基于磁性层状双氢氧化物和核酸外切酶Ⅰ的新型大肠杆菌荧光传感器构建

目的基于磁性层状双氢氧化物(magnetic layered double hydroxide,MLDH)对修饰在单链和双链DNA上的羧基荧光素(6-car-boxyfluorescein,FAM)的高效淬灭,以及核酸外切酶Ⅰ(exonucleaseⅠ,ExoⅠ)对单链DNA的选择性降解作用,建立测定大肠杆菌的荧光传感器。方法将不同浓度的大肠杆菌特征DNA与FAM标记的互补DNA探针杂交,形成FAM-双链DNA,加入Exo I选择性降解剩余探针,再加入MLDH吸附并淬灭FAM-双链DNA。通过磁铁分离上清液与MLDH,测量上清液的荧光强度。结果在最优实验条件下,本法检测大肠杆菌特征DNA的线性范围为0.05~30nmol/L,相关系数(R^(2))为0.997,检测限(3σ)为0.025nmol/L,对江水、自来水和茶饮料中大肠杆菌DNA的回收率为85.4%~118%,相对标准偏差小于5%。结论利用MLDH的荧光淬灭能力和Exo I对单链DNA的选择性水解能力成功构建了测定大肠杆菌的新型荧光传感器,与传统大肠杆菌检测法相比,所建新型传感器灵敏度高、选择性好、准确度高,能实现对大肠杆菌的快速检测。

基于核酸外切酶Exo I的DNA折纸结构纯化方法

基于核酸外切酶(Exo I)选择性降解单链DNA的性质,为增加DNA折纸结构纯化方法的多样性,开发了一种快速除去剩余DNA单链、纯化DNA折纸结构的新方法。以三角形和矩形DNA折纸结构为研究对象,对缓冲液环境、酶用量、反应温度、反应时间等实验条件进行了优化,采用琼脂糖凝胶电泳方法与原子力显微技术对产物进行分析与表征。结果表明,该方法可以达到快速除去DNA单链、纯化DNA折纸结构的目的,Exo I酶处理不影响DNA折纸结构的完整性及后续的应用开发。

基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测

设计合成了一种长臂发夹型核酸探针,结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法。当不存在靶DNA时, SYBR Green Ⅰ荧光染料能够嵌入发夹型探针的茎部而发出很强的荧光,而当存在靶DNA并与发夹型探针杂交后,核酸外切酶Ⅲ从杂交产物的3’端开始水解发夹型探针,释放出靶DNA,并触发下一个酶水解反应,同时SYBR Green Ⅰ染料也随发夹型探针水解而释放,导致荧光信号降低,从而实现了对DNA的免标记荧光信号放大高灵敏检测。该方法的检出限低至320 fmol/L,比传统双标的分子信标的方法降低了4~5个数量级,且该方法还具有免标记、简单、快速的特点。

基于核酸外切酶Ⅰ的适配体荧光传感器检测人尿液中的Hg^(2+)

基于富含胸腺嘧啶(T)DNA适配体对Hg^(2+)的特异性识别和核酸外切酶I(ExoⅠ)辅助的信号转换策略,建立了快速检测人尿液中Hg^(2+)的荧光分析方法。固定在微孔板上的DNA适配体特异识别Hg^(2+)后,折叠成稳定的发卡型双链结构,不能被单链特异性的ExoⅠ水解,核酸染料SYBR Green I(SG)插入发卡部位产生荧光信号,基于此可实现Hg^(2+)的定量检测。优化后的最佳实验条件为:微孔板包被亲和素浓度为50 mg/L;检测DNA包被浓度为75 nmol/L;使用5"SG以及1.2μL的ExoⅠ。在最佳实验条件下,体系荧光强度与Hg^(2+)浓度的对数呈良好线性关系,线性范围为2~500 nmol/L,检出限为1.5 nmol/L(3σ)。利用本方法检测尿样中的Hg^(2+),加标回收率为91.2%~95.0%,相对标准偏差(n=5)为2.1%~4.6%。本方法选择性良好,操作简单,用HNO_3-KMnO_4溶液将尿液中其它形式的汞氧化为Hg^(2+)后,成功实现了尿液中总汞含量的检测。

