紫草素(shikonin)抗奥密克戎毒株的实验研究及机制分析

目的探讨右旋体紫草素(shikonin)抗奥密克戎毒株的药理作用和对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。方法使用奥密克戎毒株BA.2.2转染的Vero细胞模型检测shikonin的抗病毒活性;利用体外主蛋白酶荧光偏振模型测试shikonin对于新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性,实验以奈玛特韦为阳性对照化合物。结果Vero细胞模型药理活性测试发现shikonin具有抑制奥密克戎毒株核酸复制的作用;而在体外荧光偏振模型活性测试实验中,shikonin在20、50μM药物浓度并未表现出对主蛋白酶的显著抑制活性。结论紫草素(shikonin)在细胞水平的实验中表现出抗奥密克戎毒株的药理活性,但其可能是主蛋白酶的非特异性抑制剂,抗病毒的作用机理极可能为抑制新型冠状病毒RNA聚合酶。

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明:优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率介于13.33%~44.44%之间,2018—2022年阳性率介于28.30%~31.58%之间,散养户和规模化猪场的阳性率分别为38.24%和19.13%。说明试验建立的PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法特异、敏感、稳定、准确,洛阳市PEDV变异毒株的流行特点为个别地区较严重的情况、近几年流行率基本持平、散养户流行情况较规模化猪场严重。

非洲猪瘟病毒弱毒株感染流行病学调查分析

调查青海省非洲猪瘟病毒弱毒株感染情况并分析疫情风险,可提升青海省对非洲猪瘟的防控预警水平,为有效防控非洲猪瘟提供技术依据。通过现场问卷调查和监测的方式,在生猪养殖量较集中的西宁市、海东市及环湖沿线部分农区县(市、区)开展非洲猪瘟病毒弱病毒感染情况流行病学调查工作。结果显示,2023年生猪非瘟阳性率为0.10%,环境监测阳性率为1.85%。病毒环境污染面较广,生猪及其产品的生产、调运、屠宰及市场交易等环节防控工作仍然存在薄弱之处,亟待改善。

维氏气单胞菌弱毒株FS12001及其疫苗对异育银鲫的免疫效果

为探究由维氏气单胞菌(Av)弱毒株FS12001制备的疫苗免疫效果,将Av弱毒株FS12001制备活疫苗、灭活疫苗、ISA763A-灭活疫苗和蜂胶-灭活疫苗,腹腔注射免疫异育银鲫,同时设ISA763A佐剂、蜂胶佐剂及0.65%NaCl作为对照组。于免疫后1、3、5、7和14 d经实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测脾脏组织中IgM、IL-1β及LZM的基因表达量;于免疫后7、14、21、28、42和48 d尾静脉采血分离血清,检测IgM抗体水平,测定SOD和LZM酶活性;于免疫28 d后用2株Av强毒株分别攻毒各组实验鱼,连续观察记录7 d,计算各免疫组的相对保护率。结果显示,各免疫组脾脏组织中IgM、IL-1β及LZM的基因表达量高于对照组,且ISA763A-灭活疫苗组和蜂胶-灭活疫苗组的表达量显著高于其他各实验组。各疫苗免疫组血清特异性抗体水平均显著高于0.65%NaCl对照组和佐剂对照组。各疫苗免疫组的LZM活性均在28 d最高,灭活疫苗组、ISA763A-灭活疫苗组及蜂胶-灭活疫苗组SOD活性均在7 d最高。菌株AVCA07攻毒后,活疫苗组、灭活疫苗组、ISA763A-灭活疫苗组和蜂胶-灭活疫苗组的RPS分别为63%、56%、100%和56%;菌株YC170511攻毒后,以上4个免疫组RPS分别为59%、55%、93%和72%。研究表明,用弱毒株FS12001制备疫苗,注射免疫异育银鲫后均可增加脾脏中IgM、IL-1β及LZM的基因表达量,提高血清抗体水平,增强SOD和LZM酶活性,增强其抵抗Av感染的能力。

应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株

利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记,采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合,将其克隆至pUC19T载体,构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后,利用Cre-LoxP系统,在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签,采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定,并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株,具有良好的遗传稳定性和复制生长特性,为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株,同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。

