应用PAGE梯度电泳技术鉴定西瓜杂交种纯度

应用PAGE梯度电泳技术分析西瓜杂交种苏蜜五号、早抗京欣和抗病苏蜜及其父母本种子的酯酶、过氧化物酶、多酚氧化酶及种子蛋白。结果显示:除早抗京欣发芽5 d时过氧化物酶有一明显谱带特征可以有效区别杂种与亲本外,其他电泳组合谱带虽清晰但无明显差异,表明西瓜遗传基础相对狭窄。蛋白质和同工酶难以发现统一的谱带特征来检测不同西瓜杂交种子的纯度。由于不同杂交种双亲的遗传背景不同,对于亲缘关系相对较远的一些品种可能会出现某些特别的特征以用来鉴别真假杂种。

负压处理梯度电泳凝胶对PCR-DGGE实验结果的影响

目的比较负压处理前后变性梯度凝胶电泳(DGGE)胶凝固时间的变化,验证负压处理是否影响PCR-DGGE实验结果。方法使用两种不同引物扩增的PCR产物,在不同的负压处理前后,分别进行两种上述PCR产物的变性梯度凝胶电泳。结果 1)不同的负压处理对变性胶的凝固时间没有明显的影响;2)不同负压处理前后,对PCRDGGE的实验结果有明显的影响。结论负压处理对PCR-DGGE的实验结果有显著影响。

脲梯度电泳方法的技术关键

介绍在应用丙烯酸胺－脲梯度电泳技术进行蛋白质折叠、去折叠研究工作中的实验步骤和技术关键，并在文献方法的基础上作了改进。通过加入１５％～０％的甘油，抵消在凝胶中由于脲浓度不同而引起的溶液粘度变化，保证在凝胶上脲浓度不同的部位对蛋白质保持同样的电泳阻力，防止前沿偏斜．采用核黄素光照催化合脲凝胶的聚合，以防止凝胶在梯度灌制完成前发生聚合．加浓缩胶和样品梳于脲梯度胶上可较好地克服边缘效应，获得好的样品迁移图谱．

时相温度梯度凝胶电泳在线粒体基因突变检测中的应用

目的 评价时相温度梯度凝胶电泳技术 (TTGE)在肿瘤患者线粒体基因同质性和异质性突变检测中的应用。方法 对117例肿瘤组织和配对正常组织的全线粒体基因进行PCR扩增和TTGE突变筛选分析 ,对TTGE显示在肿瘤和配对正常组织中具有不同类型电泳带型变化的片段进行测序。结果 TTGE在总共 36 5 4片段中发现 16 0个体细胞性线粒体基因突变片段 ,经与直接测序结果比较 ,TTGE检测体细胞性突变的敏感性和特异性分别达 96 2 7%和 94 0 5 %。结论 TTGE是筛选线粒体基因体细胞性同质性突变和各种比例异质性突变的一种敏感方法。

一种脲梯度电泳的简便方法

目的与方法：介绍了一种应用国产ＤＹＹ－Ⅲ小型电泳槽进行脲梯度电泳的方法。结果与结论：该法操作简便，普适性好，能获得好的样品迁移图谱。可用于蛋白质变性／复性的研究及原核基因工程产品复性工艺的探索。

变性梯度凝胶电泳的原理、应用及其进展

变性梯度凝胶电泳 (DGGE)主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异 ,利用变性梯度胶进行分离。恒定变性凝胶电泳 (CDGE)、瞬时温度梯度电泳 (TTGE)和温度梯度凝胶电泳 (TGGE)是由 DGGE经改进而成。

梯度电泳制备肝素寡糖

低分子肝素是通过酶解或化学降解的方法得到分子量较小的普通肝素片断,较普通肝素抗凝血作用小,出血等不良反应发生率低,是一类很有价值的药物。本文采用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳对低分子质量肝素进行纯化,从凝胶中回收肝素寡糖片段,并通过高效凝胶渗透色谱法测定回收样品的相对分子质量。结果制备得到平均M_r约为3019的肝素寡糖。

