DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将

香石竹ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

根据已发表的ACO核苷酸序列 ,设计一对引物 ,以香石竹品种‘American’基因组DNA为模板 ,扩增出香石竹ACC氧化酶基因 ,将其连接到pMD18加T质粒载体上 ,通过中间载体pBluescriptSK ,构建了ACO基因正向和反向插入的植物表达载体 ,并将其导入了农杆菌。酶切检测表明该片段已插入表达载体 ,序列测定结果显示所克隆基因片段含 3个外显子 ,2个内含子 ,其中

梭梭CMO基因的克隆与植物表达载体的构建

采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中扩增出甜菜碱合成过程中的限速酶胆碱单加氧酶（CMO）编码基因的cDNA序列（命名为HaCMO）,其开放阅读框为1 344 bp,推测的氨基酸序列全长为447个氨基酸残基.根据已获得的开放阅读框,构建重组植物表达载体pCAMBIA2300-HaCMO.HaCMO核苷酸序列与藜科几种盐生植物如菠菜（Spinacia oleracea）、山菠菜（Atriplex hortensis）、辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis）、盐角草（Salicornia europaea）和甜菜（Beta vulgaris）等的一致性均在74.5%以上,推导编码蛋白的氨基酸序列一致性均在73.5%以上,表明CMO编码基因在藜科植物中是一种比较保守的基因.研究结果为进一步从分子水平探明梭梭的抗旱、耐盐机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定了基础.

抗旱基因HDCS1的植物表达载体构建

在克隆了二棱大麦第 ３ 组 Ｌ Ｅ Ａ ｃ Ｄ Ｎ Ａ，抗旱基因 Ｈ Ｄ Ｃ Ｓ１ 的基础上，将其连接于ｐ Ｂ Ｉ１２１ 的 Ｃａ Ｍ Ｖ３５ Ｓ 启动子和 Ｎ Ｏ Ｓ终止子之间，构建了 Ｈ Ｄ Ｃ Ｓ１ 的植物表达载体 ｐ Ｂ Ｈ Ｃ，并进行了 Ｐ Ｃ Ｒ 和酶切鉴定。

抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究

利用基因重组技术,将木霉几丁质酶基因(Chi)和-β1,3-葡聚糖酶基因(Glu)进行融合并将其引入含bar基因的载体pAHC25中,成功构建了由Ubiquitin启动子分别驱动Chi-linker-Glu和bar的中间载体,然后将其上的Ubi-Chi-linker-Glu-nos和Ubi-bar-nos表达盒引入pBI121中,获得兼具除草剂抗性基因bar和真菌抗性基因Chi与Glu的三价植物表达载体pBIb-CG,并对烟草进行遗传转化,经PCR及Southern检测,共获得转基因烟草32株。外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验表明转基因烟草叶片提取液对木霉菌和镰刀菌表现出一定的抗性。

双价抗虫基因植物表达载体的构建

将蝎毒基因BmKITS和几丁质酶基因chitinase2个抗虫基因采用不同的启动子ubi或35S,连到2个高效的植物表达载体pWM101和pBI101中,2个重组表达质粒分别经过限制性酶切分析和PCR鉴定,实验结果表明2个含有双价抗虫基因的植物重组表达质粒均已构建成功.

弓形虫多表位基因植物表达载体的构建

目的 构建弓形虫多表位基因(TGMG)植物表达载体。方法①将TGMG亚克隆人pBAC55构建中间载体pB35MG,再将其中E35S/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35MG。②将番茄果实特异性启动子E81.1插入pB35MG构建中间载体pB35E1MG,再将其中E35SE81.1/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35E1MG。③将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG构建中间载体pBE2MG,再将其中E82.2/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pCE2MG。测序鉴定pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG中的TGMG序列。④pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG转化根癌农杆菌LBA404。结果 重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG测序结果正确。结论 成功构建TGMG中间载体pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG,以及植物表达载体pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG。并将3种植物表达载体导入根癌农杆菌。

NtSKP1-GFP植物表达载体的构建及亚细胞定位

用PCR技术扩增NtSKP1基因的编码区,定向克隆至表达载体pCAMBIA1302上构建用于瞬时表达NtSKP1蛋白的重组质粒。重组质粒经PCR和测序鉴定后用冻融法转入农杆菌LBA4404,进而经农杆菌LBA4404介导转入烟草悬浮细胞,激光共聚焦显微镜观察确定其亚细胞定位。测序结果表明,插入片段与预期序列完全一致,与载体形成了一个完整的基因表达盒;亚细胞定位结果表明NtSKP1蛋白在胞浆和核部位均有分布。

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。

甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aACO1上切下大小约2.3kb的目的基因,将其定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因的甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体pCB-aACO1.采用直接转化法将pCB-aACO1导入根癌农杆菌菌株EHA105,并用新构建的工程菌对普通烟草进行了遗传转化研究.在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中.此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础.

