碱含量显著降低,NtMPO1基因相对表达量显著提高,NtARF6基因相对表达量显著降低。不同部位烟叶中,上部叶烟碱含量显著高于中部叶,中部叶烟碱含量显著高于下部叶;上部叶中NtMPO1基因相对表达量显著低于中部叶,中部叶中NtMPO1基因相对表达量显著低于下部叶;上部叶中NtARF6基因相对表达量显著高于中部叶,中部叶中NtARF6基因相对表达量显著高于下部叶。相较于打顶前,打顶后叶片烟碱含量显著提高,NtMPO1基因相对表达量显著降低,NtARF6基因相对表达量显著提高。综上,NtMPO1和NtARF6基因可以作为烟碱含量的有效标记基因。

植物防龋疫苗融合基因表达载体中选择标记基因的去除

背景:出于对转基因植物的食用安全和生态安全的考虑,标记基因的存留是影响转基因植物的首要安全问题。目的:基于免疫防龋原理,课题组针对表面蛋白和葡糖基转移酶这2种致龋毒力因子,构建植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8,为转基因植物疫苗的研发提供基础。方法:该研究运用DNA重组技术,通过DNA片段分离、连接、转化、克隆子检测、测序等系列步骤,将植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8中的选择性标记基因Km和GUS去除。结果与结论:标记基因去除效率达99%,该研究为免疫防龋的转基因植物疫苗的安全生产奠定了良好的实验基础,也为其它植物疫苗的载体构建提供思路。

转基因植物中标记基因研究概况

标记基因在植物基因工程中具有重要的作用。它在遗传转化中的关键作用是区分转化和非转化的细胞,以筛选并鉴定出转化的细胞、组织和转基因植株。目前,已报道的标记基因种类很多,划分标准也各不相同。出于对生态环境和转基因食品的生物安全性考虑,从传统的选择标记基因、与激素代谢相关的基因、与氨基酸代谢相关的基因、与糖类代谢相关的基因、能解除化合物毒性(或胁迫)的基因、编码能产生特定荧光物质的蛋白酶类的基因、利用颜色差异性筛选转化体的相关基因及抗性标记基因的敲除技术八个不同的方面,综述了标记基因的种类、作用原理、应用价值及存在的问题。在标记基因的综合应用方面,详细总结了标记基因与组织(或器官)特异性启动子和MAT载体系统的结合应用,以及β-葡萄糖苷酸酶作为多功能标记基因的综合应用。最后,对标记基因的发展前景进行了探讨分析。

去除标记基因的水稻转基因研究

以 p130 0 (含潮霉素抗性标记基因 )和 p13W 8(含反义蜡质基因 )为供体DNA ,通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 介导的方法 ,对水稻品种寒丰B的幼胚愈伤组织进行共转化 ,获得 35份转基因植株。经PCR检测 ,有 5份检测到反义蜡质基因和潮霉素抗性基因共存。在其T1 代材料中 ,通过PCR检测获得2 4份只带有反义蜡质基因而无潮霉素标记基因的转基因植株。结果证明 :在共转化植株后代中 ,通过筛选可获得无抗性标记基因的水稻转基因植株。

质体基因工程中选择标记基因研究进展

与细胞核基因工程相比,质体基因工程能更安全、精确和高效地对外源基因进行表达,作为下一代转基因技术已广泛用于基础研究和生物技术应用领域。与细胞核基因工程一样,质体基因工程中也需要合适的选择标记基因用于转化子的筛选和同质化,但基于质体基因组的多拷贝性和母系遗传特点,转化子的同质化需要一个长期的筛选过程,这就决定了质体基因工程中选择标记基因的选择标准将不同于细胞核基因工程中广泛使用的现行标准。目前,质体基因工程的遗传转化操作中使用较多的是抗生素选择标记基因,出于安全性考虑,需要找到可替换、安全的选择标记基因或有效的标记基因删除方法。本文在对质体基因工程研究的相关文献分析基础之上,对主要使用的选择标记基因及其删除体系进行了综述,并对比了其优缺点,同时探讨了质体基因工程中所使用的报告基因,以期为现有选择标记基因及其删除体系的改进和开发提供一定参考,进一步推动质体基因工程,尤其是单子叶植物质体基因工程的发展。

