大熊猫核糖体蛋白S26亚基基因(rps26)的cDNA克隆及序列分析

为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps26基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基基因rps26的异同,以大熊猫的肌肉组织为材料,根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S26亚基基因(rps26)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,成功地克隆了核糖体蛋白亚基基因rps26的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫rps26亚基基因的表达序列长为413 bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为13.025 2×103,等电点为11.61.拓扑预测显示该蛋白含有3个功能位点:1个N-糖基化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ蛄姿峄?位点和1个核糖体蛋白S26e signature位点.进一步分析发现,大熊猫rps26基因与已报道的人、西藏黄牛、野猪、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为90.23%、91.67%、92.82%、87.36%和86.78%;氨基酸序列同源性均为99.86%.

核糖体蛋白S26的研究进展

核糖体蛋白(ribosomal proteins,RPs)不仅在细胞内参与合成蛋白质,还具有多种核糖体外功能。核糖体蛋白S26(RPS26)位于核糖体小亚基,其功能障碍与多种疾病密切相关。近年来,有关RPS26的研究主要在参与核糖体装配等核糖体功能方面,以及参与无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)、直接或间接调控重要的抑癌基因p53表达等核糖体外功能方面。多篇报道证实RPS26基因突变可引起戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia,DBA),而RPS26基因与Ⅰ型糖尿病的关系仍有争议。探索RPS26参与NMD机制在DBA发生中的作用有助于深入认识DBA发病机理,同时也可为完善SMaRT(spliceosome-mediated mRNA trans-splicing)技术等基因疗法提供帮助。此外,RPS26在癌症中的作用也值得进一步探索。

PCR技术检测棘阿米巴26S核糖体DNA

目的:用聚合酶链反应(PCR)方法检测棘阿米巴的26S核糖体DNA(26S rDNA,Rns),为早期诊断棘阿米巴角膜炎提供方法。方法:分离培养三株不同基因型棘阿米巴虫株,提取虫株基因组DNA,合成棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a),通过聚合酶链反应(PCR)扩增部分26SrDNA序列。结果:三株不同基因型棘阿米巴虫株属于两种基因型,其中Acanthamoeba sp.CJY/s2株和Acanthamoeba sp.CJY/s株属于Rns T4基因型,Acastellanii Neff株属于Neff基因型。PCR扩增后,Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因片段扩增出分子量大小为126 bp的特定扩增带,而Acanthamoeba sp.CJY/s株的26S核糖体DNA基因片段则未得到预期的扩增带。结论:用棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a)可以有效扩增Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因,可以为部分棘阿米巴性角膜炎的早期检测提供新的检测手段。

改良RACE技术克隆板栗短雄花序26S核糖体基因片段

RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术是以RT-PCR为基础,根据部分已知基因序列(如EST),通过cDNA的3′端和5′端快速扩增获取全长cDNA的一种有效方法。本文作者以板栗芽变品种短雄花序为材料,利用改良SMART RACE的技术克隆了板栗(Castanea mollissimaBlume)26S基因5′端未知序列,所得到的cDNA的5′末端共有1 204 bp。序列比对分析显示,该检测的核糖体基因与已知其他物种中的核糖体基因高度同源,它与已克隆到的同源基因橡树和八角枫之间的同源性分别为98%和97%。

一次大强度运动后大鼠骨骼肌收缩蛋白降解和26S蛋白酶体活性的变化

目的:探讨一次大强度运动对骨骼肌收缩蛋白降解和26S蛋白酶体活性的影响。方法:36只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为6组:安静对照组、运动0.5小时组、运动1小时组、运动1小时后1小时组、运动1小时后2小时组、运动1小时后6小时组,每组6只。运动方式采用一次大强度跑台运动,速度为25m/min,坡度为5%,运动时间分别为0.5小时和1小时。运动后按每组规定时间取材大鼠腓肠肌,观察其3-甲基组氨基酸(3-MH)含量、26S蛋白酶体活性和26S蛋白酶体C2亚基mRNA表达的变化。结果:(1)运动(0.5小时和1小时)后即刻和运动1小时后6小时大鼠腓肠肌3-MH含量显著高于安静对照组(P<0.01),其中运动0.5小时即刻值最高。(2)运动0.5小时即刻、运动1小时后6小时大鼠腓肠肌26S蛋白酶体活性显著高于安静对照组(P<0.05)。(3)运动1小时后6小时大鼠腓肠肌26S蛋白酶体C2亚基mRNA表达显著高于安静对照组(P<0.01),其它时间点却低于安静对照组。结论:运动后26S蛋白酶体活性增高可能促使骨骼肌收缩蛋白降解增强,其活性受亚基基因调控。

