转基因玉米浙大瑞丰8特异性定性PCR检测方法研究

【目的】浙大瑞丰8是杭州瑞丰生物科技有限公司开发的抗虫转基因玉米,于2021年12月获得生产应用安全证书。研究浙大瑞丰8的特异性PCR检测方法,为市场监管和产业化推广提供技术支持。【方法】以浙大瑞丰8转化体外源基因插入端侧翼序列为靶标,在5'端(右侧翼)和3'端(左侧翼)分别设计特异性引物,以与玉米内标准基因zSSIIb一致的标准反应体系和反应程序,对左侧翼和右侧翼各20对引物进行了筛选,得到了特异性高、稳定性好的候选引物,通过改变退火温度和引物浓度这两个关键参数,初步建立了浙大瑞丰8转化体PCR检测方法。【结果】筛选到的浙大瑞丰8 PCR扩增引物RF 8-RB-R4/F1可特异性扩增目标片段265 bp,建立了与玉米内标准基因zSSIIb一致的标准反应体系和反应程序,实现了批量检测的高通量。【结论】建立的特异性定性PCR检测方法稳定性及适应性好,对拷贝数分数为0.1%(约20个拷贝)能稳定检出,可精准、特异地检测出浙大瑞丰8转化体。

婴儿食物过敏的临床症状及血清特异性免疫球蛋白E检测结果分析

目的了解不同过敏症状患儿的食物过敏原,为婴儿食物过敏的防治提供参考依据。方法选取2022年1月至12月间于长沙市妇幼保健院儿童保健中心体检中因过敏症状采用免疫印迹法进行血清特异性免疫球蛋白E(sIgE)检测的849例婴儿为研究对象。按不同年龄将婴儿分为<6月龄与≥6月龄;根据过敏的临床症状及病史等,将其分为皮肤症状(262例)、消化道症状(113例)、营养不良症状(56例)、呼吸道症状(58例)、混合症状(360例)。对不同年龄、不同性别婴儿的食物过敏原及血清sIgE检测阳性分布情况进行比较分析。结果在849名婴儿中,有皮肤症状者占30.9%(262/849),消化道症状者占13.3%(113/849),营养不良者占6.6%(56/849),呼吸道症状者占6.8%(58/849),混合症状者占42.4%(360/849);其中,男婴占57.8%(491/849),女婴占42.2%(358/849),不同性别婴儿过敏症状的分布比较差异无统计学意义(P>0.05);<6月龄者占23.8%(202/849),≥6月龄者占76.2%(647/849),不同年龄婴儿过敏症状的分布比较差异有统计学意义(χ^(2)=49.303,P<0.001)。在849名婴儿中,食物过敏原血清sIgE检测阳性者占51.7%(439/849),阴性者占48.3%(410/849);其中,男婴食物过敏原血清sIgE检测阳性者占58.3%(256/439),女婴阳性者占41.7%(183/439),不同性别婴儿食物过敏原血清sIgE检测阳性的分布比较差异无统计学意义(P>0.05);<6月龄婴儿食物过敏原血清sIgE检测阳性占17.1%(75/439),≥6月龄者阳性占82.9%(364/439),不同年龄婴儿食物过敏原血清sIgE检测阳性的分布比较差异有统计学意义(χ^(2)=22.563,P<0.001)。不同年龄婴儿的食物过敏原数量比较差异有统计学意义(Z=-4.376,P<0.05),而不同性别婴儿的食物过敏原数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同过敏症状食物过敏原血清sIgE检测阳性率及致敏种类的分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)。在12种常见食物过敏原中,牛奶的血清sIgE检测阳性致敏程度最高可达3级,鸡蛋白的致敏程度最高可达6级;≥6月龄婴儿食物过敏原血清sIgE检测阳性率均高于<6月龄婴儿,但在不同年龄婴儿中,只有牛奶过敏原血清sIgE检测阳性率比较差异有统计学意义(χ^(2)=25.122,P<0.001),其他11种食物过敏原血清sIgE检测阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论婴儿早期食物过敏以皮肤症状为主,食物过敏原以牛奶、鸡蛋为主,血清sIgE检测对诊断IgE介导的食物过敏有意义,食物过敏的诊断仍需要综合其他因素分析判断。

