Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。

高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建

【目的】利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因(Cbcor15a)和报告基因eGFP插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia1300-cbcor15a-bar。【方法】参照pCambia1300-bar载体多克隆位点和基因Cbcor15a、eGFP和启动子UBi-1的核苷酸序列设计引物,通过载体重组技术将基因和启动子分别插入相应的位点。利用基因枪分别将pCambia1300-bar载体和重组载体导入洋葱表皮细胞,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。【结果】与导入pCambia1300-bar载体的洋葱表皮细胞相比较,导入重组载体pCambia1300-cbcor15a-bar的洋葱表皮细胞内有强烈的绿色荧光信号。【结论】重组甘蔗转基因二元植物表达载体启动子Ubi-1能够调控下游冷诱导基因Cbcor15a和报告基因eGFP的正常高效表达,为外源基因Cbcor15a转化甘蔗提供保障。

费尔干猪毛菜病程相关蛋白基因SfPR-1的表达规律和植物表达载体构建

采用RT-PCR技术探究盐生植物费尔干猪毛菜病程相关蛋白基因SfPR-1(GenBank登录号:JQ670917)在不同发育时期、组织部位、植物激素、非生物胁迫及生物胁迫处理下的表达规律,以揭示该基因在费尔干猪毛菜生长发育和逆境胁迫下的作用。结果表明,不同组织(根、茎、叶)中,SfPR-1在根中表达量最高,预示该基因可能在根防御中发挥主要作用;SfPR-1在不同发育阶段(种子、种子萌发20 d幼苗、种子萌发30 d幼苗、种子萌发40 d幼苗)的表达特性显示,种子萌发30 d幼苗时,其表达差异最显著,表明其可能在植株后期生长发育中具有重要作用;SfPR-1对不同植物激素(水杨酸SA、茉莉酸JA、脱落酸ABA、乙烯合成前体ACC)均产生了响应,表明该基因在几条主要的抗病防御通路中均发挥作用。非生物胁迫(H2O2、盐、旱、冷)都能够诱导SfPR-1基因的表达,其中对盐响应程度最高。以植源性意大利青霉(Penicillium italicum)进行生物胁迫时,SfPR-1表达呈持续上升趋势。以上结果表明费尔干猪毛菜病程相关蛋白基因SfPR-1是生物与非生物逆境胁迫下均响应的基因,推测其在植物抵御逆境胁迫中发挥重要作用。

滇龙胆GrWRKY5基因的克隆和植物表达载体构建

WRKY蛋白是目前被广泛研究的一类DNA特异结合转录因子,在植物次生代谢物生物合成、植物生长和发育及衰老等生理过程以及生物、非生物防御反应中起重要的调控作用。该研究从滇龙胆幼叶中克隆萜类合成的关键转录因子基因Gr WRKY5,并利用生物信息学方法对基因功能进行预测,构建植物过表达载体。结果表明:根据三年生滇龙胆转录组Gr WRKY5基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增Gr WRKY5 ORF序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建入门载体p ENTRTM2B-Gr WRKY5,经LR反应后构建植物过表达载体。Gr WRKY5 ORF全长591 bp,编码196个氨基酸,Gen Bank登录号为KF922375,其中第167与170之间的色氨酸(W)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)组成WRKY蛋白所特有的"WRKY"结构。序列分析表明Gr WRKY5是WRKY超家族的成员。经生物信息学在线软件分析发现,Gr WRKY5的等电点为6.29,脂肪族指数为61.37,不稳定指数为57.80。总平均疏水性为-0.708,为亲水蛋白;含有20种氨基酸,其中天冬氨酸(Asp)和脯氨酸(Pro)含量最高,为8.1%;半胱氨酸(Cys)含量最低,仅为1.0%。氨基酸序列系统发育分析表明,Gr WRKY5与拟南芥中WRKY家族中遗传距离最接近的是WRKY27,属于Ⅱe类成员;与Cr WRKY22和Vv WRKY22蛋白的亲缘关系较近;与Jc WRKY47和Tc WRKY27亲缘关系较远;BLASTp结果显示,Gr WRKY5与欧洲油菜Bn WRKY27-1的同源性最高(为69%);与拟南芥Aa WRKY22的一致性最低(仅为31%)。以Gateway入门载体p ENTR2B和目的载体p K2GW7为基础,成功构建了植物过表达载体p K2-35S-Gr WRKY5,该载体的成功构建为该基因在拟南芥、滇龙胆等植物中的遗传转化奠定了基础,同时为WRKY基因功能的深入研究提供依据。