热疗中热休克蛋白90对26S蛋白酶体的调控机制

目的探讨热疗中热休克蛋白90(HSP90)对26S蛋白酶体的调控机制。方法建立42℃热疗的Hep G2肝癌细胞系模型,评价不同热疗持续时间(0、3、6、12、24 h)对细胞内活性氧簇(ROS)和细胞增殖的影响;并对热疗导致Hsp90α和26S蛋白酶体的影响进行分析。结果热疗后细胞内ROS的含量增加(F=28.958,P<0.001),且热疗对细胞的增殖抑制程度随着时间的延长显著增强(F=621.704,P<0.001);热疗导致胞内Hsp90α表达量增加(F=27.403,P=0.035),26S蛋白酶体表达量明显降低(F=164.174,P<0.001),活性也下降(F=133.043,P<0.001);干扰HSP90α后,26S蛋白酶体也减少(F=180.231,P<0.001)。结论随着热疗时间延长,细胞内ROS含量增加,热应激和ROS共同导致蛋白持续变性而消耗HSP90,使没有足够的HSP90对26S蛋白酶体组装和稳定导而导致变性蛋白蓄积发生未折叠蛋白反应使细胞死亡。

高温胁迫下受小热休克蛋白26(sHSP26)影响的玉米叶绿体蛋白质的研究

以玉米(Zea mays L.)品种郑单958幼苗第2个新展开的叶片为试验材料,运用双向电泳(2-DE)和质谱分析等技术,确定高温胁迫下与s HSP26相关蛋白及其与叶绿体关系。质谱鉴定结果显示,胶上存在24个蛋白质差异点,属于14个蛋白质,归为6种功能类别,其中42%蛋白质参与光反应。与其对照相比,用s HSP26抗体(AT-s HSP26)处理后,与光合作用相关蛋白(ATP合酶α,β和γ亚基、放氧增强子蛋白(OEE1)、叶绿素a/b结合蛋白、细胞色素b6/f复合体铁硫亚基、光系统Ⅰ反应中心亚基Ⅳ和铁硫中心蛋白)表达下调。并且叶绿体PSⅡ的放氧速率明显降低。表明s HSP26通过调控光合作用相关蛋白,从而在一定程度上对叶绿体起到保护作用,最终影响玉米叶绿体的耐热性。

泛素/26S蛋白酶体途径与显花植物自交不亲和反应

植物的生长和发育离不开短命调控蛋白的有选择性降解,其中一种重要的降解方式就是泛素/26S蛋白酶体途径。在这个途径中,泛素(ubiquitin)和26S蛋白酶体起着至关重要的作用,需要被降解的蛋白会通过E1-E2-E3酶接合反应由Ub进行标记,随后标记蛋白会被26S蛋白酶体识别并降解。自交不亲和反应也正是通过此途径实现的,ARC1(armrepeatcontaining1)和SCFs(skp1-cul1-F-box-proteins)作为E3s分别在孢子体自交不亲和和配子体自交不亲和反应中起作用。本文综述了就泛素/26S蛋白酶体途径的组成及其在自交不亲和反应中的作用。

慢性氧化应激诱导兔动脉粥样硬化对蛋白酶体26S及20S活性影响的实验研究

目的探讨慢性氧化应激诱导动脉粥样硬化(AS)对蛋白酶体26S及20S活性的影响,以及与泛素/泛素蛋白结合物(Ub/UPC)表达之间的关系。方法新西兰雄性兔30只,随机分为正常饮食组(N)和高胆固醇饮食组(H),共饲养12周。检测26S及20S的活性,观察腹主动脉的病理变化、Ub/UPC的表达及氧化应激等指标。结果成功诱导了AS模型,H组的20S的活性比N组明显增高(P<0.01),而26S的活性两组间差异无统计学意义(P>0.05),Ub/UPC在H组的表达比N组明显增强。结论慢性氧化应激状态下,20S的活性明显增强,Ub/UPC大量聚集,可能在AS的病理变化过程中起着重要的作用。