食物特异性IgG抗体检测在儿童功能性腹痛中的价值研究

研究食物特异性IgG抗体检测在儿童功能性腹痛中的价值。方法 选取2022年6月至2023年6月柳州市工人医院儿科所诊治的功能性腹痛病例,进行食物特异性IgE、IgG检测,研究对象是食物特异性IgE结果阳性(n=30)、食物特异性IgG结果阳性(n=30)、食物特异性IgG、IgE结果均为阴性(n=15),并且对入组的IgE阳性病例,分为IgE治疗组(n=15,根据食物特异性IgE阳性结果进行食物回避免),IgE对照组(n=15,正常饮食,未进行食物回避免);对入组的IgG阳性病例,分为IgG治疗组(n=15,根据食物特异性IgG阳性结果进行食物回避),IgG对照组(n=15,正常饮食,未进行食物回避);对IgE、IgG结果均为阴性病例,作为空白对照组(n=15,正常饮食),根据检测结果进行饮食回避治疗的有效性。结果 食物特异性IgE检测中,鸡蛋、牛奶的阳性率最高,其中鸡蛋阳性检出有25例、占比83.3%,牛奶阳性检出有23例、占比76.7%。食物特异性IgG检测中,鸡蛋、牛奶、小麦的阳性率最高,其中鸡蛋阳性检出有24例、占比80.0%,牛奶阳性检出有25例、占比83.3%,小麦阳性检出有24例、占比80.0%;IgE治疗组、IgG治疗组的腹痛需药物治疗次数及用药时间、疼痛视觉模拟评分优于IgE对照组、IgG对照组,p<0.05;经过八周干预后复查,食物特异性IgE阳性中有20例得以好转、比例是66.7%;IgG阳性中有22例得以好转、比例是73.3%。即治疗干预效果显著,缓解患儿功能性腹痛症状。结论 食物特异性IgG抗体检测的应用价值显著,食物过敏是引起儿童有功能性腹痛的关键因素,需要以食物特异性IgG抗体检测为指导加以健康饮食干预,缓解功能性腹痛患儿腹痛症状或者预防食物过敏所致功能性腹痛。

丙型肝炎病毒感染特异性检测的研究进展

丙型肝炎病毒侵入人们机体后,会导致其发生丙型肝炎,该疾病属于会对人们的身体健康造成影响的重度病毒性疾病,故临床中需要应用有效检测技术对该疾病进行更好监测,同时又能够让丙型肝炎患者得到更有效治疗。本文从丙型肝炎病毒的多种特异性检测方法出发,包括:酶联免疫吸附试验法、化学发光法、胶体金法等,对丙型肝炎病毒感染性特异性检测方法的进展展开综述,为丙型肝炎病毒的检测提供相关依据。