基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光猝灭性质的核酸检测方法

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与Mo S_2纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法。首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2)。由于两条探针核酸具有3'粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,因而被吸附于Mo S_2纳米片而猝灭其荧光。当目标DNA存在时,会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应,并将探针核酸降解成大量的不能吸附于Mo S_2纳米片表面的荧光碎片。在优化条件下,目标DNA浓度在0.5~6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系,检出限为0.28 pmol/L。与单重信号放大技术相比,本方法极大改善了分析灵敏度和检出限,且具有良好的单碱基错配区分能力。

基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测

基于G-四链体/血红素DNA酶的高催化活性以及λ核酸外切酶（λexo）的辅助放大功能,以17个碱基的DNA片段作为模型分析物,构建了一种快速、灵敏、特异性好的新型Luminol-H2O2-G-四链体/血红素DNA酶化学发光传感体系。考察了λexo用量、Luminol浓度、H2O2浓度、溶液p H值对体系化学发光强度的影响。在最佳实验条件下,即：p H=9.0,10 unitsλexo,1.0×10^-3mol/L Luminol,3.0×10^-2mol/L H2O2,测得DNA在2.0×10^-12~8.0×10^-9mol/L的浓度范围内与Luminol的相对化学发光强度之间呈现良好的线性关系,检出限（3σ）为0.7×10^-13mol/L。本方法可以区分不同错配的核酸序列,并可用于复杂生物样品的分析。

基于核酸外切酶Ⅲ辅助双循环等温信号放大的高灵敏Hg^(2+)传感方法研究

设计了一种Hg^(2+)触发的核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助的双发夹探针双循环等温信号放大策略,在此基础上发展了一种免标记、超灵敏的Hg^(2+)生物传感器。在Hg^(2+)存在情况下,发夹探针1的3'游离序列与汞离子识别探针通过T-Hg^(2+)-T配位结合形成双链DNA平末端,核酸外切酶ExoⅢ能识别双链DNA平末端并沿3'-5'方向催化水解茎部序列。释放的Hg^(2+)和识别探针进入新一轮反应循环(循环1);释放的发夹探针1未降解序列包含Ⅰ区序列和G-四链体形成序列,其中,Ⅰ区序列与发夹探针2的3'游离序列(Ⅰ~*区序列)完全互补,引发了ExoⅢ参与的双链DNA平末端水解,释放的Ⅰ区序列进入新一轮反应循环(循环2)。循环1和2为自发循环过程,经过多次循环可以产生大量单链的G-四链体序列。体系中加入氯化血红素,与G-四链体结合形成G-四链体-血红素-DNA酶,催化ABTS-H_2O_2反应体系显色。考察了多种因素对检测体系的影响,在最优实验条件下,此方法对Hg^(2+)的线性检测范围为0.3～50 pmol/L,检出限为0.25 pmol/L(S/N=3),回归方程为ΔA_(420 nm)=0.117+0.004C_(Hg^(2+))(pmol/L)。当水样中存在大量其它金属离子时,传感器对Hg^(2+)仍然具有较高的选择性。将此方法应用于环境水体中Hg^(2+)含量检测,加标回收率为96.0%～106.0%。本方法操作简单、选择性好、灵敏度高、有较强的抗干扰性能,可用于环境水样中Hg^(2+)的高灵敏检测。