DREB1A转录因子的克隆及植物表达载体构建

采用CTAB法提取拟南芥叶片总DNA,根据GenBank中报道的DREB1A转录因子序列设计并合成1对引物,通过PCR扩增得到一特异片段,并将其连接到pGEM-T Easy Vector上进行克隆并测序。结果表明,该片段全长651 bp,与报道的DREB1A转录因子序列完全一致,以此克隆片段构建了由组成型启动子CaMV35S驱动DREB1A基因表达的植物表达载体pBI121/DREB1A,从而为后期花卉等植物的遗传转化及品种抗性改良奠定了基础。

蝴蝶兰LFY基因克隆及高效植物表达载体的构建

根据NCBI中蝴蝶兰LFY花序分生组织基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从蝴蝶兰花芽中扩增出LFY基因,对扩增产物进行克隆和测序。结果表明,获得的蝴蝶兰LFY基因约为1 500 bp,与报道序列同源性达98.71%。将LFY基因插入pRI101-ON载体中,经PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组表达质粒中含有目的片段,表明成功构建了高效植物表达载体pRI101-LFY。

扁桃AcAGL15基因的克隆及植物表达载体构建

以新疆栽培扁桃品种‘双果’为材料,通过RT-PCR技术克隆得到一个AGL15转录因子编码基因,命名为Ac AGL15,GenBank登陆号为KU167496。通过生物信息学分析,该基因序列全长765 bp、编码255个氨基酸多肽,为不稳定的亲水性蛋白,推测蛋白分子质量为28.77 k D,亚细胞定位于细胞核中,分析表明该基因有保守的MADS box和K-box结构域。通过PCR和双酶切验证,显示植物表达载体构建成功,为后续该基因功能的研究提供了帮助。

3种不同启动子构建ACC脱氨酶基因植物表达载体

从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)UW4菌株克隆出ACC脱氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase)基因连接至pGEM-Tvector上,并采用3种不同启动子(组成型表达启动子CaMV35S、花特异表达启动子CHSA及衰老特异表达启动子SAG12)分别构建ACC脱氨酶基因的植物表达载体,经PCR及酶切鉴定均已构建成功,为后期选择不同的花卉等植物材料遗传转化研究打下基础。

蝴蝶兰ACC氧化酶cDNA片段的克隆及其反义植物表达载体的构建

根据已报道的蝴蝶兰ACC氧化酶的基因序列,设计了一对引物,通过RT-PCR从蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC氧化酶的cDNA片段,将其连接到pMD19-T载体上进行测序.结果显示,该片段与参考的已报道序列具有99.70%的同源性.测序后将该基因的cDNA序列反向插入pBI221的CaMV35S启动子和nos terminator之间,构建了蝴蝶兰ACC氧化酶的反义基因植物表达载体,为进一步转化蝴蝶兰研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础.