儿童喘息性疾病应用特异性过敏原检测的临床价值

目的:探讨儿童喘息性疾病应用特异性过敏原检测的临床价值。方法:样本选取的时间范围定在2021年1月-2023年6月,将该阶段在医院就诊的300例儿童喘息性疾病患儿纳入。在选取的喘息性疾病患儿中应用荧光免疫法进行特异性过敏原检测,统计喘息性疾病患儿的特异性过敏原检测结果,分析其过敏原分布情况。结果:300例喘息性疾病患儿的特异性过敏原检测结果显示其特异性IgE阳性率为76.67%。喘息性疾病患儿的吸入性过敏原以尘螨、霉菌、宠物皮屑为主,食物性过敏原以牛奶、鸡蛋、虾蟹为主。在不同年龄段患儿的过敏原检测结果中,6个月~2岁患儿关于宠物皮屑、鸡蛋的特异性IgE阳性率比其他年龄段患儿高(P<0.05),而不同年龄段患儿关于其他过敏原的特异性IgE阳性率对比均未发现明显差异(P>0.05)。结论:儿童喘息性疾病患儿经特异性过敏原检测可明确其过敏原的分布情况,其吸入性过敏原以尘螨、霉菌、宠物皮屑为主,食物性过敏原以牛奶、鸡蛋、虾蟹为主,且在不同年龄段患儿中,特异性过敏原分布存在一定的差异,通过检测特异性过敏原可为儿童喘息性疾病的防控工作提供可靠依据,更好地预防和控制儿童喘息性疾病。

光纤生物传感器用于核酸的特异性检测

为了利用光纤传感器实现对细菌核酸分子的特异性和相对快速检测 ,我们使用直径 1mm的石英光纤和 6 35nm激光二极管 ,利用倏逝波原理制作了光纤生物传感器。光纤经过处理后产生醛基化基团 ,然后与核酸分子进行共价结合。通过 3个实验来验证传感器的特异性和灵敏度。荧光素溶液直接检测 ,使用互补模式寡核苷酸分子 (2 5mer)进行核酸杂交模式实验和设计嗜肺军团菌一段特异性探针与荧光标记嗜肺军团菌染色体DNA杂交。结果表明 :光纤检测荧光素的灵敏度可达 0 0 1nmol L ,而生物芯片扫描仪最低可检测到 1nmol L的荧光素 ;模式寡核苷酸杂交表明 :光纤传感器可以特异性地检出目的核酸分子 ,灵敏度可达纳克级水平 ;染色体杂交结果显示在正常检测浓度下 ,光纤检测军团菌之信噪比达到了 6∶1,同时具有较好的特异性。检测时间约需要 3～ 4h。我们构建的光纤生物传感器可以用于核酸分子的特异性检测 ,并且具有较好的灵敏度 ,对光纤表面修饰、样品处理和杂交过程的优化可望使之应用于实际标本的检测。

转基因番木瓜“华农一号”事件特异性定性PCR检测方法的建立

以我国自主研发的转基因抗环斑病毒番木瓜"华农一号"为研究对象,应用TAIL-PCR技术,用载体中靠近右边界的Nos启动子序列设计特异引物,扩增插入的旁邻序列;根据测序结果,设计了产物长度分别为753和298 bp但均跨越转化载体和番木瓜基因组序列的2套特异引物,对"华农一号"进行检测,证明其可特异地把"华农一号"从转基因番木瓜品系中检测出来;2对引物的检测灵敏度都可以达到0.05%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求;利用2对特异引物对"华农一号"的果肉、果皮、种子进行检测,可得到特异性良好的扩增.

转Cry1Ab基因水稻分子特征及其特异性PCR检测方法

转Cry1Ab基因水稻Bt01为一种新型的转基因水稻,文章首先利用Southern blotting验证了外源基因Cry1Ab转入了Bt01中,且为单拷贝,再利用TAIL-PCR方法获得了其插入位点信息,根据获得的Bt01的5′端插入位点序列,设计了相应的定性与定量PCR检测体系的引物及探针,实验结果显示,定性PCR检测体系的最低检测极限(LOD)为10个拷贝,定量PCR检测体系的LOD为5拷贝,最低定量极限(LOQ)为10拷贝。同时为了验证建立的定量PCR体系的准确性,利用该体系检测已知转基因水稻Bt01含量分别为3%和0.5%的样品,定量结果分别为2.7%和0.47%。研究结果表明,该转化体特异性定性与定量检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因水稻Bt01的身份识别和检测提供了有效的方法。