基于二硫化钨和核酸外切酶Ⅲ的荧光法高灵敏检测血液中汞离子

目的:将信号放大策略用于荧光法实现血液中低浓度汞离子的检测。方法:将汞离子加入到富含胸腺嘧啶且3’端荧光标记的单链DNA溶液中,汞离子介导该特异序列形成分子内的双链结构,且该双链DNA具有3’凹端,因此能够被核酸外切酶Ⅲ水解并释放出荧光标记的单核苷酸,当加入二硫化钨(WS_2)后,荧光标记的单核苷酸不能被二硫化钨吸附从而荧光信号明显增加。对WS_2和ExoⅢ的量进行优化考察,对方法的线性、检测限、特异性等性能进行验证。3个不同浓度汞离子在血浆样品中的加样回收率也进行验证。结果:汞离子在1～30 nmol·L^(-1)和30～250 nmol·L^(-1)范围内线性关系良好,r分别为0.993 6和0.995 2,检测限为0.1 nmol·L^(-1),加样回收率分别为110.0%,116.0%,90.9%,RSD分别为16.5%,18.7%,17.8%(n=6)。结论:建立的荧光法可以实现血液中低含量汞离子的检测,为临床上检测汞离子提供一种新方法。

基于石墨烯猝灭及核酸外切酶辅助循环放大适体传感器检测ATP

基于核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）辅助分析物循环放大原理,结合石墨烯（G）的超高荧光猝灭能力,以三磷酸腺苷（ATP）作为模型分析物,构建了一种新型的荧光探针,实现了ATP的高灵敏检测。两条DNA链各包含一部分ATP适体序列,其中1条DNA链的3＇端修饰有荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC）。当模型分析物不存在时,两条DNA链通过非共价π-π堆积作用吸附在G表面,导致FITC的荧光猝灭。当目标物ATP存在时,两条DNA链与目标物ATP进行特异性结合,形成一双链夹心结构,随后加入ExoⅢ,由于ExoⅢ可对该双链夹心结构的3＇凹陷末端进行逐步水解,释放出目标物ATP和游离的FITC。释放出的目标物ATP可继续进入下一循环,不断产生游离FITC,游离FITC将脱离G表面,从而导致体系的荧光恢复,并且恢复的荧光强度与ATP浓度在0.02~1μmol/L范围内存在良好的线性关系,检出限（S/N=3）为9 nmol/L。

核酸外切酶-压电石英DNA传感器检测金黄色葡萄球菌的实验研究

目的构建一种用于检测金黄色葡萄球菌的核酸外切酶-压电石英DNA传感器新方法,同时对其重要影响因素进行探讨。方法采用λ核酸外切酶处理金黄色葡萄球菌PCR产物,EB染色、电泳后于紫外灯下进行观察,对杂交温度、杂交时间和杂交响应性能等因素进行实验研究,进一步将构建的核酸外切酶-压电石英DNA传感器法用于金黄色葡萄球菌检测,并对其灵敏度和特异性进行研究。结果λ核酸外切酶-压电石英DNA传感器法最适杂交温度为35℃,最适杂交时间为60min,响应性能显著大于普通压电DNA传感器(P<0.01),可以检测到1.0×104CFU/ml的金黄色葡萄球菌,特异性好。结论利用核酸外切酶-压电石英DNA传感器检测金黄色葡萄球菌,具有杂交效率高、技术难度低、频率响应性能高等优点,有较好的应用前景。

核酸外切酶Ⅲ消化双链DNA的缺失测定

测定了 ＥＸＯ Ⅲ在单位时间内所消化双链 ＤＮＡ的碱基对数，即缺失测定．

基于核酸外切酶Ⅲ降解原理荧光检测乙肝病毒HBV

利用核酸外切酶Ⅲ降解杂交的DNA链,将荧光素修饰的DNA探针释放到溶液中,通过测定溶液的荧光强度来测定乙肝病毒(HBV)的浓度。考察了缓冲溶液的种类、pH值、反应时间等对反应体系荧光强度的影响,确定了最佳反应条件:最佳缓冲溶液为TT缓冲溶液(pH8.0,250 mmol.L-1Tris-HCl,体积分数0.1%Tween 20),缓冲溶液的最佳pH值为9.0,生物素与亲和素最佳结合时间为25 min,DNA的最佳杂交时间为20 min,酶反应最佳时间为1.1 h。在最佳反应条件下,随着HBV浓度的增加,体系的荧光强度明显增强。该方法测定HBV的线性范围为0.5～5.0 pmol.L-1,检测限为0.335 pmol.L-1。