正向选择的生物安全标记基因

标记基因的产生方便了植物的转化,随着转基因植物的迅速发展及商品化,人类更关注抗性标记基因的安全性。目前解决的有效途径是发展正向选择系统,使用非抗性的生物安全标记基因,主要包括糖类代谢酶基因(pmi和xylA)、干扰氨基酸代谢酶基因(ak和dapA)、绿色荧光蛋白基因(gfp)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、核糖醇操纵子(rtl)和叶绿素生物合成基因(hemL)等。

浅析昆虫转基因技术中的几类标记基因

自1982年科学家成功转化出首例转基因果蝇以来,昆虫转基因技术因其潜在的广泛应用前景而成为研究热点。昆虫转基因技术得以实现离不开标记基因的应用,标记基因在筛选转基因昆虫个体上起到关键作用。经过科学家不断探索,转化标记不断改进。文中浅析了昆虫转基因技术中常用的转化标记,并对其最新研究进展进行综述,为昆虫转基因技术的进一步利用提供了依据。

植物筛选标记基因应用进展

筛选标记基因在植物遗传转化中担负着区分转化体和非转化体的重要作用。合适的筛选标记基因及其相应的筛选剂是植物转基因成功的关键。综述了迄今为止人们在植物转基因研究中使用过的主要筛选标记基因。

杂交粳稻亲本产量性状优异配合力的标记基因型筛选

提高杂交粳稻竞争优势的关键是改良其恢复系产量性状的配合力。为使之更富成效,选用115个SSR引物扩增6个粳稻BT型不育系和12个恢复系的标记基因型,并按NCII遗传设计配制72个F1组合,分析18个亲本的单株日产量、单株有效穗数、每穗总粒数、每穗实粒数、千粒重5个性状的配合力,结合亲本SSR分子标记数据和性状配合力数据筛选了5个性状优异配合力的标记基因型。结果发现20个SSR标记基因型与亲本产量及其构成性状配合力显著相关。其中8个与亲本单个性状配合力相关;6个同时与亲本2个性状配合力相关;4个同时与亲本3个性状配合力相关;2个同时与亲本4个性状配合力相关。同时与多个性状配合力相关的标记基因型,对各性状的作用方向有正有负。RM152-165/170是单株日产量和单株有效穗数优异配合力效应最大的标记基因型,可使F1的相应性状值增加20.6%和12.7%。优异配合力的标记基因型可直接用于粳稻恢复系配合力的分子标记辅助改良。

转基因植物中筛选标记基因的利用及消除

在基因转移过程中,人们常常使用标记基因来筛选转化细胞或组织。常用的筛选标记基因尤其是抗生素抗性基因的使用往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响,且影响基因多重转化。为了消除这些弊端,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物应运而生。本文主要综述转基因植物中有关筛选标记基因及其消除方法。

从AFLP指纹和标记基因序列看我国养殖的四种鲍的亲缘关系

九孔鲍是我国南方主要的鲍养殖对象，皱纹盘鲍与盘鲍则在北方被广泛养殖。对于皱纹盘鲍与盘鲍，尤其是九孔鲍与杂色鲍的分类关系，迄今学术界还存在着不同看法。本文通过AFLP指纹的比较以及细胞核ITS-1和18SrRNA基因片段、线粒体16S rRNA和COI基因片段DNA序列的比较，发现九孔鲍与杂色鲍之间遗传趋异很小，只达到不同地方群体差异的水平；皱纹盘鲍与盘鲍趋异较大，可以认为是属于不同亚种。本研究结果同时表明AFLP技术是进行鲍种质鉴别和遗传多样性研究的有用手段。