家蝇核糖体蛋白S18基因的克隆及表达模式研究

旨为证实核糖体蛋白S18(Ribosomal protein S18,RPS18)基因在家蝇体内的表达稳定性。从构建家蝇幼虫c DNA文库中筛选到核糖体蛋白S18基因,以c DNA为模板,通过PCR扩增,获得RPS18基因完整编码序列(登录号:KT006855),运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建p ET28a/RPS18重组质粒,转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化,制备多克隆抗体并进行抗血清特异性分析。应用RT-PCR、q PCR及Western-blot从转录、翻译水平上分析RPS18基因在家蝇不同发育时期和三龄幼虫不同组织中的表达情况。结果表明,RPS18基因ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,理论分子量为17 590.5 Da,等电点为10.48;将构建的重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,纯化得到RPS18蛋白;将该纯化蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体,His单抗鉴定及抗血清特异性分析显示,其均可见单一条带;RT-PCR、q PCR及Westernblot分析表明,RPS18基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均能够稳定表达;综合分析表明,该基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均保持较好的表达稳定性。

泛素/26S蛋白酶体途径与植物的生长发育

泛素/26S蛋白酶体途径在植物蛋白降解系统中起重要作用,泛素分子主要通过泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)将靶蛋白泛素化,泛素化的蛋白最后被26S蛋白酶体识别和降解。泛素蛋白酶体途径参与植物体内的多种生理过程,如花和胚的发育、光形态建成、植物生长物质等几乎所有的生长发育过程,本文主要对泛素/26S蛋白酶体途径及其在植物生长发育过程中的精确调控作用进行综述。

植物泛素/26S蛋白酶体途径研究进展

泛素/26S蛋白酶体途径是最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径,由泛素激活酶、泛素结合酶、泛素蛋白连接酶和26S蛋白酶体组成,参与调控植物生长发育的多个方面。泛素蛋白酶体途径参与植物体内的众多生理过程,如植物激素信号、光形态建成、自交不亲和反应和细胞周期等。就泛素/26S蛋白酶体途径以及在植物生长发育中的作用的研究近况做一综述。

泛素/26S蛋白酶体途径及其在植物生长发育中的功能

泛素/26S蛋白酶体途径是一种蛋白高效降解途径,主要负责真核细胞内蛋白的选择性降解。泛素分子主要通过泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素-蛋白连接酶E3将靶蛋白泛素化,泛素化的蛋白最后被26S蛋白酶体识别和降解。本文介绍了泛素/26S蛋白体介导的特异性蛋白质降解途经,并对其在植物激素信号、光形态建成、植物衰老、自交不亲和反应、细胞周期调控、花的发育、生物钟节律和非生物胁迫响应中的功能最新研究进展进行了综述。

植物泛素/26S蛋白酶体通路的生理功能和分子生物学

介绍泛素/26S蛋白酶体通路的分子生物学研究最新进展,并对其同源异形性及在植物激素信号、抗病和衰老、光形态建成、植物逆境信号转导中的功能进行了讨论。

水稻杂种超亲表达26S蛋白酶体亚基基因OsHL1的克隆和分析

运用DDRT PCR分离获得水稻杂种一代超亲表达的cDNA片段。以此序列在日本晴cDNA全长数据库进行同源搜索 ,检索到一个功能未知的全长cDNA ,有 16 90bp,命名为OsHL1,进一步分析发现它位于 3号染色体上R2 393和MRG4 5 4 8之间。序列分析表明 ,该基因与日本晴编码 2 6Sproteasomeregulatoryparticlenon ATPasesubunit5基因片段的序列同源性为97%。其中包含一个完整的开放阅读框 (ORF) ,编码 4 4 3个氨基酸 ,氨基酸序列同源性分析发现高度保守区。RT PCR显示OsHL1基因的表达受到ABA和MeJA处理下调。推测杂种的表现可能与 2 6S蛋白酶体亚基参与的信号调控相关。

泛素/26S蛋白酶体途径调节非生物胁迫的研究进展

随着环境的恶化和资源的匮乏,非生物胁迫已成为制约植物生长和发育的重要因素,严重影响农作物的产量和农产品的品质。泛素/26S蛋白酶体途径(ubiquitin/26Sproteasome pathway,UPP)通过特异性地降解泛素化修饰的蛋白质,介导了植物生长发育的诸多方面,并在植物应对非生物胁迫过程中起关键的调控作用。该文主要概述了泛素/26S蛋白酶体途径及其调控植物响应非生物胁迫机制的研究进展。