利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修饰引物克隆长片段基因的研究

目的采用不依赖连接反应的克隆法,利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修饰引物克隆Notch2长片段基因。方法将难以扩增的Notch2 c DNA的编码序列(7416 bp)人为分成3段,引物设计时对此3个片段和载体骨架的引物进行碱基硫代磷酸化修饰,用这些引物扩增Notch2的3个片段和载体骨架。然后用T7核酸外切酶分别处理PCR产物,产生4个具有3'互补突出末端的片段,并将此4个末端突出的片段退火复性,完成Notch2基因克隆。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示Notch2 3个片段和载体骨架的PCR产物大小与预期大小相符,经退火复性获得的克隆通过PCR、酶切和测序进行克隆鉴定,确定Notch2编码序列已经插入到pc DNA3.0-3*Flag载体中。结论利用T7核酸外切酶和引物的碱基磷酸化修饰进行的不依赖连接反应的克隆方法能够用于长片段基因的克隆。

核酸外切酶辅助的信号放大策略在生化分析中的应用进展

作为工具酶重要成员之一的核酸外切酶是一类无严格碱基序列依赖性的水解酶。近年来,通过利用核酸外切酶水解方式的差异性与纳米技术、酶切循环效应、核酸适配体技术、金属离子稳定的非沃森-克里克碱基配对系统、核酸荧光染料探针技术、电化学方法等相结合,发展了一系列核酸外切酶辅助的信号放大技术,对于提高生化分析检测方法与技术的灵敏度起到了非常关键的作用,已广泛应用于核酸、蛋白质、离子和小分子等物质的高灵敏检测。为了更好地理解和应用核酸外切酶辅助的信号放大策略,本文对核酸外切酶发展的信号放大策略在生化分析中的应用进展进行了综述。

基于核酸外切酶Ⅰ催化的核酸降解反应构建乳腺癌细胞电化学传感器

基于核酸外切酶I选择性消化单链核酸的特点,使用MCF-7细胞表面过量表达的肿瘤标志蛋白MUC1的适体,构建了一种灵敏检测乳腺癌细胞的新型电化学传感器。核酸适体链与乳腺癌细胞MCF-7表面过量表达的肿瘤标志蛋白MUC1的结合会阻碍其与互补核酸探针链的杂交,所以电极表面固定的未杂交的核酸探针单链就会被外切酶I选择性消化从而失去末端的亚甲基蓝信号分子。因此,通过检测电化学信号的变化,此传感器在103~106 cell/mL细胞浓度范围内线性检测乳腺癌细胞MCF-7,检出限为330 cell/mL,具有高度特异性,可以有效区分对照细胞胰岛β细胞。

基于二氧化锰纳米片和核酸外切酶Ⅰ构建荧光适配体传感器检测氯霉素

为创建食品中氯霉素的新型快速检测方法,以二氧化锰纳米片淬灭适配体的荧光,核酸外切酶I酶切放大荧光信号,构建了检测氯霉素的适配体传感器。结果表明:在适配体浓度50nmol/L,二氧化锰质量浓度0.05mg/mL,核酸外切酶用量0.4U/μL,酶切时间50min的最佳荧光检测条件下,线性范围为0.1~80.0nmol/L,检出限为0.08nmol/L。构建的检测方法具有操作简单,检测灵敏度高的优点,并实现了在食品样品中的准确检测。

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大的比率型荧光传感器检测致病菌基因

食源性致病菌严重威胁着公众健康。本研究基于荧光共振能量转移原理,以Cy3和Cy5作为荧光供体和受体基团,利用核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)增强检测信号,构建了比率型荧光传感器,用于高灵敏度检测致病菌基因。分别标记有Cy3的R1-DNA和标记Cy5的R2-DNA形成双链R1/R2,在Cy3的激发光波长激发下,由于发生荧光共振能量转移,Cy3的荧光被猝灭而产生Cy5的荧光信号。致病菌靶基因(大肠杆菌Lac Z基因)的存在可将R1/R2双链解旋,使得Cy3远离Cy5,导致Cy3的荧光恢复而Cy5的荧光信号降低。在ExoⅢ作用下,Cy3与Cy5的信号变化进一步增大。在优化的实验条件下,荧光信号变化与靶基因在10~2000 pmol/L浓度范围内呈现良好的线性关系,检出限为5.29 pmol/L。所采用的比率型信号检测策略极大地降低了假阴性、假阳性检测结果的产生,增强了检测特异性。