用于植物基因研究的mCherry表达载体构建及定位表达

荧光蛋白在生物学研究中具有广泛的应用和重要的作用,其中红色荧光蛋白mCherry因其颜色和良好的特性,对于植物基因研究具有重要的使用价值,本研究将mCherry基因构建到pBI121植物表达载体系统中,构建了pBI121MCS-mCherry载体。利用基因枪转化法转入洋葱表皮进行表达验证,显微镜观察结果显示整个洋葱细胞具有红色荧光,证明该载体能够在植物细胞中表达红色荧光蛋白。利用双酶切连接法将转录因子BpMYB4基因构建到该载体上,得到融合表达载体pBI121MCS-mCherry-BpMYB4,在洋葱表皮中表达,结果显示细胞核具有红色荧光,证明该载体能够准确表达融合蛋白,进行亚细胞定位。同时融合基因时不再需要中间载体,构建简便,引入的KpnⅠ酶切位点,增加了可选择性。因此该载体可用于植物基因表达定位及转基因植株筛选研究中,为今后的白桦基因组学研究提供了材料。

拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C(AT1g07430)的cDNA序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法从NaCl处理的拟南芥总RNA中扩增出AtPP2C基因的全长cDNA片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR201中。测序表明,该片段与GenBank上报道的序列具有100%的同源性。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pLEELA为基础,构建了由组成型启动子35S调控的AtPP2C基因的植物表达载体pLAT35S。

产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因的克隆、测序及植物表达载体的构建

用PCR的方法,从产甘油假丝酵母WL2002—5中扩增出了产甘油关键酶3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol3-phosphate dehydrogenase)和3-磷酸甘油磷酸酶(glycerol3-phosphate phosphatase)的基因GPD和GPP。对这两个基因测序,发现基与酿酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae)的GPD、GPP基因的相似性达99%。并构建了其在植物中的表达载体。

应用Gibson Assembly方法构建植物表达载体

【目的】构建方便快捷的植物表达载体。【方法】应用Isothermal in vitro recombination system or “Gibson Assem-bly”方法设计包含片段间20～25 bp互补重叠序列的引物，通过PCR扩增出带有首尾重叠的目的DNA片段，可将1个或多个片段和线性化的载体一步组装成表达载体。【结果和结论】利用该方法快速构建了多个水稻基因的全长以及部分缺失编码区表达载体。此外，还通过对Gibson Assembly连接产物进行PCR扩增后再连接到载体，提高多DNA片段组装的效率。本方法不受目的片段内部限制性酶切位点的限制，可广泛应用于各种载体的构建。

阔叶薰衣草芳樟醇合成酶基因的克隆与表达载体构建

以阔叶薰衣草(Lavandula latifolia)的鲜叶为试材,通过RT-PCR技术,获得阔叶薰衣草芳樟醇合成酶基因的cDNA序列。该序列长度为1809bp,编码602个氨基酸,包含一个1809 bp的开放阅读框,与NCBI上已公布的阔叶薰衣草的芳樟醇合成酶蛋白序列相似度为98%,有21个核苷酸差异,11个氨基酸差异,将其命名为Lslis。序列分析研究表明:Lslis具有多数单萜烯类合成酶基因典型的保守结构域,即DDXXD,RRX8W和(N,D)D(L,I,V)X(S,T)XXXE;具有芳樟醇合酶活性必需的DDXXD功能基团。Lslis推导氨基酸序列的预测分子质量和等电点分别为70.36和5.66 kD;疏水性分析结果表明其大部分氨基酸区域为亲水结构,该基因为亲水多肽。Lslis和已公布的阔叶薰衣草芳樟醇合酶Lllis的蛋白二级结构预测结果表明,两者在整体结构上基本保持一致,但Lslis相对于Lllis要少一个α螺旋结构。将其连接到pMD18-T的载体上,通过中间载体pCAMBIA1303,构建了Lslis基因的植物表达载体,并将其导入农杆菌,经菌落PCR鉴定和测序结果表明该片段已插入表达载体。

