新根瘤菌属模式菌株全基因组序列比较分析

新根瘤菌属(Neorhizobium)隶属于根瘤菌科(Rhizobiaceae),目前有效发布了8个种。为了探究该属下不同模式菌株的全基因组分子机理和遗传特征,本文采用Prodigal等软件对这8个模式菌株的全基因组序列进行基因预测、功能注释和系统发育分析,并在此基础上进行了基因组比较分析。基因组预测结果显示,这8个模式菌株的CDS(Coding Sequences)数量为4471~6669个,GC含量在60.0%至61.6%之间,rRNA数量为3至9个,tRNA数量为43至51个。通过比较基因组分析发现,所有菌株共享的直系同源基因簇有2563个,独立拥有的基因簇数量少。通过平均核苷酸一致性(ANI)、数字DNA-DNA杂交(dDDH)和系统发育树的分析,发现菌株CCBAU 05176^(T)和菌株T17_20^(T)具有最高的同源性,而菌株T786^(T)和NTR19^(T)的遗传距离最远。COG(Cluster of Orthologous Groups of Proteins)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分类的比较分析显示,注释的基因功能整体差异较小,但在SL-1T中,异种生物的生物降解和代谢的注释比例和数量明显高于其他模式菌株。本研究为新根瘤菌属的系统分类以及在生态系统中的应用奠定了理论基础。

Tn5-Mob系统诱导根瘤菌属之间耐盐和共生性状的转移

本实验通过质粒pSUP5011及其辅助质粒RP4将Tn5-Mob随机插入苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti 042B)的基因组中,得到86株接合子SR。随机选取4株SR,通过辅助质粒R68.45的三亲本杂交,将它们的DNA片段引入慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium,japonicum USDA 110),获得106株接合子BSR。大部分BSR菌株获得了生长快速的特性和耐盐性,一般能耐0.3—0.5mol/L NaCl,其中有些菌株能产生黑色素。将90株BSR回接大豆和苜蓿植株,发现47株能在大豆和苜蓿植株结瘤,但在苜蓿上无固氮活性;26株只能在大豆植株结瘤固氮;13株只能在苜蓿植株结瘤而不固氮;4株在大豆和苜蓿植株均不结瘤。其中,获得了4株耐盐性和固氮酶活性强的接合子。

根瘤菌属生物学特性的研究

作者对不同类型根瘤菌的生物学特性进行了较为系统地研究，结果表明：所有测试菌株的３－酮基乳糖反应，明胶液化，纤维素水解，柠檬酸盐利用，淀粉水解及酪蛋白水解均呈阴性；蛋白胨肉汤中唯有苜蓿根瘤菌和快生型大豆根瘤菌能生长；石蕊牛奶反应中所有慢生型菌株均产碱，不产血清环，快生型菌株产酸，具血清环，唯独苜蓿根瘤菌产碱；快生型菌株能利用１４种以上不同碳源，而慢生型菌株仅能利用７～９种碳源．

根瘤菌属胞外多糖的研究

本文研究了豌豆根瘤菌(Rhizobum Leguminosarum),苜蓿根瘤菌(R. meliloti),三叶草根瘤菌(R. trifolii),菜豆根瘤菌(R. phaseoli),豇豆根瘤菌(Rradyrhizobium sp.(Vigna))和大豆根瘤菌(R. Japonicum)产生的胞外多糖化学组分的差异,结果表明,不同种的根瘤菌能产生具有不同组分的胞外多糖,其多糖组分的差异主要表现在糖醛酸和甘露糖的含量。豌豆根瘤菌、三叶草根瘤菌,菜豆根瘤菌产生的胞外多糖含有糖醛酸,大豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌产生的胞外多糖一般不含有糖醛酸。根瘤菌有快生型和慢生型之别,这种差异也可由其产生的胞外多糖组分看到,一般快生型根瘤菌:豌豆根瘤菌,苜蓿根瘤菌,菜豆根瘤菌,三叶草根瘤菌,(包括最近证明的快生型大豆根瘤菌)的胞外多糖中甘露糖所占百分比较低(低于20％),葡萄糖所占的百分比较高(高于60％),而慢生型根瘤菌:大豆根瘤菌和豇豆根瘤菌的胞外多糖中甘露糖所占百分比较高(高于36％),葡萄糖所占的百分比较低(低于50％)。