犬钩虫核糖体蛋白L36及S4A全长cDNA克隆与蛋白特性分析

目的克隆犬钩虫Ancylostoma caninum核糖体蛋白L36(AcaRPL36)及S4A(AcaRPS4A)全长cDNA序列,并对编码的蛋白特性进行分析,探讨它们在研究系统发育中的应用。方法运用3′RACE技术并结合RT-PCR技术先后分别从犬钩虫中克隆核糖体蛋白L36及S4A的部分序列,经拼接后获得全长cDNA序列。用BlastP搜索相似性序列及保守结构域,所获序列在GenBank中登记,并用Neighbor-Joining(NJ)法构建基于RPL36及RPS4氨基酸序列的系统发育树。结果AcaRPL36全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490128)为390 bp,开放阅读框为315 bp,编码104个氨基酸组成的蛋白;AcaRPS4A全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490129)为880 bp,开放阅读框为786bp,编码261个氨基酸组成的蛋白。RPL36及RPS4序列较保守,与Caenorhabditis elegans等的亲缘关系较近的生物,在系统发育树中的遗传距离也较近。结论首次获得犬钩虫RPL36及RPS4A,RPL36和RPS4可能作为分子指标应用于研究生物系统发育。

26S蛋白酶复合体介导的蛋白降解对LTP产生的影响

目的 :观察 2 6S蛋白酶复合体介导的蛋白降解对大鼠海马LTP产生的影响。 方法 :利用 2 6S蛋白酶复合体特异抑制剂和本室制备的 2 6S蛋白酶复合体抗体灌流海马脑片 ,观察海马CA1区通路LTP的诱导情况。 结果 :正常情况下 ,LTP诱出率为 86 %。在 2 6S蛋白酶复合体抗体灌流脑片情况下 ,LTP诱出率显著下降 (18% ) ;在 2 6S蛋白酶复合体特异抑制剂lactacystin存在条件下 ,LTP诱出率也明显降低 (0 % )。结论 :本研究证明 2 6S蛋白酶复合体抗体及特异抑制剂能显著抑制LTP产生。这提示 ,2 6S蛋白酶复合体介导的蛋白降解过程在LTP中发挥了重要作用。

26S蛋白酶体参与人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经元样细胞逐步分化过程中26S蛋白酶体的作用。方法:贴壁分离获得的hBMSCs先经β-巯基乙醇(β-ME)预诱导24h,随后用视黄酸(RA)诱导3d,最后再用生长因子(GF,10μg/LbFGF、20μg/LNGF)持续培养3d。免疫荧光染色观察不同诱导阶段神经前体细胞标志物nestin、早期神经元标志物Tuj1、成熟神经元标志物NF的表达。免疫荧光染色和RT-PCR分析不同诱导阶段26S蛋白酶体的表达变化。应用含26S蛋白酶体抑制剂的培养液(5μmol/LMG132、10μg/LbFGF、20μg/LNGF)作用于经β-ME/RA诱导后的细胞,NF免疫荧光染色观察蛋白酶体抑制剂对hBMSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:未诱导的hBMSCs几乎不表达nestin、Tuj1和NF;经β-ME/RA诱导后神经前体细胞标志物nestin和早期神经元标志物Tuj1表达率增高(34.41%±1.27%,27.79%±1.27%);经β-ME/RA/GF诱导后成熟神经元标志物NF表达率迅速升高(56.72%±2.40%)。免疫荧光染色和RT-PCR结果证实,未诱导hBMSCs26S蛋白酶体表达水平较低;经β-ME/RA诱导后个别细胞26S蛋白酶体染色增强,26S蛋白酶体mRNA表达水平增至1.33倍;经β-ME/RA/GF诱导后26S蛋白酶体深染细胞增多,26S蛋白酶体mRNA表达水平增至1.77倍。应用26S蛋白酶体抑制剂MG132后,NF阳性细胞表达率显著降低(37.59%±1.52%)。结论:hBMSCs在β-ME/RA/GF诱导下可逐步向神经元样细胞分化,26S蛋白酶体在诱导过程中表达水平逐步增高,26S蛋白酶体抑制剂能够抑制hBMSCs向成熟神经元分化,提示26S蛋白酶体可能参与诱导hBMSCs向神经元样细胞的成熟分化。

严重烫伤大鼠骨骼肌26S蛋白酶复合体和19S调节复合体活性的变化

为阐明及防治烧伤后负氮平衡提供理论依据 ,在接近体内环境下于体外用免疫沉淀扣除法检测 30 %体表皮肤全层烫伤大鼠伤后第 1、2、3、5、7天内骨骼肌中 2 6S蛋白酶复合体及 19S调节复合体活性的变化。结果发现 ,从烫伤后第 2天开始 ,大鼠骨骼肌中 2 6S蛋白酶复合体及 19S调节复合体的蛋白酶活性和ATPase活性均明显增加 ,提示烧伤可激活 2 6S蛋白酶复合体系统 ,从而参与骨骼肌蛋白质的降解作用 。