H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白NP的原核表达及抗体制备

目的制备H5N1亚型禽流感病毒NP重组蛋白和抗体,为研制含NP组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法提供检测抗原和抗体。方法以H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)NP基因cDNA克隆质粒pMD-NP为模板,PCR扩增获得NP基因抗原区片段,克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-ΔNP,转化大肠杆菌BL21-CondonPlus(DE3)-RIL,IPTG诱导重组蛋白表达。采用Ni亲和层析方法纯化NP重组蛋白,免疫家兔,收集免疫血清,ELISA测定抗体效价;间接免疫荧光检测所制备抗体与真核细胞表达NP蛋白的反应性。结果与结论成功的制备了高效价兔抗NP抗体,抗体效价在105以上,该抗体能与原核和真核系统中表达的NP蛋白特异性反应,为研制以NP蛋白为抗原组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法奠定了基础。

Dhori病毒核蛋白抗原表位的筛选及鉴定

目的研究鉴定DHOV核蛋白(NP)的最小线性B细胞表位(BCEs),为DHOV的疫苗研制和预防奠定基础。方法本研究针对DHOV-GRT169毒株NP蛋白进行生物信息学分析,采用改良生物合成肽法鉴定其BCEs。首先将DHOV NP蛋白截短为4个片段并鉴定其抗原性,将阳性片段继续截短成相互重叠8个氨基酸的16肽,将16肽序列分别克隆至原核表达载体pXXGST-3中表达,兔抗融合蛋白NP蛋白多克隆抗体作为一抗,用Western blotting检测16肽的抗原性,将检测出的阳性16肽都截短成相互重叠7个氨基酸的8肽,用同样的方法诱导表达及检测。最后用生物信息学方法分析每个BCEs在NP蛋白三维结构中的位置。结果从NP蛋白中最终鉴定出9个BCEs,分别为Enp1(^(3)NPTPKR^(8))、Enp2(^(7)KRAEPGD^(13))、Enp3(^(83)YUFFFL^(88))、Enp4(^(111)NQTLTDE^(117))、Enp5(^(224)QSQKAMLK^(231))、Enp6(^(227)KAMLKQIF^(234))、Enp7(^(418)LNAEFEEY^(425))、Enp8(^(421)EFEEYSKL^(428))、Enp9(^(432)GTGAFYER^(439)),均位于NP蛋白表面。结论这些鉴定的表位将提高对DHOV表位分布和致病机制的认识,为DHOV多表位检测抗原的开发提供基础,也可为DHOV感染与免疫机制研究提供理论依据。

甲型流感病毒NP及相关宿主因子研究进展

甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)严重威胁人类健康。病毒核心是核糖核蛋白复合物(viral ribonucleoprotein complexes,vRNPs),是病毒基因组转录和复制的最小功能单位。核蛋白(nucleoprotein,NP)是vRNP的重要组成部分之一,在流感病毒整个生命周期起着关键作用。机体存在多种宿主因子通过NP影响病毒增殖。本文就通过NP影响vRNP核输入、病毒基因组转录和复制、vRNP核输出以及vRNP组装这几个方面的宿主因子进行综述,以期为治疗IAV新靶点的发现及新药物的研发提供参考。

发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白特异结合宿主细胞60kD SSA/Ro

为了初步探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核蛋白(nucleoprotein,NP)对宿主细胞免疫功能的影响。将SFTSV NP和NSs蛋白的编码基因插入真核表达载体VR1012中,通过免疫共沉淀(IP)、SDS-PAGE、质谱检测及蛋白质免疫印迹等方法寻找宿主细胞中与NP相互作用,同时又与免疫功能有关的蛋白质分子,并利用细胞免疫荧光方法检测SFTSV NP与该分子在细胞中的共定位情况。IP和质谱检测结果显示NP能与免疫功能相关的60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,细胞免疫荧光试验进一步显示NP与60kD SSA/Ro蛋白在细胞质中存在共定位。提示SFTSV可能通过其核蛋白与免疫相关分子60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,从而引起机体一系列的免疫反应和临床症状。