棉花核酸外切酶基因GhWRN的克隆及功能验证

【目的】本研究旨在探索棉花GhWRN基因在生长发育中的功能。【方法】用生物信息学方法分析GhWRN基因的结构特征、进化关系及上游1500 bp的启动子片段并对其功能进行初步分析,利用实时荧光定量-聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术分析该基因在不同熟性棉花品种、不同组织及不同激素处理下的表达特性。构建过表达载体转化拟南芥,观察转基因拟南芥的表型。利用qRT-PCR分析拟南芥开花信号途径中标记基因的表达变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到GhWRN基因,生物信息学分析表明该基因编码产物含有1个保守的WRN-exo结构域,无内含子,不具有跨膜结构,为非分泌蛋白。qRT-PCR表明该基因在早熟棉花品种的二叶期开始上调表达,在植株各组织中均有表达,在雄蕊和苞片表达量较高;外源激素ABA、IAA处理后0.5 h该基因极显著上调表达。与野生型相比转基因拟南芥开花时间提前,莲座叶数量减少,qRT-PCR分析表明花发育相关关键基因AtSOC1、AtFT和AtFUL上调表达。【结论】GhWRN基因与促进植物开花相关,为进一步探究棉花的开花机制提供新线索。

微流控阵列芯片上植物单细胞内3′核酸外切酶的荧光成像检测

制备了高活性的拟南芥原生质体。通过在微流控芯片上设计适合原生质体尺寸的微孔阵列和微通道流路,实现了拟南芥原生质体的在线纯化和单细胞阵列捕获,其捕获效率达到40%。利用电穿孔技术将能特异性检测3′核酸外切酶的核酸探针导入原生质体,实现了单个原生质体内3′核酸外切酶的成像。该研究为开展单细胞内多种核酸酶的高通量原位检测,以及相关调控过程的研究提供了重要的方法学手段。

DNA末端构型调控RecJ核酸外切酶活性

目的核酸酶介导的DNA双链末端切割对同源重组修复至关重要。然而,DNA末端构型对RecJ 5’-3’核酸外切酶活性的调控尚不清楚。本研究旨在探究DNA3’端和5’端构型对RecJ核酸外切酶活性的影响及其机制。方法为探究DNA3’端构型对RecJ核酸外切酶活性的影响,使用含有Mg;的体系,对具有不同3’突出末端长度(9 nt与18 nt)和3’突出末端修饰(磷酸化和硫代磷酸酯修饰)的单链DNA分别进行RecJ核酸酶活性检测。为揭示DNA 3’端构型对RecJ外切酶活性的调控机制,在Mg;缺失的体系中,使RecJ与底物结合后进行凝胶迁移实验(EMSA)。为探索其他调控因子与DNA3’端构型对RecJ的协同作用,分别检测5’端磷酸化修饰和单链DNA结合蛋白(SSB)对DNA3’突出末端修饰的影响。结果DNA3’端构型包括突出末端的长度和修饰(磷酸化和硫代磷酸酯修饰)均会抑制RecJ外切酶活性。DNA 3’端磷酸化和硫代磷酸酯修饰通过重塑RecJ-DNA的结合模式抑制RecJ外切酶活性。DNA 5’端磷酸化修饰可增强RecJ对具有不同3’端修饰底物的核酸外切酶活性,并改变RecJ-DNA的结合模式。此外,SSB通过增强RecJ-DNA结合可部分克服DNA3’端修饰介导的抑制作用。结论DNA3’与5’端构型协同调控RecJ核酸外切酶的活性。