变性梯度凝胶电泳法研究我国不同土壤氨氧化细菌群落组成及活性

实验选用了我国3种不同土壤研究土壤硝化活性、硝化细菌数量,并使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)的方法研究了不同土壤中氨氧化细菌(AOB)区系变化。通过28d的土壤培养实验研究发现,潮土具有最强的硝化势,几乎100%的铵态氮转化为硝态氮;而红壤中的硝化势最弱,只有4.9%的铵态氮转化为硝态氮。对这3种土壤硝化细菌进行计数发现,3种土壤氨氧化菌数量差异显著,而3种土壤亚硝酸氧化菌(NOB)处于一个数量级。采用氨氧化菌功能基因amoA(氨单加氧酶ammoniamonooxygenase)特异PCR结合DGGE的方法对土壤氨氧化菌区系进行分析。红壤有4个氨氧化菌种属,与潮土和黄泥土没有共同的氨氧化菌种属。4个种属中两个是与潮土和黄泥土亲源性比较远的,特有的氨氧化菌种属,这两个种属与已知的Nitrosospira属的cluster3bz97838和Nitrosospira属的cluster3aAF353263亲源性比较近。潮土有5个氨氧化菌种属,潮土与黄泥土有两个共同的氨氧化菌种属,这两个种属中的一个是潮土和黄泥土特有的,与其他氨氧化菌种属亲源性比较远的氨氧化菌种属,这个种属与已知的Nitrosospira属的cluster3bZ97849亲源性比较近。黄泥土有4个氨氧化菌种属,除了与潮土共有的一个种属是两种土壤特有的氨氧化菌种属外,黄泥土还有一个与其他氨氧化菌种属亲源性比较远的,黄泥土特有的种属,与Nitrosospira属的cluster3aAF353263亲源性很近。3种土壤中分离到的硝化细菌表现出不同的硝化能力。实验结果表明,以amoA基因为目标的PCR-DGGE是比以16SrDNA为目标的PCR-DGGE更有效的研究氨氧化菌种群的方法;3种土壤的氨氧化菌种群差异显著,尤其是红壤的氨氧化菌种群与另外两种土壤差异明显,这种差异可能与红壤的低pH条件对氨氧化菌种群的长期选择有关;3种土壤中的硝化活性与土壤中的硝化细菌数量没有显著相关,可能由于3种土壤差异显著的土壤环境对硝化活性的影响造成。因此在对不同土壤硝化细菌进行研究时不仅需要对硝化细菌数量进行研究,还需要研究不同土壤中硝化细菌的种属及不同土壤环境条件对硝化细菌硝化活性的影响。

变性梯度凝胶电泳在环境微生物研究中的应用详解

结合笔者等多年积累的经验详细介绍环境微生物学研究中变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术应用全步骤:从环境样品中直接提取总DNA,利用5′端含GC夹子的引物PCR 16S rDNA的部分片段,将PCR产物在含有浓度线形递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析,使不同来源的DNA片段在电泳胶中分离,从胶中切出分离的DNA片段测定碱基序列,进行分类分析。PCR-DGGE技术能够检测不可培养的微生物基因,而DGGE技术与克隆等其他技术结合更能发挥其分离作用。

应用变性梯度凝胶电泳和16SrDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究

以取自3头安装有永久性瘤胃瘘管的土种山羊的瘤胃内容物为材料,经过DNA抽提和PCR扩增,扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE,一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌在两种日粮条件下的多样性.同时利用基因序列分析技术,分析了16个在DGGE胶上有匹配带的克隆的16S rDNA序列,并与现有的数据库进行了比较.结果表明,饲喂基础日粮时3头山羊瘤胃内容物的DGGE图谱有一定的相似性(43%～55%);饲料中添加大豆黄酮一定程度上影响了瘤胃细菌的组成,DGGE 谱带变化程度分别为 1 号 36% 、2 号 46% 、3 号 30%。基因序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有5个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于97%,8个基因序列的相似性在90%～96%,余下的低于90%。相似性大于97%的5个克隆中,只有1个被鉴定为Prevotella sp .,其余 4 个都属于未被鉴定的瘤胃细菌。

苹果锈果类病毒的温度梯度凝胶电泳

用温度梯度凝胶电泳技术研究了苹果锈果类病毒(ASSV)的变性行为,并与菊花矮化类病毒(CSV)的变性行为进行了比较。提纯的 ASSV 的温度梯度电泳示出了类病毒特有的从类似于棒状的分子到打开的环状分子的构象转变曲线,与 CSV 及报道的马铃薯纺锤块状类病毒(PSTV)相似。但 ASSV 的构象转变中点温度及转变的协同性均低于 CSV。在8.9mol/LTBE 缓冲液中,ASSV 构象转变的中点温度和半辐值分别为41.5℃和2.4℃,而 CSV 的分别为46.0℃和1.0℃。在 ASSV 的温度梯度凝胶电泳图中,除了有代表单分子构象转变的曲线外,还观察到另一构象转变曲线,作者认为这代表了在提纯过程中由分子间碱基配对形成的双分子复合体的变性曲线。