与流感病毒NP互作的宿主靶点及栀子环烯醚萜苷抗流感病毒的机制

目的:探索与流感病毒核蛋白(NP)相互作用的宿主因子,研究其对流感病毒复制的影响,以及栀子环烯醚萜苷(IGE)抑制流感病毒的作用机制。方法:利用酵母双杂交系统筛选与流感病毒NP相互作用的宿主因子;通过免疫共沉淀实验对异质核糖核蛋白(HNRNPD)、氨基葡萄糖6磷酸脱氨酶1(GNPDA1)、Poly/rC结合因子1(PCBP1)、激活信号转导和转录激活因子(STAT)蛋白1抑制因子(PIAS1)进行验证;通过双荧光素酶实验比较PIAS1和HNRNPD对流感病毒复制的影响,并检测在转染核糖核蛋白体复合物(RNP)及PIAS1敲低的情况下,给予栀子环烯醚萜苷对流感病毒复制的影响。将ICR小鼠随机分为正常组、模型组、达菲组和IGE高、中、低剂量组,每组10只。除正常组外各组滴鼻感染甲型流感病毒FM1株建立病毒性肺炎模型。IGE高、中、低剂量组分别给予50、25、12.5 mg∙kg^(-1)IGE灌胃,达菲组给予27.5 mg∙kg^(-1)达菲灌胃,正常组和模型组灌服等体积蒸馏水,连续4 d。实验结束后,蛋白免疫印迹法检测肺组织中PIAS1、NP、磷酸化(p)-STAT3、STAT3、p-STAT1、STAT1的蛋白表达。结果:在酵母双杂交实验中,发现了16个流感病毒NP的潜在互作宿主靶点;免疫共沉淀实验发现HNRNPD和PIAS1可以与流感病毒NP相互作用;双荧光素酶报告实验中PIAS1敲低和过表达都可明显影响IAV RNP活性(P<0.05,P<0.01),HNRNPD对IAV RNP的影响差异无统计学意义;IGE高、低剂量组均可使流感病毒复制减少(P<0.05),并可逆转PIAS1敲低导致的流感病毒复制增加(P<0.05,P<0.01)。IGE各剂量组不同程度地降低感染小鼠肺组织PIAS1、NP、p-STAT3、p-STAT1、STAT1的表达量(P<0.05,P<0.01)。结论:PIAS1和流感病毒NP相互作用,并能够抑制流感病毒的复制,栀子环烯醚萜苷可能通过PIAS1/STAT1通路抑制IAV RNP的活性,从而发挥抗病毒作用。

甲型流感病毒NP含量ELISA检测方法的建立

目的：建立一种双抗体夹心ELISA检测方法,以检测流感疫苗中甲型流感病毒的核蛋白（NP）含量。方法：体外重组表达NP作为ELISA法测定蛋白含量参考品,筛选捕获抗体和检测抗体工作浓度、起始浓度和系列稀释倍数,建立ELISA法并对其进行优化和验证。结果：获得的重组NP纯度为99.0%以上。建立和优化后的ELISA参数：捕获抗体4μg·m L^-1,检测抗体1∶1 000。NP含量参考品起始浓度为300~600 ng·m L^-1,四参数拟合S型曲线的决定系数R^2大于0.95,对疫苗中的甲型流感病毒NP具有特异性,原液和成品的加标回收率为88.2%~95.3%,方法重复性（n=5）的RSD小于15%。结论：建立的流感疫苗中甲型流感病毒NP含量ELISA检测方法特异性好,准确性和精密性高,可用于疫苗样品中甲型流感病毒NP含量的检测。

抗发热伴血小板减少综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备和功能分析

为制备抗发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV）结构蛋白的单克隆抗体,本研究用灭活纯化的SFTSV病毒颗粒免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得分别分泌抗糖蛋白单抗和核蛋白单抗的杂交瘤细胞株。用免疫荧光法和免疫沉淀方法对制备的单克隆抗体的抗原特异性进行鉴定,并初步进行单抗效价、中和活性及亲和力等功能分析。结果显示,通过细胞融合和克隆化,共筛选出13株稳定分泌抗糖蛋白（Glycoprotein,GP）单抗和7株稳定分泌抗核蛋白（Nucleoprotein,NP）单抗的杂交瘤细胞株。免疫荧光和免疫沉淀鉴定显示获得的单抗有良好的抗原特异性。抗GP单抗中6株针对Gn,7株针对Gc,大部分的间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）滴度在1 280-20 480之间,其中4株抗Gn单抗具有中和活性。获得的7株抗NP单抗均与NP特异性结合,IFA滴度范围在5 120-20 480,均无中和活性。此外,经非竞争ELISA检测的两株抗GP单抗（1C8和1G8）均有较高亲和力。本研究为SFTS诊断方法的发展及SFTSV致病机制研究奠定了基础。

甲型流感病毒NP和M2的特性及其在疫苗研制中的应用

甲型流感病毒核蛋白(NP)为该病毒内部的单体结构蛋白,基质蛋白2(M2)是该病毒囊膜上具有非糖基化跨膜结构的离子通道蛋白,二者均具有高度保守的氨基酸序列并对流感病毒复制及适应宿主起着重要作用。由于传统甲型流感疫苗具有诸多缺点,越来越多的学者选取该病毒的保守序列研制新型通用疫苗。本文主要论述了NP和M2的特性以及相关通用疫苗的研究成果。

磷酸化修饰动态调控流感病毒复制

磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式,调控蛋白质的活性、稳定性、细胞内定位和蛋白质互作等功能.在真核细胞中,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是最常见的磷酸化位点.在流感病毒复制的生命周期中,病毒蛋白可被宿主激酶磷酸化修饰,并调节其核质穿梭、信号转导等功能,从而调控病毒的生长、复制和致病力.本文就近年来关于流感病毒内部核蛋白、基质蛋白1、非结构蛋白1的磷酸化修饰位点和其生物学功能进行综述,为深入了解流感病毒复制周期及抗病毒药物研发提供理论基础.