提高转基因植物标记基因安全性策略的研究进展

目前,广泛使用的转基因植物抗性标记基因对环境和食品存在潜在风险。提高转基因植物标记基因安全性策略有3种:利用无争议的生物安全标记基因;剔除转基因植物中选择标记基因;利用无选择标记基因的转化系统。本文综述了这3种策略的作用原理、种类和存在的问题,并对提高转基因标记基因安全性技术途径的前景和研究方向进行了分析。

杂交粳稻亲本米质性状优异配合力的标记基因型鉴定

杂交粳稻米质整体水平不如常规粳稻也是限制杂交粳稻广泛种植的原因之一。本研究选用115个SSR引物扩增6个粳稻BT型不育系和12个恢复系的标记基因型,并分析72个F1组合谷粒长、谷粒宽、糙米率、精米率、整精米率、垩白米率、垩白度、糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量10个米质性状的配合力,结合亲本SSR分子标记数据和性状配合力数据筛选了10个米质性状优异配合力的标记基因型。结果共鉴定出30个SSR标记基因型与亲本10个米质性状配合力显著相关,其中25个与亲本米质性状不良配合力相关,5个与优异配合力相关。标记基因型RM263-175/180和RM444-230/240可以使F1整精米率分别提高3.2%和2.5%。RM3-120/150可以使F1谷粒长缩短2.4%,RM444-180/240可以使F1谷粒宽增加2.1%。RM428-273/294可以使F1植株上的杂交稻米直链淀粉含量减少7.0%。有8个标记基因型同时也影响产量性状配合力。RM3-120/150同时可以使F1的每穗总粒数和每穗实粒数分别增加15.9%和10.9%。RM1211-150/160可使F1的糙米率和精米率分别减少0.9%和1.1%,同时使F1的每穗总粒数和每穗实粒数分别增加21.8.%和20.4%。RM23-150/160可使F1的垩白米粒率和垩白度分别增加44.1%和45.7%,同时使F1的单株日产量和每穗总粒数分别增加11.2%和11.6%。这些结果可用于指导亲本米质性状和产量性状配合力的分子标记辅助改良以及未来杂交粳稻组合配置中的亲本选配。

利用标记基因选配褐壳蛋鸡配套杂交亲本

应用本实验室研制的抗鸡红细胞抗原单价血清（4个位点，14个等位基因）和DNA指纹技术，对我们组配成功的一个褐壳蛋鸡配套系统的5个亲本进行了群体遗传学分析。结果表明，山标记某国测定所提供的亲本品系遗传差异的大小，与这些品系实际杂交效果的优劣根一致，证实了标记辅助选种方法的有效性。

转基因植物中标记基因的安全性新策略

转基因植物中的除草剂和抗生素抗性标记基因潜在的生态环境和食用安全性令人担忧。解决转基因植物中抗性标记基因安全性问题有两种途径:一是转化时仍使用抗性标记基因,转基因植物再生成功后,在释放大田前将标记基因剔除;二是发展安全性标记基因用于植物遗传转化。本文综述了三种标记基因剔除系统和几种安全性标记基因在植物转化中的应用进展。

不同加工条件下转基因大米潮霉素标记基因(hpt)稳定性研究

目的从DNA稳定性的角度,探讨转基因大米潮霉素标记基因hpt向食品或消化道微生物转移发生水平转移的可能性。方法利用针对hpt不同大小片段的PCR扩增体系,对hpt在转基因大米加工食品中的稳定性进行研究。结果建立的PCR体系能稳定扩增出hpt236bp-910bp不同大小的5个片段。利用这一PCR体系对s86转基因大米不同加工食品的检测显示,加工米饭、粥大于500bp的片段已降解,爆米花和锅巴大于236bp的hpt片段已降解。对照M86大米加工米饭和粥仅能扩出植物叶绿体基因rbcl片段,爆米花、锅巴及空白对照所有扩增均为阴性。结论hpt在转基因大米加工食品中均已不同程度的发生了降解,不同加工方式对hpt片段降解影响显著,在加工后hpt以较大或完整片段向食品或消化道微生物转移的可能性减小。