蝴蝶兰ACC合成酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

[目的]克隆蝴蝶兰ACC合成酶cDNA片段,构建其反义表达载体。[方法]根据已报道的蝴蝶兰ACC合成酶的基因序列,设计并合成了1对引物,通过RT-PCR以蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC合成酶的cDNA片段,将其连接到MD19-T质粒载体上进行测序。用XbaⅠ和SacⅠ对重组质粒和pBI221酶切后连接,构建蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。[结果]获得了蝴蝶兰ACC合成酶的cD-NA片段,测序结果显示,该片段与参考的已报道序列具有98.92%和76.36%的同源性。通过引入XbaⅠ和SacⅠ酶切位点,进行载体构建,构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。[结论]成功构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因植物表达载体,为进一步研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础。

花生ABI3基因的克隆、序列分析及表达载体构建

脱落酸(ABA)作为植物体内的一种重要激素,参与植物多个生长发育过程。ABI3是ABA信号转导途径中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从花生成熟种子中克隆到ABI3的同源基因AhABI3。预测该基因开放阅读框为2313 bp,编码770个氨基酸。同源比较发现Ah ABI3与拟南芥、鹰嘴豆等的ABI3具有较高的相似性;进化分析表明AhABI3与鹰嘴豆ABI3亲缘关系最近。本研究还成功构建了AhABI3的过量表达载体pCambia2300EC-Ah ABI3,为进一步研究其功能奠定了基础。

拟南芥CAX 1基因克隆及表达载体的构建

传递逆境胁迫如盐胁迫、干旱胁迫和病菌感染响应的重要第二信使是钙离子,而且在拟南芥植物细胞内,钙离子浓度受到严格的控制。CAX 1定位于液泡膜,是将钙离子存储于液泡的钙离子通道。利用PCR技术从拟南芥植物中的cDNA扩增出基因CAX 1。在此基础上将扩增出来的含有CAX 1基因片段与pMD 18-T载体连接得到重组质粒,再连接在pBI 121质粒的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,转化在感受态的大肠杆菌后经过培养,并进行菌落PCR验证和酶切鉴定,以期为研究转运蛋白CAX 1过量表达株系是否影响植物抗病提供参考。

蒙古沙冬青AmWRKY53基因表达分析及表达载体构建

以蒙古沙冬青为试材,分离到1个编码WRKY类转录因子基因,命名为AmWRKY53。该序列包含1个长为1 065bp的开放阅读框,编码354个氨基酸,具有1个WRKYGQK结构域和1个C_2HC锌指基序,属于Ⅲ型WRKY转录因子。荧光定量PCR方法检测了非生物胁迫下AmWRKY53在叶和根组织中的表达特点。结果表明:AmWRKY53受干旱和高盐诱导,参与逆境胁迫应答。构建的pPZP212-AmWRKY53植物表达载体,为进一步研究AmWRKY53的功能奠定了基础。

芥菜型油菜BjuA03.TTG2基因启动子克隆及表达载体构建

为进一步分析芥菜型油菜BjuA03.TTG2启动子在调控该基因表达中的作用,本研究以含有该基因的BAC单克隆质粒DNA为模板,通过普通PCR获得BjuA03.TTG2上游1 839 bp的DNA序列。利用PlantCARE在线分析软件分析BjuA03.TTG2启动子序列,含有许多与应答相关的顺式作用元件,如激素、光、低温等。根据BjuA03.TTG2启动子顺式作用元件的位置设计引物,采用5’端系列缺失分析法,利用PCR方法对BjuA03.TTG2基因上游启动子序列进行特异扩增,分别克隆了1 839、1 497、1 165、863、627、377和297 bp的启动子片段并构建到pCAMBIA1304植物表达载体中。鉴定结果说明7个BjuA03.TTG2启动子不同区段与GUS融合的植物表达载体构建成功。研究结果为进一步分析BjuA03.TTG2启动子的功能作用提供前期基础。

棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一,参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)D5基因组数据库以AtMYB0(GL1,NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0,从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0,其开放阅读框长度为843 bp,编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明,GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达,开花后20 d表达量达高峰;在所有的组织器官中,花中表达量最高,其次为胚珠。转基因功能分析结果表明,在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0,使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少;该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达,能恢复表皮毛缺失型突变体的表型,说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用,本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。