慢生根瘤菌属结瘤基因的进化及遗传分析

根瘤菌中存在一系列控制固氮结瘤因子(lipo-chito-oligosaccharides)合成的结瘤基因(nodulationgenes)。其中,nodA基因是合成结瘤因子所必需的,该基因负责酰基转移酶的合成,能将不饱和脂肪酸转移到结瘤因子寡聚糖骨架上;基因nodZ,nolL和noeI为宿主专一性结瘤基因,分别转录合成岩藻糖基转移酶,岩藻糖乙酰化酶和岩藻糖甲基化酶。通过GenBank调取慢生根瘤菌属及其他根瘤菌属的结瘤基因nodA,nodZ,nolL和noeI,构建系统发育树,进行进化和遗传分析。结果表明,慢生根瘤菌属各个菌株的nodA,nodZ,nolL和noeI具有很高的相关性,但是与根据保守基因16SrDNA和dnaK分类情况不完全相符。这表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的,同时可能为适应宿主及环境条件,结瘤基因有少量的平行转移。结果表明,慢生根瘤菌属各个菌株的nodA,nodZ,nolL和noeI具有很高的同源性,同时发现基于保守基因16SrDNA和dnaK对慢生根瘤菌的分类情况与慢生根瘤菌属各菌株在nodA,nodZ,nolL和noeI具有较高同源性的事实不完全相符。这表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的,同时可能为适应宿主及环境条件,结瘤基因有少量的平行转移。

根瘤菌N_1对扁藻生长影响的研究

研究了由海藻培养体系中分离获得的10株细菌对扁藻生长影响。试验结果表明,菌株N1对自然带菌扁藻及除菌扁藻的生长均有明显的促进作用;经16SrDNA分析表明,菌株N1为根瘤菌属细菌。

泌尿系统放射根瘤菌感染一例

目的提高对放射根瘤菌泌尿系统感染的认识,以提高诊治水平。方法对泌尿系统放射根瘤菌感染1例的临床资料进行回顾性分析。结果本例为58岁男性,因发热4 d、发热加重伴寒战1 d入院。查尿白细胞(+++);血尿素11.9 mmol/L,肌酐126.0μmol/L,胱抑素C 1.65 mg/L。尿培养有放射根瘤菌生长,菌落计数>105CFU/ml,行药物敏感试验后予头孢他啶治疗,患者病情好转出院。结论临床收治泌尿系统感染者需警惕放射根瘤菌等少见菌引起的感染,及时完善病原学培养及药物敏感试验,根据药敏结果合理用药。

根瘤菌-豆科植物共生固氮的分子生物学

本综述着重讨论根瘤菌及其豆科植物宿主在共生固氮作用中的几个重要问题。根瘤菌和豆科植物在根瘤发育过程中的相互作用。根瘤菌在根瘤的植物细胞中分化成类菌体,使空气中的 N_2还原成 NH_4^+用作宿主植物的营养来源。文中还介绍了几种适用于根瘤菌基因操作以进行共生固氮研究的分子遗传学技术。

正阳县花生根瘤菌遗传多样性及其共生特性研究

从河南省正阳县土壤中捕捉67株根瘤菌,根据IGS-RFLP结果分成9个基因内间隔区(intergenic spacer,IGS)类型,通过16S rRNA基因序列系统发育分析鉴定菌株为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),并依据持家基因多位点序列分析(multilocus sequence analysis,MLSA)结果将其分成7个簇(Clusters)。其中,Clusters 1被鉴定为广东慢生根瘤菌(B.guangdongense),Clusters 2、3、4、5和6分别被鉴定为慢生根瘤菌属的疑似新种群B.genospeciesⅡ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。选取11个代表菌株,结瘤基因nodA序列与广东慢生根瘤菌CCBAU 51649T和广州慢生根瘤菌(B.guangzhouense)CCBAU 51670T聚为相同分支,宿主均为花生。所有代表菌株均能与花生植株共生结瘤,且叶绿素含量、地上部干质量和地下部干质量、株高度、根长度与对照相比均有显著提升,其中接种ZB30的处理组的地上部干质量是对照组的2.7倍。

