基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

靶向冠状病毒核衣壳蛋白NTD-RNA位点的小分子抑制剂虚拟筛选

核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein,N蛋白)是冠状病毒(CoVs)家族保守的结构蛋白,其N端结构域(NTD)与病毒RNA结合形成核糖核蛋白复合物(RNP),参与病毒复制与组装,已被认定为重要的抗冠状病毒药物靶点。以NTD-RNA结合位点为靶点,针对小分子片段库,开展基于计算机辅助药物设计方法的N蛋白抑制剂虚拟筛选。方法:建立基于受体结构的药效团模型,利用特征元素和测试集分子匹配程度选择最优模型,并运用基于受体和基于配体的方法以检验模型的可靠性。对小分子片段库进行基于Lipinski五规则、药效团模型和分子对接的虚拟筛选,筛选出可以干扰NTD与RNA结合的潜在N蛋白抑制剂。结果最佳药效团模型包含两个疏水特征和两个氢键受体,并筛选出药效团模型匹配值高、对接得分值排序靠前且结构新颖的2个化合物。结论:所筛选出的2个化合物可作为潜在的抑制剂以用于后续研究。

猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白的研究进展

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原,PEDV可导致猪的急性腹泻、脱水甚至死亡。PEDV最早在1971年被报道,如今,它已成为引起仔猪腹泻的最常见病原体之一,对我国养猪行业造成极大的经济损失。核衣壳(N)蛋白是PEDV主要的结构蛋白质之一。本文对PEDV N蛋白的核定位信号、生理功能、与宿主细胞互作和检测方法四个方面的研究进展综述,以期能对N蛋白的了解更够更加深入,并为PED防控提供参考作用。

猪圆环病毒3型核衣壳蛋白多肽抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

旨在建立检测猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)血清抗体的间接ELISA方法以及摸清广西地区PCV3的流行情况。试验以PCV3的核衣壳蛋白多肽作为包被抗原,通过对包被抗原的最佳工作浓度、血清稀释度、封闭剂、酶标抗体工作浓度及作用时间、底物反应时间,阴性和阳性判断标准,敏感性、特异性及重复性等进行研究,建立了检测PCV3间接ELISA方法。随后,应用建立的方法检测2021—2023年广西地区采集的912份猪血清中PCV3抗体存在的情况。抗原最佳包被量为1.25μg/孔、血清稀释度为1∶800、封闭剂为5%的脱脂奶粉、酶标抗体工作浓度为1∶10000、二抗作用时间为60 min、底物反应时间为15 min。阴性和阳性判断标准OD_(450)≥0.55,为阳性;OD_(450)≤0.48,为阴性;当0.48<OD_(450)<0.55时,为疑似阳性,需对疑似样品再次检测。该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和伪狂犬病(PRV)等病毒抗体无交叉反应。批内与批间重复性试验的变异系数分别低于5%与8%,说明基于PCV3核衣壳蛋白多肽建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、特异性及重复性,检测方法稳定可靠。利用所建立的方法进行血清学调查时发现,广西地区PCV3抗体阳性率达到36.62%,说明广西地区猪群中PCV3的感染率较高,应引起重视。

猫冠状病毒核衣壳蛋白的可溶性表达与多克隆抗体反应性鉴定

为制备猫冠状病毒(feline coronavirus, FCoV)核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白的特异性抗体,本研究将Ⅰ型FCoV(ZJU1709)的N蛋白基因全长c DNA亚克隆到pCold TF原核表达载体上,通过低温诱导表达、镍柱亲和纯化获得可溶性重组N蛋白;进一步以纯化的重组N蛋白为免疫原制备兔多克隆抗血清(多抗血清),再通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting, WB)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)等多种方法对兔多抗血清进行反应性鉴定。结果显示:经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)和低温诱导,成功表达出分子量约为100 kDa的可溶性重组N蛋白,在非变性条件下亲和纯化获得的重组N蛋白质量浓度达到1.4 mg/mL;N蛋白兔多抗血清的ELISA效价可达1×10^(6),与真核表达的重组蛋白Flag-N以及FCoV感染细胞中的N蛋白均具有良好的WB和IFA反应性。交叉反应性结果显示:该多克隆抗体能与α属冠状病毒中不同亚型的FCoV以及犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的N蛋白发生反应,但不与β属冠状病毒中的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2, SARS-CoV-2)和γ属冠状病毒中的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)的N蛋白发生反应。综上所述,以pCold TF原核系统表达的可溶性重组N蛋白具有良好的免疫原性,以该蛋白制备的FCoV N蛋白兔多抗血清能识别多种来自不同物种的α属冠状病毒N蛋白,但与β、γ属冠状病毒N蛋白没有交叉反应性,这为进一步研究FCoV复制机制以及开发高效的抗原和抗体检测技术奠定了基础。