用绿色荧光蛋白监测转基因植物中选择标记基因的消除

绿色荧光蛋白 (GFP)可直接进行活体观察 ,它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。为此 ,构建了植物表达载体pGNG ,将绿色荧光蛋白基因 (gfp)和卡那霉素抗性基因表达盒 (NosP nptII NosT)一起克隆在两个同向的lox位点间 ,在第一个lox位点上游置有CaMV 35S启动子以驱动GFP表达 ,第二个lox位点下游置有不含启动子的大肠杆菌 β 葡萄糖醛酸酶 (GUS)基因。首先在含卡那霉素 (Kan)的培养基上筛选出转pGNG的烟草 ,借助绿色荧光可容易地检出表达GFP的转化体。然后用另一转化载体pCambia130 0 Cre二次转化表达GFP的转基因植物 ,利用另一选择标记基因 潮霉素抗性基因 (hpt)进行筛选 ,在获得的再生植株中 ,Cre重组酶的表达消除了转化体中两lox位点间的gfp和nptII。实验结果表明可借助GFP荧光的消失 ,快速选出nptII被消除的二次转化体 ,同时GUS(作为目的蛋白 )在CaMV 35S启动子驱动下获得表达。最后利用后代的分离将hpt和cre除去。

杂交粳稻亲本产量性状优异配合力的标记基因型检测

加快杂交粳稻发展的关键在于提高杂交粳稻组合的竞争优势,而竞争优势的提高取决于恢复系产量性状配合力的改良。选用152个SSR引物扩增11个粳稻雄性不育系和9个恢复系的标记基因型,并按NCⅡ遗传设计配制99个F1组合,分析20个亲本的抽穗期、株高、单株有效穗数、穗长、单穗总粒数、单穗实粒数、结实率、粒长、粒宽、粒厚、千粒重和单位面积日产量等12个性状的配合力,结合亲本SSR分子标记数据和性状配合力数据检测12个性状优异配合力的标记基因型。结果表明,1004S是综合评价最优的不育系;LR5、盐恢R50、LC64是较优恢复系。筛选到112个SSR标记基因型与亲本产量及其构成性状配合力显著相关,其中30个与亲本单个性状配合力相关;与亲本2个性状、3个性状、4个性状和5个性状配合力相关的标记基因型个数分别为14、6、3和3;标记基因型RM215-170/180与亲本7个性状的配合力相关。RM2439-150/170为单位面积日产量优异配合力效应最大的标记基因型,能使F1增产32.6%。

杂交粳稻亲本穗长和枝梗数性状优异配合力的标记基因型筛选

提高杂交粳稻竞争优势的关键是选育具有高配合力的大穗型杂交粳稻恢复系。为使配合力改良更有效,选用115对SSR引物扩增6个粳稻BT型不育系和12个恢复系的标记基因型,并按NCⅡ(North CarolinaⅡ)遗传交配设计配制72个F1组合,分析18个亲本的一次枝梗数、二次枝梗数和穗长3个穗部性状的配合力,结合亲本SSR分子标记数据和性状配合力数据筛选3个穗部性状优异配合力的标记基因型。结果发现:23个标记基因型与亲本3个穗部性状配合力显著相关。其中1个标记基因型与亲本3个性状配合力都相关;7个标记基因型与亲本2个性状配合力都相关;15个标记基因型与亲本单个性状配合力相关。标记基因型RM8254-120/180对3个性状的配合力效应都是正的,可使F1的每穗一次枝梗数、二次枝梗数和穗长3个性状值分别增加21.63%、21.12%和16.12%。与亲本2个性状配合力相关的7个标记基因型中有6个标记基因型对亲本的配合力效应是正值,1个标记基因型对亲本的配合力效应是负值。

一种导入蚕限性标记基因的有效方法

介绍了一种回交结合标记基因选择 ,转移蚕限性品种标记基因的方法。利用这种方法可以较快地把一个限性系统中性别控制基因导入普通蚕品种 。