变性梯度凝胶电泳法研究断奶仔猪粪样细菌区系变化

利用PCR和DGGE技术分析了 1 2头仔猪在断奶后其粪样细菌区系的变化。粪样细菌 1 6SrDNA的V6～V8可变区经PCR扩增 ,扩增产物经DGGE电泳后再进行相似性分析。结果表明 ,仔猪断奶当天粪样DGGE谱带少 ,同窝仔猪间图谱相似。断奶后 ,随着断奶时间的推移 ,每头仔猪的DGGE图谱带逐渐增多 ,变得复杂和多样 ,仔猪个体间DGGE图谱差异逐渐增大。仔猪是否同窝以及所采食日粮类型对DGGE图谱没有明显影响。相似性分析还表明 ,日粮中添加寡果糖的仔猪在断奶后第 1周 ,其粪样微生物区系变化迅速 ,而后缓慢。

变性梯度凝胶电泳方法在内源微生物驱油研究中的应用

应用基于聚合酶链式反应(PCR)的变性梯度凝胶电泳方法(DGGE)分析了在高温、高压和厌氧条件下富集培养的油藏内源微生物16S rDNA。用化学裂解法(SDS)直接提取了油藏微生物基因组DNA,并以此基因组DNA为模板,用特异性引物对16SrDNA的V8和V9可变区进行聚合酶链式反应扩增。对长约400bp(碱基对)的扩增产物进行DGGE分离后,得到了分离较好的电泳图谱。结果表明,DGGE方法可以分离不同油藏微生物16S rDNA的V8和V9可变区的DNA扩增片断。在内源微生物驱油研究中,DGGE方法是在分子水平上分析油藏微生物群落结构和监测微生物群落动态变化的有效工具。

采用变性梯度凝胶电泳技术研究不同形态玉米日粮对鹅肠道微生物区系的影响

本研究旨在研究不同形态玉米日粮对鹅肠道微生物区系的影响。选用7日龄扬州鹅192只,随机分成4组,每组4个重复,每个重复12只,在日粮组成相同的情况下,分别饲喂粉状玉米日粮、粉状玉米-整粒玉米日粮、整粒玉米-粉状玉米日粮、整粒玉米日粮。84日龄时从肠道内容物中提取基因组总DNA,利用细菌通用引物对细菌16S rDNA的V3区进行PCR扩增,扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)后进行图谱分析。结果表明,整粒玉米日粮可以导致空肠细菌种类的下降和回肠细菌种类的增加,对十二指肠和盲肠微生物区系影响不明显。研究表明,玉米日粮形态能够影响鹅肠道菌群分布,其中,对空肠和回肠影响较大,对直肠的影响次之,对十二指肠和盲肠影响较小。

肠道菌群多样性变性梯度凝胶电泳分析法的建立

采用珠磨法、冻融研磨法和酶法对粪便细菌进行裂解,提取粪便细菌DNA,并采用16SrRNAV3区引物(P3GCf、P2r)和V6V8区引物(U968GCf、L1401r)扩增细菌16SrRNA基因可变区,对变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法用于肠道菌群多样性分析的各种条件进行了优化,建立了分析人和动物粪便菌群多样性的DGGE方法。2对引物的粪便DGGE结果都表明,珠磨法和冻融研磨法对细菌的裂解效果优于酶法;P3GCf、P2r引物的条带数明显多于U968GCf、L1401r引物;珠磨法PCRDGGE对普通拟杆菌、青春双歧杆菌和粪肠球菌的检测限分别为(6.4±0.1)×102、(6.1±0.7)×103和(7.2±0.2)×105个细菌,珠磨法对这3种细菌的检测限均低于酶法。结果表明,珠磨法和P3GCf、P2r引物更适宜用于粪便菌群多样性DGGE分析。

