橡胶灵芝菌内参基因筛选与分析

【目的】分析评价不同胁迫处理的橡胶灵芝菌候选内参基因的稳定性,为探索橡胶灵芝菌基因的功能及其侵染橡胶树的分子机制等提供参考。【方法】以5个非生物因子(温度、盐、氧化、pH、干旱)和1个生物因子(生防细菌)胁迫下的橡胶灵芝菌作为材料,提取RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR技术,扩增6个候选内参基因(UBC、ACT、RPL6、β-TUB、APT、28s),利用分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder根据基因表达的稳定性对基因进行排序,选择最适合不同胁迫的内参基因组合。【结果】所有样品RNA均为清晰的两条带,且6个候选内参基因的熔解曲线为明显单一峰。结合geNorm、NormFinder、Bestkeeper和RefFinder对其进行表达稳定性分析发现,温度胁迫下基因表达稳定性为UBC>ACT>RPL6>β-TUB>28s>APT,盐胁迫下基因表达稳定性为ACT>RPL6>UBC>APT>β-TUB>28s;氧化胁迫下基因表达稳定性为UBC>ACT>28s>APT>β-TUB>RPL6;pH胁迫下基因表达稳定性为RPL6>UBC>APT>ACT>β-TUB>28s,干旱胁迫下基因表达稳定性为ACT>UBC>β-TUB>RPL6>APT>28s,生物胁迫下基因表达稳定性为UBC>ACT>RPL6>28s>APT>β-TUB。【结论】结合所有候选基因稳定性和胁迫条件,推荐基因ACT和UBC作为在干旱、氧化、温度和生物胁迫下的内参基因,基因ACT和RPL6为盐胁迫下的内参基因,UBC和RPL6为pH胁迫下的内参基因。本研究结果为不同胁迫下橡胶灵芝菌相关基因的表达研究提供了合适的内参基因。

枯草芽孢杆菌Czk1挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌的抑菌机理

红根病是我国分布广、发病率高、危害较为严重的橡胶树根部病害。为明确枯草芽孢杆菌Czk1菌株产生的挥发性物质对橡胶红根病原菌橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)的抑菌作用,以挥发性物质的主要成分苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚为研究对象,分析其对橡胶灵芝菌的糖、蛋白、DNA、关键代谢酶活性、细胞内容物泄露情况的影响。结果表明,经挥发物混合活性组分处理后,橡胶灵芝菌糖类含量显著降低;高浓度的枯草芽孢杆菌Czk1菌株挥发物混合活性组分影响其蛋白质的合成;DNA分子量变化不明显,未破坏橡胶灵芝菌DNA的一级结构。关键代谢酶活性(苹果酸脱氢酶、几丁质酶)降低,细胞内溶物泄漏情况明显。挥发物混合活性组分可能是通过破坏橡胶灵芝菌的细胞膜结构,扰乱物质代谢活动,从而达到抑菌作用。

橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)DNA条形码检测筛选（英文）

选用10对DNA条形码标准序列ITS、COI、nrDNA-LSU、nrDNA-SSU和trnL DNA对海南和云南红根病区分离的21个橡胶灵芝菌进行检测。除COI和trnLDNA外,其他8对引物均扩增得到PCR产物,产物大小范围为268～1355bp,种内相似度为98.05%～99.54%。分别将扩增得到的序列与GenBank公布上的Ganoderma属和常见真菌属序列,共77个ITS、74个nrDNA-LSU和74个nrDNA-SSU序列进行系统进化树构建与分析。结果表明:nrDNA-LSU序列和nrDNA-SSU序列种间差异较小,不能准确区分Ganoderma属及其他属;5对ITS序列均能区分Ganoderma属,但仅ITS1/ITS4序列能将Ganoderma属下16个种归入不同分支。ITS1/ITS4序列表现出适宜的种内与种间差异,适宜作为G. pseudoferreum的DNA条形码。

Bacillus subtilis Czk1挥发性化合物对橡胶树红根病菌的抑制作用

由橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)引起的红根病是橡胶树生产上毁灭性病害之一。为明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czk1产生的挥发性物质对橡胶灵芝菌的抑制作用,以橡胶灵芝菌为靶标菌,通过平板对峙法检测Czk1所产12种挥发性化合物纯品的抑菌活性;采用生长速率法对挥发性活性组分进行毒力测定;检测挥发性混合组分对橡胶灵芝菌细胞的形态及细胞膜通透性的影响。结果表明,12种挥发性化合物纯品对橡胶灵芝菌均具有不同程度的抑菌活性,其抑菌率在15.20%~100%之间,其中,苯甲醛对橡胶灵芝菌抑菌活性最强,抑菌率达到100%。9种化合物纯品对病菌的毒力测定中,苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚EC50分别为20.30、30.62、40.96μg·mL^-1。该三种混合组分浓度为25μg·mL^-1,其对橡胶灵芝菌的抑制率为67.00%。经三种混合活性组分处理后的病菌菌丝缠绕成一团,细胞壁变薄,部分膜结构不完整。混合活性组分影响病菌细胞通透性。Czk1产生的挥发性物质具良好的抑菌活性是由这些挥发性物质协同作用的结果,这些挥发性物质应用前景巨大,可作为化学农药替代品防治橡胶树红根病。

不同地区橡胶树红根病菌的生物学特性及室内毒力测定

橡胶树红根病是我国分布最广、危害最重的橡胶树根部病害。为明确我国海南和云南地区橡胶红根病菌的生物学特性及对杀菌剂的敏感性,采用十字交叉法研究了不同培养条件对病菌菌丝生长的影响,并测定了10种不同杀菌剂对病菌的抑制作用。结果表明,病原菌在玉米+橡胶根的培养基上生长最快,对温度、pH等适应范围广,温度在13～31℃,pH在3～10均能生长,最适生长温度为28℃,多数菌株最佳pH为7～9,且能利用多种碳氮源;不同的碳源中,果糖、半乳糖、麦芽糖、葡萄糖和甘露糖较适合该菌的生长;在供试氮源中,菌丝在酪氨酸、牛肉浸膏的基础培养基上生长最快,在色氨酸和尿素的基础培养基上生长最慢;光照对病菌有抑制作用,黑暗有利于菌丝生长;菌丝的致死温度为47℃,10 min。不同地区的病原菌株间药剂敏感性存在一定差异,戊唑醇抑菌效果最好,其EC_(50)为0.0312μg/mL,其次为嘧菌酯、十三吗啉、咪鲜胺和腈菌唑,EC_(50)分别为0.5581、0.6759、1.3763和1.5603μg/mL。