桥尾蛋白磷酸化参与大鼠螺旋神经节神经元GABA_(A)受体内化

目的探讨桥尾蛋白(gephyrin)丝氨酸S270位点磷酸化在水杨酸钠(sodium salicylate,SS)介导的GABA_(A)受体(GABA type A receptors,GABA_(A)Rs)内化的作用。方法将12只SD大鼠分成4组,分别为SS处理组、LiCl处理组、SS+LiCl处理组和对照组,每组3只,急性分离各组耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons,SGNs),SGNs原代培养48 h后分别用5 mM SS、1 mM LiCl、5 mM SS联合1 mM LiCl处理1 h,对照组不予处理;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测GABA_(A)Rsα2亚基、桥尾蛋白基因表达的改变;采用Western blot技术检测各组GABA_(A)Rsα2膜蛋白和总蛋白表达的改变、桥尾蛋白及其S270位点磷酸化的改变。结果RT-qPCR结果显示,各组GABA_(A)Rsα2亚基mRNA、桥尾蛋白mRNA与对照组比较均无明显变化(P>0.05),Western blot结果显示,SS处理组GABA_(A)Rsα2亚基膜蛋白(0.08±0.02)较对照组(0.18±0.04)表达显著下调(P<0.01),LiCl处理组(0.14±0.03)有效逆转SS诱导的GABA_(A)Rsα2亚基膜蛋白下调(SS组为0.08±0.02)(P<0.05),LiCL组膜蛋白、各组总蛋白与对照组比较无明显变化(P>0.05);SS处理组桥尾蛋白S270磷酸化(0.84±0.02)较对照组(0.35±0.14)显著增强(P<0.001)。LiCl处理组(0.66±0.10)有效逆转SS诱导的桥尾蛋白S270磷酸化增强(SS组为0.84±0.02,P<0.05),LiCl处理组桥尾蛋白磷酸化、各处理组桥尾蛋白与对照组比较无明显变化。结论桥尾蛋白S270位点磷酸化可增强参与SS诱导的SGNs GABA_(A)Rs内化。

微管抑制及尾桥蛋白磷酸化促进骨肉瘤细胞U2OS微核形成

目的探讨微管及微管相关蛋白尾桥蛋白在肿瘤细胞微核形成中的作用。方法利用DAPI染色检测不同类型细胞自发微核率;利用诺考达唑(nocodazole)抑制微管聚集后,DAPI染色和胞质分裂阻滞(cytokinesis-block,CB)微核实验观察人骨肉瘤细胞株U2OS中微核形成情况;免疫荧光多重染色检测诺考达唑处理不同时间对U2OS细胞中微管及尾桥蛋白的影响;在U2OS细胞中过表达尾桥蛋白或利用collybistin使尾桥蛋白磷酸化,再利用免疫荧光及DAPI染色检测其对微管及微核形成的影响。结果相对于人胚肾HEK293细胞和原代神经细胞,U2OS自发微核率更高;诺考达唑处理使U2OS细胞微核数量增加,且与释放时间相关;诺考达唑处理使尾桥蛋白分布改变,逐渐聚集于细胞核;U2OS细胞中磷酸化尾桥蛋白主要表达于分裂期细胞;过表达尾桥蛋白和(或)增加其磷酸化水平并不影响U2OS细胞中微管蛋白的表达,但过表达尾桥蛋白并增加其磷酸化水平可使微核数量增多。结论肿瘤细胞内微核形成与微管聚集能力关系密切,可形成于细胞周期不同时期,具有积累效应。尾桥蛋白磷酸化后细胞中微核数量增多,提示其可能参与调节肿瘤细胞微核形成。

桥尾蛋白的结构、功能及其与神经系统疾病关系的研究进展

桥尾蛋白(gephyrin)是第一个被发现的抑制性突触后膜骨架蛋白,也是中枢神经系统抑制性突触的突触后蛋白网络的重要组成部分。近年研究表明,桥尾蛋白在抑制性突触形成、稳定抑制性突触后膜受体、调节突触可塑性方面具有重要作用,桥尾蛋白异常可能与钼辅因子(MoCo)缺乏症、阿尔茨海默病(AD)、癫痫等神经系统疾病有关。本文综述了桥尾蛋白的结构、功能及其与神经系统疾病的关系,以期为早期预防、干预甚至治愈相关神经系统疾病提供参考。

抑郁小鼠模型脑突触体中突触蛋白表达的变化

目的：研究抑郁症发病过程中突触蛋白表达的变化。方法：小鼠随机分为对照组和造模组，使用社会失败模型对造模组小鼠造模，之后将其分为对抑郁症敏感组及对抑郁症不敏感组。将以上3组小鼠分别断头取前额叶皮层、海马、纹状体并提取突触小体，通过免疫印迹检测突触小体内突触后致密蛋白95（PSD-95）、桥尾蛋白（gephyrin）及突触蛋白1（synapsin-1）蛋白表达的变化。结果：与对照组相比，在前额叶皮层，对抑郁症敏感组及对抑郁症不敏感组小鼠的PSD-95水平下降，而对抑郁症敏感组小鼠的synapsin-1表达增多；在海马，对抑郁症敏感组及对抑郁症不敏感组小鼠的PSD-95水平下降；在纹状体，对抑郁症不敏感的小鼠gephyrin、synapsin-1蛋白表达显著增加。结论：在抑郁症发病中突触体内兴奋性及抑制性蛋白发生了变化，这些可能与突触功能的紊乱相关。