黄鳝单条染色体的显微分离及特异性检测

建立了显微分离黄鳝单条染色体及检测其特异性的方法。在Olympus倒置显微镜下用毛细玻璃微针手工分离黄鳝减数分裂Ⅰ终变期 3号染色体 ,将其DNA作模板进行DOP PCR扩增后 ,分别以α-3 2 P dCTP和Biotin 11 dUTP标记的单条染色体DNAPCR扩增产物及Biotin 11 dUTP标记的大豆 18SrRNA基因作探针进行Southern杂交、FISH和Dot杂交来检测其特异性。结果表明 :(1)减数分裂Ⅰ终变期染色体标本是进行染色体显微操作的理想材料 ;(2 )DOP PCR扩增产物片段在 2 0 0～ 10 0 0bp之间 ,平均 6 0 0bp左右 ;(3)杂交结果显示 ,本研究所获得的单条染色体是黄鳝 3号染色体 ;(4 )与显微操作仪和微激光分离相比较 ,该方法不需要昂贵仪器 ,在常规实验室即可操作 。

转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估.结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%～101.479%正常范围内(R2≥0.995),定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建.

转基因油菜RF1的外源基因插入位点分析与事件特异性检测方法研究

采用基因组步移和巢式PCR方法研究了转基因油菜雄性不育恢复系RF1外源基因插入位点序列特征,并根据此特征建立了RF1转化事件特异性检测方法。从RF1基因组DNA中分离到外源基因插入位点的左边界旁侧序列798bp,包括335bp的插入载体序列和463bp的旁侧基因组序列。根据已发表的RF1右边界旁侧序列的信息,发现外源T-DNA在向油菜基因组整合的过程中,在整合位点处有75bp的基因组序列丢失。根据分离的RF1左边界旁侧序列,建立了RF1事件特异性定性检测方法,扩增片断大小为284bp。利用建立起来的RF1事件特异性定性检测方法可以准确的将转基因油菜RF1与其它的转基因油菜品种区分开,检测灵敏度达到5个拷贝(0.013%)。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因油菜品种RF1的身份识别提供了有效的方法。

转基因玉米转化体特异性PCR检测技术研究

根据不同转基因玉米中重组DNA结构,分别对转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603设计转化体特异性引物进行PCR检测。在此基础上分别以玉米内参照基因(ZSSIIb)作对照,对Bt11、Mon810、TC1507和GA21、NK603、Bt176分别作两对四重PCR反应,实现在同一个PCR反应管中同时对3种转基因玉米及内参照基因的特异性检测。

RT-PCR法特异性快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒运动蛋白基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,建立该病毒的快速检测方法。该方法可以从带毒叶片中扩增到约591 bp的片段,而TMV属其他9种病毒均无特异性扩增。本方法也适用于带毒种子的检测,具有准确、灵敏及时效性强等特点,为进出境植物检疫和农业安全生产提供可靠的技术支持。

腐烂茎线虫种内群体特异性检测研究

对腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne）7个不同地理群体rDNA中的ITS区进行PCR-RFLP和序列测定,发现种内群体间无论在序列长度还是酶切图谱均存在一定的变异.根据其序列特征设计出种特异性引物,对所供试的腐烂茎线虫群体及属间不同种群体样品的rDNAITS区相应区段扩增以验证其特异性,同时对分别由1～5条腐烂茎线虫成虫和幼虫提取的DNA进行特异性扩增以验证其灵敏度.结果表明：所有供试的腐烂茎线虫群体均可以特异性扩增一个346bp的片段,而所有供试的属外种均没有扩增片段;由1～5条腐烂茎线虫成虫和4～5条幼虫进行的特异性扩增也获得稳定的目的片段.显示该特异性引物具有较高的稳定性、特异性和灵敏度,能快速、准确地检测出腐烂茎线虫.