针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备和鉴定

目的研制SARS-CoV-2的N蛋白单克隆抗体,并对其特异性识别真核表达N蛋白等特性进行鉴定,为下一步应用奠定材料基础。方法利用大肠杆菌表达并纯化SARS-CoV-2重组N蛋白,制备并筛选分泌N蛋白特异性单克隆抗体的阳性B细胞杂交瘤,制备腹水后利用间接ELISA法测定单抗的效价、亚型和亲和力;通过Western blot、间接免疫荧光试验分析其与原核、真核表达SARS-CoV-2重组N蛋白的特异性结合能力;通过间接ELISA法评价其在不同冠状病毒N蛋白检测中的应用潜力。结果成功地表达和纯化SARS-CoV-2重组N蛋白,筛选获得1株特异性识别重组N蛋白的单克隆抗体并命名为11F4,其亚型为IgG1,腹水效价为2.0×10^(7)以上,亲和力为4.44×10^(8)M^(-1);Western Blot分析表明其能与SARS-CoV-2重组N蛋白特异性反应,间接免疫荧光试验显示其能特异性识别HEK-293T细胞表达的SARS-CoV-2 N蛋白,表明该蛋白免疫反应性良好;间接ELISA法结果表明其可特异性识别真核细胞表达的SARS-CoV-2 N蛋白,而与MERS-CoV和HCoV-229E的N蛋白无交叉反应。结论成功获得可特异性识别细胞表达及体外制备的SARS-CoV-2 N蛋白的单克隆抗体,具备特异性检测SARS-CoV-2的潜能,为下一步研究提供了重要生物材料。

番茄环纹斑点病毒核衣壳蛋白N的RT-LAMP检测方法的建立

番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)属正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus),严重影响番茄、辣椒等作物的产量及经济价值。本研究根据TZSV的核衣壳蛋白N的基因序列设计逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)反应引物,建立了TZSV的RT-LAMP检测方法。结果显示,该方法能够特异扩增TZSV,与侵染辣椒的番茄斑萎病毒和烟草花叶病毒不发生反应;RNA最低检测限为0.01 pg/μL,灵敏度为普通逆转录PCR(RT-PCR)的10倍;田间样品检测应用结果表明,RT-LAMP扩增和可视化检测结果与RT-PCR一致。综上,本研究建立的RT-LAMP快速检测方法可有效应用于TZSV的田间检测。

SARS-CoV-2核衣壳蛋白的生物信息学分析、纯化及多克隆抗体制备

目的分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳(N)蛋白的生物学性质、纯化及多克隆抗体制备。方法NCBI检索感染人的冠状病毒N蛋白氨基酸序列,采用Clustal Omega软件对其进行序列比对。利用SOPMA软件预测SARS-CoV-2 N蛋白的二级结构;应用Pondr和IUPred软件预测SARS-CoV-2 N蛋白的固有无序结构域;运用MoRFchib软件预测SARS-CoV-2 N蛋白的分子识别特征序列;利用IEDB网络分析其B细胞表位。纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠血清,制备多克隆抗体;ELISA法测定血清中多克隆抗体滴度;MTT法检测N蛋白刺激小鼠脾细胞增殖情况。结果SARS-CoV-2 N蛋白与SARS-CoV N蛋白的同源性高于97%。N蛋白二级结构的无规卷曲占55.13%,α螺旋占21.24%,β折叠占16.71%,β转角占6.92%。N蛋白含有大量固有无序样结构,具有4个分子识别特征序列和11个线性B细胞表位。全长为51.5 kDa N蛋白可诱导BALB/c小鼠分泌高滴度抗体,并能导致淋巴细胞增殖。结论SARS-CoV-2 N蛋白含有大量固有无序结构域并获得了高滴度多克隆抗体。

SARS病毒核衣壳蛋白、膜蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化

通过反转录 PCR获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白 (N)和膜蛋白 (M)基因 ,其序列分析结果与加拿大多伦多株完全一致。将M基因和N基因克隆到大肠杆菌表达载体pET2 2b和pBV2 2 2上 ,并在大肠杆菌中以包涵体及可溶形式获得高效表达。通过离子交换、金属螯合层析纯化获得电泳纯制品。所获得的核衣壳蛋白具有良好的抗原性 。

犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析

根据GenBank中A75/14株犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因,将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHT,用重组质粒pPROEXTMHT-N转化感受态E.coliDH5a细胞,用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白,占菌体总蛋白18%。经Westernblot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性,将表达产物用ProBondTM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应,经琼扩试验测定其效价为1∶16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原,建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。

我国西藏小反刍兽疫病毒China／Tib／Gej／07-30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析

首次对我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的核衣壳蛋白(N)基因和基因组启动子(GP)区进行序列测定和分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应从发病山羊病料中扩增出小反刍兽疫病毒N基因片段,用cDNA3′末端快速扩增方法获得基因组启动子区片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统发生树。我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的N基因由1689个核苷酸组成,编码525个氨基酸,与India/Jhansi/03等6个已知N基因全序列的PPRV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.7～97.6和94.9～98.5。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30N蛋白与磷蛋白作用的结构序列之一为495LFRLQAM501保守序列,N蛋白281-289位氨基酸含有一个T细胞表位,为281YPALGLHEF289保守序列。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的GP区由107个核苷酸组成,与Tur-key2000等5株其他PPRV毒株同源性为91.8～98.2。N基因核苷酸序列和相应的氨基酸序列系统进化分析表明小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30与亚洲国家分离株关系最近。

施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

本研究旨在表达施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)的核衣壳蛋白(N),进而制备其多克隆抗体。以SBV(BH80株)的RNA为模板,RT-PCR扩增N基因序列,并将其克隆至原核表达载体pET-28a-c(+)中,获得pET-28a-SBV-N重组质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达HisSBV-N融合蛋白。在非变性条件下用Ni-NTA柱纯化His-SBV-N,并以此为抗原免疫新西兰大白兔制备多抗。经免疫亲和层析纯化后,利用Western blot和间接免疫荧光对多抗进行鉴定。结果表明:(1)His-SBV-N融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中同时以可溶性和包涵体2种形式表达,相对分子质量约为30ku;(2)制备的多抗效价高达1∶64 000。该多抗不仅能与His-SBV-N融合蛋白发生特异性反应,而且还能识别SBV的不同毒株,但与布尼亚病毒科内亲缘关系最近的沙门达病毒(Shamonda virus)、道格拉斯病毒(Douglas virus)和赤羽病病毒(Akabane virus)的核衣壳蛋白存在交叉反应。His-SBV-N融合蛋白及其多抗的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立奠定了物质基础。

鸭病毒性肠炎病毒基因文库的构建及其核衣壳蛋白基因的发现、克隆与鉴定

提取鸭病毒性肠炎病毒（DEV）基因组DNA,超声波处理使其片段化,经补平末端后,分级分离并收集各部分DNA片段,与质粒pBluescript Ⅱ SK（＋）连接,转化大肠杆菌DH5α,成功构建了DEV基因文库.随机选取文库中的重组质粒测序分析,DNA序列拼接后获得大于100bp以上ORF共187个,将其中一个含完整ORF的DNA片段,以BLASTX软件与Genbank上相应基因进行比对分析,初步确定为一种核衣壳蛋白基因.根据该基因片段序列,设计引物对DEV DNA进行PCR扩增,并克隆到pGEM-T载体上,转化宿主菌JM109,提取阳性重组质粒,经PCR检测、酶切鉴定、测序和生物信息学分析,确定该基因片段为DEV核衣壳蛋白基因.

赤羽病病毒核衣壳蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原,建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,初步组装成便于现地使用的试剂盒。经对试验条件进行优化,确定最佳抗原包被量为每孔1μg(100μL),样品稀释度为1∶100,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶8 000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用初步研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验法分别对云南省的89份、内蒙古的100份牛血清样本进行了检测,以中和试验为参照,经统计学处理,得出检测临界值分别为0.411和0.303,2种方法的符合率分别为72.7%(56/77)和91.4%(85/93)。试剂盒在37℃保存3 d,对敏感性无明显影响。

PRRS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的高效表达

用表达非融合蛋白的原核表达载体 p BV2 2 0 ,通过 PCR技术的引物设计对猪繁殖与呼吸综合征( PRRS)病毒 BJ-4株核衣壳蛋白 ( N)基因起始密码子上游进行了改造和修饰 ,成功地构建了含有 PRRS病毒 N基因的原核重组表达载体 p BV-N。 p BV-N转化大肠杆菌 DH5α,温度诱导后菌体裂解物经 SDS-PAGE分析发现 ,在约 1 5 0 0 0处出现 1条诱导前后的 p BV2 2 0载体对照和诱导前的 p BV-N中均缺少的特异性的蛋白条带 ,分子量大小与 PRRS病毒 N蛋白相符 ,并随着诱导时间的延长而变化 ,在诱导后 4 h达到高峰。薄层扫描结果显示 ,重组 N蛋白表达量最多可占菌体总蛋白的 2 7.4 %。 Western-blotting检测 ,此 1 5 0 0 0的蛋白带可为 PRRS病毒 N蛋白的单克隆抗体所识别 ,表明该重组

鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白的原核表达

根据已发表的鹅圆环病毒GoCV-yk1株的序列,设计引物扩增出全长核衣壳蛋白基因(Cap),用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达,经SDS-PAGE电泳检测未见到目的蛋白条带。应用生物信息学分析确定Cap蛋白的核定位信号区域,新设计一对引物扩增出不包含核定位信号序列编码区的核衣壳蛋白基因,将截短Cap基因克隆入pET-28a进行融合表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot检测,截短Cap蛋白获得了高效表达,融合蛋白的分子量约为27.6ku,表达产物以包涵体形式存在,其表达量可以达菌体总蛋白的18.3%。截短Cap蛋白的高效表达为鹅圆环病毒ELISA检测方法的建立和进一步开展GoCV致病性及其免疫机制的探索奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

本研究是利用我国PRRS病毒分离株CH-1a株浓缩的病毒抗原免疫BAL B/c小鼠,经3次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,同时以PRRS病毒作为抗原进行间接ELISA检测,共筛选到22个阳性细胞株。分别经过3轮单克隆后,最终得到了16株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用IDEXX-ELISA检测试剂盒和IFA试验对16株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的16株细胞分泌的抗体都是针对PRRSV的特异性抗体。将此16株单克隆抗体分别与用原核系统表达的PRRSV N蛋白r、tM和rtGP5蛋白进行特异性ELISA检测试验,结果表明16株单克隆抗体都仅识别表达的N蛋白,而与其它两种蛋白不发生反应,说明所获得的16株单克隆抗体均为抗PRRSV核衣壳蛋白的。单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示,除01MAb为IgG2b、N1H11为IgG2a外,其余的单克隆抗体均为IgG1,而且所有单克隆抗体的轻链均为κ链。至此证实我们获得了16株PRRV N蛋白单克隆抗体,这将为今后建立更为灵敏的检测PRRS病原的特异性诊断方法、分析PRRSV核衣壳蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位奠定重要基础。

施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其特性分析

目的制备施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(mAb)并分析其特性。方法将SBV N基因分别构建至pET-28a-c(+)和pMAL-c5X载体中,在大肠杆菌中诱导表达带组氨酸标签的融合蛋白His-SBV-N和带麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的融合蛋白MBP-SBV-N,分别用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)树脂和直链淀粉树脂纯化两种蛋白;用纯化的His-SBVN免疫BALB/c小鼠制备mAb,以MBP-SBV-N为包被抗原间接ELISA筛选分泌mAb的杂交瘤细胞和测定mAb效价,利用蛋白G琼脂糖凝胶从腹水中纯化mAb;应用Western blot和间接免疫荧光分析mAb的反应性和特异性。结果筛选并纯化出1株抗SBV的mAb(命名为1F2),效价为1∶32 000,重链亚型为IgG2α,轻链为κ;1F2既能与重组SBV N蛋白发生反应,又能识别SBV,但与布尼亚病毒科内亲缘关系较近的沙门达病毒、道格拉斯病毒和赤羽病病毒的N蛋白存在交叉反应,而与裂谷热病毒N蛋白无交叉反应。结论成功制备了抗SBV核衣壳蛋白的mAb,为SBV的血清学检测提供了工具。

抗犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组犬瘟热病毒（CDV）N蛋白免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A4C6C12和A5B8H7间接ELISA检测腹水效价分别为1：106、1：105;亚类鉴定结果分别为IgG2a、IgG2b,轻链均为K型;Western blot和ELISA分析结果显示2株单克隆抗体均能与重组N蛋白和CDV发生反应,而与犬细小病毒及犬腺病毒等无交叉反应;ELISA叠加试验的增值结果表明两株单克隆抗体识别的抗原位点不同.特异性抗CDV-rN的单克隆抗体的获得,为进一步用于临床诊断研究奠定了基础.

番茄斑萎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与分析

从云南表现褪绿黄化症状的番茄上分离到番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)YN-1株系,利用RT-PCR方法克隆了该株系的核衣壳蛋白基因,并测定了该基因的序列,全长为777 bp,编码258个氨基酸。对该基因的氨基酸序列分析结果表明,YN-1 N基因与韩国3个株系的氨基酸序列相似性均高达97%。