快生型和慢生型根瘤菌对双糖的吸收和水解

慢生型根瘤菌对双糖类代谢中缺乏吸收系统和分解代谢酶。在快生型根瘤菌的双糖类代谢中,存在吸收系统和分解代谢酶。如Rhizobium Leguinosarum Wu163和Wu235以及R.Trifolii Wu290,对蔗糖和麦芽糖的吸收表现为固有的特性,而在R.meliloti Wu60和在豇豆根瘤菌NGR234中对这些双糖的吸收是诱导的。事实表明在快生型根瘤菌中,最少有两个独特的吸收系统。一个运输蔗糖、麦芽糖,另一个运输乳糖。因受迭氮化合物影响,双糖的吸收是通过主动作用途径进行的。用硝基苯酚。

含aFGF基因的植物表达载体的构建及其对根瘤农杆菌的转化

目的:构建携带人类酸性成纤维细胞生长因子基因(haFGF)的植物表达载体,并将其转化进根瘤农杆菌中。方法:采取目的基因改造及载体构建的方法,以期构建高效表达载体。首先,采用植物偏好的密码子重新合成全长的haFGF,其次引入对目的基因表达有一定促进作用的表达调控元件:Ω序列、Kozak序列及KEDL内质网定位序列;将构建的携带haFGF的表达载体,利用冻融法将目的基因转化进根瘤农杆菌中;将构建的基因载体进行PCR鉴定、酶切分析及DNA测序鉴定。结果:DNA测序结果表明重新设计合成的基因与预期结果一致,PCR和酶切鉴定结果证实了haFGF植物表达载体构建和转化成功。结论:获得了携带haFGF的根瘤农杆菌菌株,为日后转基因植物工作奠定了一定的基础。

一株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离鉴定及脱氮活性研究

从杭州市天子生活岭垃圾填埋垃圾渗滤液调节池周围土壤样品中分离到一株异养硝化-好氧反硝化细菌ZB612,通过形态学观察及16S r DNA同源性分析,初步鉴定属于根瘤菌属(Rhizobium sp.).随后研究了该菌株的脱氮能力,结果表明在初始氨氮浓度为100mg/L异养硝化培养基中,氨氮的去除效率达到90%,未出现明显的硝态氮和亚硝态氮积累,具有同步硝化反硝化特征;在亚硝酸盐反硝化体系中,亚硝态氮的去除效率达到60%.除此还考察了四种单因素(温度、p H值、碳氮比和碳源种类)分别对菌株ZB612脱氮效率的影响:该菌株的最佳脱氮条件为温度30oC,初始p H=7,C/N=8,以葡萄糖作为最适碳源.

氯氰菊酯降解菌CY22-7的分离鉴定及降解特性研究

从采集的多种土壤样品中,获得了19株在3种筛选平板上均生长良好的候选氯氰菊酯降解菌。通过生理生化特性鉴定和16SrDNA序列的测定及比对,将其中的氯氰菊酯降解菌CY22-7鉴定为中华根瘤菌属(Sinorhizobiumsp.)。同时,对氯氰菊酯降解菌CY22-7的降解特性研究结果表明:(1)氯氰菊酯降解菌CY22-7以5%(体积分数)的接种量接种到氯氰菊酯起始质量浓度为100mg/L的氯氰菊酯乙醇培养基后,于200r/min、30℃摇床中培养。经过6d的培养,氯氰菊酯降解菌CY22-7降解了约60%的氯氰菊酯。(2)加入外源营养物质有利于促进氯氰菊酯的降解。其中,葡萄糖和酵母提取物的促进作用最为明显。(3)氯氰菊酯降解菌CY22-7降解氯氰菊酯的最适温度为30℃,最佳pH为6.0。

人白介素-12植物表达载体的构建

目的构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI,SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过三亲杂交法将表达载体pBI121-hIL-12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101,用PCR法进行鉴定.结果双酶切及DNA序列测定证实hIL-12已插入到表达载体pBI121中,PCR扩增表明构建的重组表达载体pBI121-hIL-12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论成功构建了植物表达载体pBI121-hIL-12,为进一步利用转基因植物生产hIL-12奠定了实验基础.