进口转基因玉米品系特异性检测

从文献、网站和数据库中收集了14个转基因玉米品系特异性定量检测方法,将这些方法应用于从美国进口的近60万t转基因玉米的检测,检出了国家批准的11个转基因品系,还在全国首次从大宗原粮中检出国家未批准转基因玉米品系MON89034。这为转基因玉米品系特异性检测标准的制定打下了基础。

食品中绿豆成分PCR特异性检测方法的建立

针对绿豆物种特异性序列,设计了定性PCR引物,建立了绿豆源性成分检测方法,并对0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol·L^(-1)的引物浓度,52、54、56、58、60、62℃的退火温度等反应条件进行优化,对该方法的灵敏度、特异性和检出限进行了测试。结果表明,在引物浓度0.4μmol·L^(-1)、退火温度58℃条件下的扩增效果最优,绿豆的检出限可达到0.5%。该检测方法具有高度的特异性,操作方便、简单、快捷,可为食品安全的检测提供依据。

适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子构建及其适用性鉴定

针对目前转基因产品检测标准物质缺乏的难题,构建适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子pEASY-RT73,其包含转基因油菜RT73品系3'端侧翼序列,油菜内标准基因HMG和PEP片段。对其在定性和定量检测中的适用性进行了实验室内部验证,结果表明,标准分子pEASY-RT73高度特异于转基因油菜RT73品系。以标准分子为标准品的普通PCR扩增中,3个目标片段的检测下限(LOD)均为10拷贝。实时荧光PCR检测的LOD均为25拷贝,定量下限(LOQ)均为50拷贝。以标准分子为标准品构建的标准曲线反应效率介于0.96-1.02间,相关系数均大于0.999。分别以PEP和HMG为内标准基因对5个盲样的测试结果显示,测量值与设定值间偏差(Bias)介于-14.13%-14.29%间,SD小于0.20,RSD小于18.0%。因此,标准分子pEASY-RT73可很好地替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜RT73及其来源产品品系特异性检测。

土壤磷素高效利用转基因大豆特异性PCR检测方法

华南农业大学根系生物学研究中心采用拟南芥的紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15转化大豆品系粤春03-3(YC03-3),获得了酸性磷酸酶活性明显提高、可高效利用土壤磷素的转基因大豆新品系AP15-1。本研究以AP15-1为研究对象,应用TAIL-PCR技术,根据载体序列设计特异引物,获得了转化载体左侧插入的旁邻序列。设计事件特异性检测引物,进行PCR扩增,只能在AP15-1的样品中扩增出特异性条带,进一步用实时荧光定量PCR作分析,结果显示,该引物对重复性好,融解曲线显示只有一个特异峰值。本实验应用该引物对建立的检测方法,检测的灵敏度可以达到0.01%,实时荧光定量PCR检测的极限值可以达到9个基因组的拷贝数,能够满足对转基因大豆新品系AP15-1及其衍生品种检测的需要。

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。

转基因“华番一号”番茄的筛选和特异性的定性、定量PCR检测方法

为给转基因植物监测提供技术支持 ,建立了转基因“华番一号”番茄筛选和特异性的定性、定量PCR检测方法。转基因“华番一号”的筛选PCR检测主要以转基因通用元件CaMV35S启动子和NOS终止子为目的基因片段 ,特异性PCR检测以转基因外源重组子的CaMV35S启动子和反义EFE基因的相邻序列为目的片段 ;实验同时设立番茄的LAT5 2基因为转基因番茄定性、定量PCR检测的内对照基因。在所建立的PCR检测体系中 ,定性PCR筛选和特异性检测的检测极限为 6 8个拷贝 ,实时定量PCR方法的检测极限为 3个拷贝 ;筛选定量PCR检测的定量极限为 3个拷贝 ,特异性定量PCR检测的定量极限为 2 5个拷贝。最后通过对 2个已知含量的转基因番茄“华番一号”混合试样的检测 ,证明了该体系可以有效地用于转基因番茄“华番一号”的筛选和特异性的定性、定量PCR检测。