自噬对孤独症大鼠海马组织兴奋性、抑制性突触相关蛋白表达的影响及机制

目的探讨自噬对孤独症大鼠海马组织兴奋性、抑制性突触相关蛋白表达的影响及机制。方法取繁殖期Wistar雌鼠20只、雄鼠10只合笼过夜,于雌鼠受精后第12. 5天,将10只孕鼠腹腔注射丙戊酸(VPA),其后代鼠标记为VPA干预组;另取5只孕鼠腹腔注射同等剂量生理盐水,其后代鼠标记为对照组。在VPA干预组后代鼠出生后第35天,随机取30只分为模型组、自噬抑制组[3-甲基腺嘌呤(3-MA)组]和自噬增强组(Rap组),每组各10只,分别腹腔注射生理盐水、3-MA 5 mg/kg和雷帕霉素5 mg/kg;对照组10只腹腔注射同等剂量的生理盐水。后代鼠出生后第42天时,采用自梳理实验评价刻板重复行为,采用三箱实验评价各组社交能力;然后处死各组大鼠,取海马组织,采用Western blotting法及免疫组化法检测海马组织突触素(Syn)、兴奋性突触[突触后致密蛋白95(PSD-95)]和抑制性突触[桥尾蛋白(Gephyrin)]的表达。比较各组PSD-95/Gephyrin比值变化。结果 (1)自梳理实验及三箱实验示,与对照组相比,模型组出现刻板重复行为和社交能力障碍,Rap组上述行为改善,3-MA组上述行为加重(P均<0. 05)。(2)Western blotting及免疫组化示,与对照组相比,模型组海马Syn、PSD-95蛋白表达均上调,Gephyrin蛋白表达下调(P均<0. 05);与模型组相比,3-MA组Syn、PSD-95蛋白表达均上调,Gephyrin蛋白表达下调(P均<0. 05);与模型组相比,Rap组Syn、PSD-95蛋白表达均下调,Gephyrin蛋白表达水平上调(P均<0. 05)。(3)与对照组相比,模型组PSD-95/Gephyrin比值上调;与模型组相比,3-MA组PSD-95/Gephyrin比值上调,Rap组PSD-95/Gephyrin比值下调(P均<0. 05)。结论孤独症大鼠存在海马组织兴奋性/抑制性突触失衡,增强自噬可恢复兴奋性/抑制性突触失衡,从而改善孤独症症状。

电针调控Wnt信号改善帕金森病模型小鼠纹状体抑制性突触变性的研究

目的:观察电针对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的帕金森病(Parkinson's disease,PD)模型小鼠纹状体抑制性突触前标志物囊泡γ-氨基丁酸转运蛋白(vesicular GABA transporter,vGAT)、突触后标志物桥尾蛋白(Gephyrin)以及树突棘密度和无翅型MMTV整合位点家族成员5a(wingless-type MMTV integration site family member 5a,Wnt5a)表达的影响,探讨电针改善PD运动功能的部分作用机制。方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、电针组、左旋多巴组,每组10只;除空白组外,MPTP腹腔注射复刻PD小鼠模型。造模成功后第一天对电针组小鼠开始针刺“合谷”“太冲”穴,同日左旋多巴组小鼠腹腔注射左旋多巴注射液,各组小鼠干预2个疗程后采用爬杆及悬挂实验评估各组小鼠运动功能;苏木素伊红染色观察纹状体神经元细胞形态;免疫荧光标记纹状体抑制性突触前标志物vGAT和突触后标志物Gephyrin表达;Western Blot检测纹状体Wnt5a蛋白的表达。结果:与模型组相比,电针组及左旋多巴组小鼠爬杆耗时缩短(P<0.05),悬挂评分升高(P<0.05)。模型组小鼠神经元细胞稀疏,残留的多巴胺神经元萎缩,胞核皱缩偏移,水肿空泡变性增多;而电针组及左旋多巴组小鼠神经元细胞形态圆润,水肿变性细胞减少,形态清晰。各组小鼠纹状体抑制性突触前标志物vGAT表达无明显差异(P>0.05)。与模型组相比,纹状体神经元树突棘密度增加(P<0.05),电针组及左旋多巴组小鼠纹状体突触后标志物Gephyrin的阳性表达升高(P<0.05),Wnt5a蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:早期对帕金森病模型小鼠进行电针干预可改善其运动功能障碍,其治疗机制可能是电针激活Wnt5a信号进而调控抑制性突触,改善纹状体GABA能神经元功能。