放射根瘤菌感染六例临床特点分析

目的探讨放射根瘤菌感染患者的临床症状及体征，为预防与治疗放射根瘤菌感染提供依据。方法回顾性分析2008年5月至2009年7月福建医科大学附属第二医院收治的6例血培养放射根瘤菌阳性患者的临床症状及实验室检测结果，并结合相关文献进行复习。结果6例患者中男4例，女2例，年龄5—88岁。6例均发热，伴畏寒、寒战或疲乏感；血常规均示白细胞增高和（或）中性粒细胞比例升高。肺部感染5例，均有轻度咳嗽、咳痰，肺部可闻及湿性啰音，X线胸片或胸部CT可见斑片状阴影；另1例感染部位不明。6例均存在免疫受损的基础疾病包括恶性肿瘤、系统性红斑狼疮、肺结核、先天性心脏病、巨幼细胞性贫血及低白蛋白血症，5例有土壤密切接触史，4例曾应用广谱抗生素或免疫抑制剂。6株放射根瘤菌对第三代头孢菌素、头霉素类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、四环素及呋喃妥因均敏感，对青霉素类及青霉素类／β-内酰胺酶抑制剂复合物、第一代及第四代头孢菌素、单环类均耐药，对氨基糖苷类大部分药物敏感。6例患者均未出现继发性脏器损害，根据药敏结果用药后均好转出院。结论放射根瘤菌感染常见于有高危因素的患者，临床表现无特异性；放射根瘤菌对大多数抗菌药物敏感；经治疗后患者预后良好。

可得然胶生产菌种的筛选及发酵条件优化

采用苯胺蓝平板筛选法从土壤中筛选并鉴定了一株产可得然胶的根瘤菌,并对该菌株发酵合成可得然胶的培养基进行优化。在单因素优化的基础上,设计4因素3水平的正交优化方案,优化结果显示,该菌株发酵产可得然胶的最优培养基组成为:葡萄糖50 g/L,(NH4)2HPO42g/L,KH2PO41.5 g/L,Mg SO41.25 g/L,Fe SO4·7H2O 0.05 g/L,Mn SO40.02 g/L,Co Cl2·6H2O 0.01 g/L,Zn Cl20.01 g/L。经摇瓶发酵验证,可得然胶的产量和糖转化率较优化前分别提高了29.2%和5.4%,为进一步利用该根瘤菌发酵合成可得然胶奠定了良好基础。

如何科学搞好豆角栽培

豆角也叫豇豆，其习性和栽培技术和四季豆相似。豆角的生长特点虽然有根瘤菌能固氮。但它们是以嫩荚及嫩豆粒为收获物的，所以氮素供应不可少，尤其是前期。氮：磷：钾=1：0．6：1．3。微量元素钼能促进根瘤旺盛发育，豆类对硼、锌等微量元素也很敏感，所以在合理施N、P、K肥的基础上，喷施硼肥、钼肥及锌肥，对提高豆类的结荚率，促进籽粒饱满和提高产量有一定的作用。下面谈谈豆角的高产栽培技术。因根系有根瘤菌属好气性，这也是菜豆能耐短期土壤干旱，耐湿性差的原因之一。

农业上的应用

生物防治 901055 球形芽孢杆菌xylE基因标记质粒的构建[会,英]/Taylor, L. D.…∥Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol.-1989,89 Meet.-204[译自DBA,1989,8(17),89-10207] 球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)产生有价值的晶体毒素作为生防因子。在这些有机物可以被释放到环境中之前,经过改良的球形芽孢杆菌菌系的构成必须满足许多必要条件。构建了用于球形芽孢杆菌的一系列具有非抗生素抗性标记的质粒。