人参皂苷合成相关β AS基因的克隆及其反义植物表达载体的建立

以发根农杆菌A4菌株诱导的人参发根为材料,用改良的异硫氰酸胍法提取总RNA,得到了纯度好的完整的总RNA。利用RT-PCR扩增了β香树素合成酶基因,测序结果表明该目的片段与GenBank上的β香树素合成酶基因序列一致。这一基因重组入克隆载体pMD-119T,并转化大肠杆菌。在此基础上,利用pBI121质粒载体,构建了人参β香树素合成酶基因的反义植物表达载体,为这一基因的反义调控研究打下基础。

Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草。进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达。对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性。

石斛兰dfr基因植物表达载体的构建

石斛兰花瓣缺乏橙色、蓝色,这与其二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)活性有着密切的关系。根据已报道的石斛兰dfr基因序列设计引物,从Den.Burana Emerald中分离了dfr基因。将该基因序列正向与反向连接到植物表达载体pCAM BIA1301中,并由组成型启动子CaMV35S驱动,成功构建了dfr基因的正义和反义植物表达载体pC-SDN1和pCSDN2,并导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)EHA105,以期利用转基因技术培育出石斛兰花色新品种。

Prd29A及DREB1A的克隆和干旱诱导型植物表达载体的构建与鉴定

从拟南芥中克隆了RD29A 基因的启动子(Prd29A)及DREB1A 基因的DNA 片段,构建Prd29A:DREB1A 融合基因,采用合成的接头将该融合基因插入到植物表达载体pBI121 中,经鉴定,确认正确。

高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建

【目的】利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因(Cbcor15a)和报告基因eGFP插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia1300-cbcor15a-bar。【方法】参照pCambia1300-bar载体多克隆位点和基因Cbcor15a、eGFP和启动子UBi-1的核苷酸序列设计引物,通过载体重组技术将基因和启动子分别插入相应的位点。利用基因枪分别将pCambia1300-bar载体和重组载体导入洋葱表皮细胞,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。【结果】与导入pCambia1300-bar载体的洋葱表皮细胞相比较,导入重组载体pCambia1300-cbcor15a-bar的洋葱表皮细胞内有强烈的绿色荧光信号。【结论】重组甘蔗转基因二元植物表达载体启动子Ubi-1能够调控下游冷诱导基因Cbcor15a和报告基因eGFP的正常高效表达,为外源基因Cbcor15a转化甘蔗提供保障。

烟草柠檬酸合成酶基因的克隆及其光诱导型植物表达载体的构建

紫花苜蓿为多年生优质豆科牧草。我国南方地区酸性土壤分布比较广,铝害比较严重,限制了紫花苜蓿在南方地区的推广利用。提高有机酸合成酶基因的表达活性,增加有机酸的合成与分泌,有利于增强植物的耐铝性。本研究根据Genebank中已知的烟草柠檬酸合成酶(Citrate Synthase,cs)基因的序列,通过RT-PCR从烟草总RNA中扩增cs基因的cDNA,亚克隆于T载体得到重组载体pMD18-cs,对pMD18-cs中的插入片断进行核酸序列分析确认为cs基因的cDNA全长。用光诱导型启动子(Rubisco,小亚基的启动子)和双元载体pPZP211构建了cs基因的光诱导型植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs,为利用基因工程手段提高紫花苜蓿耐铝毒能力,促进其在南方地区推广利用奠定了物质基础。

大白菜orf224基因植物表达载体的构建及遗传转化

为了创制新的大白菜雄性不育材料,双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确.采用快速冻融法,将表达载体导入农杆菌EHA105,转化大白菜材料06J28,对转化植株的GUS、PCR和RT-PCR检测表明,获得了2个大白菜转基因植株.

大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义+正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。

中国葡萄属野生种抗白粉病抗逆基因植物表达载体的构建

将质粒pSB166中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303,构建了中间表达载体pWR306;以中国野生葡萄华东葡萄白河35-1cDNA为模板,通过PCR扩增出葡萄芪合成酶基因(STS)、醛脱氢酶基因(ALDH),与pGEM-TEasy克隆载体连接,获得重组质粒pGEM-TEasy-STS和pGEM-TEasy-ALDH;双酶切重组质粒及表达载体pWR306,将STS、ALDH基因片段与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了葡萄芪合成酶基因及醛脱氢酶基因的植物表达载体pWR-STS、pWR-ALDH,并用改进冻融法导入农杆菌GV3101。

DREB基因双T-DNA植物表达载体的构建及验证

W 34基因经 pGEM T EASY载体 ,克隆到 pBDREB载体EcoRI位点 ,得到在Amp平板上生长的转化子 pBW 34-DREB质粒 ;质粒pBW 34-DREB、pSPROK、pBlueks分别经PstI/KpnI、KpnI/EcoRI、PstI/EcoRI双酶切 ,三片段连接构建成中间表达载体 pBWD Tnos;再用SmaI/EcoRV双酶切 pBWD Tnos,将回收的DREB基因的完整的表达结构元插入到经SmaI酶切的质粒载体 pCDMAR Hyg中 ,构建成双T DNA植物表达载体 pCDMAR pWDT Hyg ,大小为 13 5 9kb ,经酶切鉴定 ,证明构建的载体与预期设计的一致。将此双T载体用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织 ,期望得到无选择标记的安全的转基因植物。