小鼠海马NONO基因沉默对焦虑样行为的影响

目的:探索小鼠海马区不含POU结构的八聚核苷酸结合蛋白(NONO)基因沉默后突触相关基因的表达及行为学变化。方法:构建并包装表达NONO基因靶向shRNA的重组慢病毒(LV-NONO),海马区显微注射重组慢病毒干扰NONO基因的表达,实验小鼠分为对照组(control),对照病毒组(LV-Con)和NONO慢病毒干扰组(LV-NONO)。慢病毒感染5 d检测海马NONO的表达,14 d检测海马γ-氨基丁酸A型受体α2亚基(GABA)和桥尾蛋白(gephyrin)的表达,旷场实验和O迷宫实验检测实验小鼠的行为学变化。结果:LV-NONO组小鼠海马区NONO、GABA和gephyrin的表达显著低于对照组小鼠。旷场实验和O迷宫实验结果显示,LV-NONO组小鼠进入开放臂的次数和中央区(开放臂)停留时间显著低于对照组小鼠。结论:海马区注射NONO干扰病毒抑制NONO基因的表达可以下调GABA和gephyrin的表达,进而增强小鼠焦虑样行为。

PCPA致皮质NG2细胞活动变化及NG2与睡眠-觉醒相关神经元的共存关系和酸枣仁汤的干预作用

目的 观察NG2细胞在大鼠皮质五羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-Ht)下降后的活动变化和NG2与5-Ht、谷氨酸(glutamate,GLU)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能神经元的共存关系,以及酸枣仁汤的干预作用。方法 将60只SD大鼠随机分为正常组、对照组、对氯苯丙氨酸(Para-Chlorophenylalanine,PCPA)组、PCPA+酸枣仁汤组、酸枣仁汤组,正常组不给任何处理;对照组腹腔注射氯化钠溶液;PCPA组和PCPA+酸枣仁汤组按350 mg/kg体质量以10 mL/kg体积腹腔注射PCPA,酸枣仁汤组腹腔注射等体积的氯化钠溶液。均为每天1次,连续注射6 d。第7天开始,正常组不做处理,对照组和PCPA组灌胃氯化钠溶液,酸枣仁汤组和PCPA+酸枣仁汤组按照7.5 g/kg体质量以10 mL/kg体积灌胃酸枣仁汤,每天1次,连续8 d。取材后采用免疫荧光双标法,观察皮质NG2细胞活动变化,分析NG2细胞与5-Ht、Glu、Gaba能神经元的共存关系,以及酸枣仁汤干预前后NG2和5-Ht、Glu、Gaba能神经元标志物的表达变化。结果 PCPA使皮质NG2和囊泡谷氨酸转运蛋白2(vesicular glutamate transporter 2,Vglut2)表达明显升高(P<0.01),色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)和桥尾蛋白(gephyrin)表达下降(P<0.05),差异均有统计学意义;NG2与5-Ht、Glu、Gaba能神经元之间存在着良好的,但程度不同的区域共表达。酸枣仁汤治疗后皮质NG2、Vglut2表达明显下降(P<0.01),Tph、Gephyrin表达明显升高(P<0.01),差异具有显著统计学意义。结论 PCPA可激活皮质NG2细胞,NG2与5-Ht、Glu、Gaba能神经元在大脑皮层存在不同程度共定位;酸枣仁汤能调节NG2和5-Ht、Glu、Gaba能神经元的兴奋性。

突触后稳定结构Collybistin与神经精神疾病的研究进展

神经精神疾病复杂多样,大多数难以治愈,且很多疾病的机制至今不清,找到新的治疗靶点对于治疗疾病极其重要。Collybistin是一种鸟苷二磷酸-鸟苷三磷酸交换因子,具有稳定抑制性突触结构、参与突触可塑性、树突生长等作用,参与多种神经、精神疾病的发生发展过程,可能是治疗神经精神疾病新的靶点,以下将对其展开综述。

孤独症大鼠前额叶皮质突触相关蛋白的表达

目的观察孤独症大鼠突触相关蛋白突触素(SYN)、突触后致密蛋白-95(PSD-95)、桥尾蛋白(gephyrin)在前额叶皮质的表达变化,探讨突触相关蛋白在孤独症发病中的作用。方法采用孕12.5d(E12.5)一次性腹腔注射丙戊酸钠(600mg/kg)的孕鼠所产下的子代鼠作为模型组,同样方法注射同等剂量的生理盐水的孕鼠所产下子代鼠作为正常组。通过斜板实验、睁眼实验、三箱实验验证模型是否成功;Western blotting方法对比生后42天两组大鼠突触相关蛋白SYN、PSD-95、gephyrin在前额叶皮质的表达变化。结果 1)成功建立孤独症动物模型:与正常组比较,模型组大鼠生长发育迟缓;社会交往能力异常、对新鲜事物偏好障碍,差异均有统计学意义(P均<0.05);2)Western blotting结果显示:与正常组比较,孤独症大鼠突触相关蛋白SYN、PSD-95表达显著增多(P<0.05),gephyrin蛋白表达显著减少(P<0.05)。结论孤独症大鼠前额叶皮质突触蛋白表达异常。