专一性PCR和变性梯度胶电泳协助从焦化废水处理装置中分离优势功能菌Thauera属菌株

【目的】在专一性PCR和变性梯度胶电泳(DGGE)的协助下,从废水处理装置的微生物群落中分离较难分离的功能菌Thauera。【方法和结果】本研究首先使用Thauera特异性PCR-DGGE的方法鉴定了焦化废水处理装置反硝化池生物膜中的Thauera在6种培养基、好氧/厌氧条件下的生长情况。挑选Thauera多样性较高的培养基1/10 NB与MMQ在好氧条件下进行分离培养。然后使用Thauera特异性PCR方法确定分离得到的菌落是否呈阳性,并使用DGGE的方法检验其是否为纯菌。使用不同培养基对含有Thauera的混合菌落进行进一步纯化,DGGE检测发现MMP培养基对混合细菌菌落Q20中的Thauera有明显的富集作用。经过Thauera特异性PCR结合DGGE检测对Thauera属细菌进行追踪,将混合菌落在MMP培养基上多次划线,最终分离得到纯菌。通过这种方法,从反硝化池样品中分离获得了3株在样品中最为主要的Thauera菌株。【结论】以特异性分子标记为导向分离培养细菌,不仅提高了分离效率及细菌筛选的灵敏度,还能协助分离常规方法难以分离的细菌。

变性梯度凝胶电泳法初步解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构

为解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构和种类,对渥堆过程中不同时间段细菌16S rDNA的V3可变区进行扩增,对细菌变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)图谱中条带进行克隆、测序和序列比对。结果表明:黑毛茶在渥堆过程中以渥堆24 h为分界点,前后各自细菌群落结构相似,但前后的差异较大;从16S rDNA的V3可变区比对结果证明黑毛茶渥堆过程中有诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、短波单胞菌属、韦龙氏假单胞菌属、突那梭菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属及不可培养的ε-变形菌、腐败螺旋菌属、黏球菌属、根瘤菌属和未知分类地位的不可培养细菌6种。采用DGGE指纹图谱能更全面、更真实地反映黑毛茶渥堆发酵过程中细菌群落的结构和多样性变化。

基于变性梯度凝胶电泳和MiSeq高通量测序技术分析恩施地区腊肉的细菌多样性

以采集自湖北省恩施地区的5个腊肉样品为研究对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase?chain?reaction-denatured?gradient?gel?electrophoresis,PCR-DGGE)与MiSeq高通量测序技术相结合的方法对其中所含微生物的多样性进行解析。PCR-DGGE结果表明,腊肉样品中的细菌主要为葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas);MiSeq高通量测序结果表明,腊肉中的细菌门主要为硬壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),其平均相对含量分别为54.05%和44.28%,细菌属主要为葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、环丝菌属(Brochothrix)、科贝特氏菌属(Cobetia)和不动细菌属(Acinetobacter),其平均相对含量分别为40.18%、24.02%、9.37%、8.53%、4.71%和2.31%;在分类操作单元(operational taxonomic units,OTU)水平上,发现252个核心OTU,累计平均相对含量高达74.22%。由此可见,PCR-DGGE和MiSeq高通量测序的结果综合分析得出恩施地区腊肉中的细菌主要为葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术在土壤微生物多样性研究中的应用

应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)谱图分析技术对土壤微生物多样性进行描述,可以克服传统微生物分离纯化培养方法和显微技术的局限性。本文介绍了变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析方法及其在土壤微生物多样性中的应用,包括对土壤特殊微生物生理类群,自然环境条件下微生物多样性变化,污染土壤微生物的多样性,不同种植制度下的土壤微生物多样性,转基因植物、微生物介入的土壤微生物多样性等方面的研究。

聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和均一凝胶电泳在分离及鉴定植物SOD同工酶中的比较研究

比较了聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(GPGE)和均一凝胶电泳(PAGE)在分离和鉴定SOD同工酶方面的应用.在GPGE中根据Rf值大小可将SOD谱带分为3个区:A区Rf值最小,对SDS敏感,为Mn-SOD;C区Rf值最大,对SDS不敏感,为CuZn-SOD;B区谱带Rf值位于两者之间,对SDS敏感,为Fe-SOD.根据GPGE图谱上谱带Rf值大小和对SDS敏感性来判断SOD类型结果与用抑制剂判断结果一致,它可作为一种SOD类型初步鉴定的简便可行的方法,相同植物材料经PAGE分离后不具备这些特性.在相同牛血SOD浓度下,GPGE检测SOD灵敏度可达10-15mol,PAGE为10-13mol;在1.56×10-12molSOD时,在GPGE中可分辨出4条带,PAGE仅为2条.枸杞Fe-SOD在7.5%胶中Rf值最大,在10%胶中与CuZn-SOD重叠,香橼Fe-SOD、Mn-SOD和朱桔Mn-SOD、CuZn-SOD在10%PAGE中相互重叠,在GPGE中它们都有规律地完全分离,可根据Rf值大小鉴别SOD类型.通过2次电泳阐明了GPGE分离和鉴定SOD的可靠性,它能有效地分离和鉴定在PAGE上重叠的3种SOD类型.