藏香猪流行性腹泻病毒的PCR检测及毒株分型

为明确四川省凉山彝族自治州某藏香猪规模化养殖场哺乳仔猪腹泻的病因,试验采集腹泻仔猪的粪便和肠道样品进行实验室病原学诊断,采用RT-PCR方法检测4种常见肠道病毒的感染情况。检测结果显示,猪流行性腹泻病病毒(PEDV)检测为阳性,猪delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒3种病毒均为阴性。进一步采用RT-PCR扩增该毒株S1基因序列并测序。结果显示,该毒株与G2型变异毒株同源性最高,与其他基因型毒株同源性相对较低,因此判定该猪场仔猪发病是由猪流行性腹泻病毒G2型变异毒株感染所致。对病猪进行紧急免疫接种、治疗、消毒等综合防控措施,控制住了疫病的蔓延和发展。总结此次猪流行性腹泻病的治疗经验,为养猪场对该疫病的治疗和防控提供借鉴。

伪狂犬病病毒荧光标签毒株构建及其在抗病毒药物筛选中的初步应用

为筛选针对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的有效抗病毒药物,本研究以PRV人源分离毒株hSD-1/2019和经典猪源流行毒株Ea为亲本病毒,采用同源重组技术将mCherry报告基因插入到PRV的UL 35基因终止子之前位点,构建了表达红色荧光蛋白mCherry的荧光标签毒株PRV-mCherry。基于构建的荧光标签病毒,以荧光强度为指标,建立高通量药物筛选平台,对天然产物库中1621种化合物进行抗病毒药物筛选,并初步探索药物特性。结果表明,mCherry标签插入位置正确且稳定遗传,荧光标签毒株PRV-mCherry与亲本毒株在PK-15细胞上的增殖曲线趋势一致,且荧光强度可反映病毒增殖情况。使用PRV-mCherry从天然产物库中成功筛选出3种可在体外有效抑制PRV增殖的药物,根据测定的50%细胞毒性浓度和50%抑制浓度,计算出3种药物的选择指数范围为203.63~564.58μmol·L^(-1),表明其具有良好的成药性。本研究为临床防治PRV感染的抗病毒药物发掘提供了新的策略和思路。

猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析

[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81),通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化,以重组病毒感染F81细胞连续10代验证其遗传稳定性,通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP;提取重组病毒DNA,通过PCR验证gIgE基因无目的条带,表明重组病毒纯化成功,再通过PCR验证RFP基因有目的条带,表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示,与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%;在F 1—F 10连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象,表明重组病毒可稳定表达外源基因;测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线,重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,在病毒感染细胞前、后期,重组病毒的噬斑都小于亲本病毒,表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株,为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。

规模猪场猪轮状病毒优势毒株及感染情况调查

为调查猪场猪轮状病毒(PoRVA)流行毒株以及不同阶段猪群PoRVA感染情况,从某规模猪场收集PoRVA阳性样本进行VP7基因测序分析,同时采集不同阶段猪群粪便样本,采用荧光定量RT-PCR方法进行PoRVA检测,分析猪场不同阶段猪群PoRVA感染情况。结果发现:该规模猪场PoRVA流行毒株主要为G9型猪轮状病毒;各阶段猪群粪便样,其阳性率介于1.5%~42.09%,其中7~23日龄哺乳仔猪粪便样,阳性率为8.66%,24~65日龄保育猪粪便样,阳性率为42.09%,育肥猪阳性率为2.66%,母猪为1.5%;从24~42日龄临床正常(55.08%)与腹泻猪(36%)之间的PoRVA阳性率比较结果,没有发现腹泻与感染PoRVA存在相关性。

禽腺病毒4型GZ-B1毒株的Hexon基因序列分析

为了解禽腺病毒4型(FAdV-4)GZ-B1株的遗传进化情况,试验设计合成FAdV-4 Hexon基因的特异引物,对GZ-B1株Hexon基因进行PCR扩增并克隆至pMD-19T载体,基因测序和遗传进化分析。结果:扩增的Hexon基因长度为327 bp,与预期相符。GZ-B1株与国内外13株FAdV参考毒株中的7株FAdV-C毒株同源性较高(95.8%~98.5%),其中与国内强毒株GDMZ、LC1611、SDSG、SDXL同源性最高(均为98.5%),与基因型A、B、D、E的6株参考毒株同源性较低(73.0%~77.5%)。遗传进化树显示,GZ-B1株与基因型A、B、D、E毒株处于不同进化分支,与国内外C基因型毒株处于同一进化分支,表明该毒株与C基因型毒株遗传差异较小,其中与国内C型强毒株LC1611的遗传差异最小,亲缘关系最近。结论:FAdV-4 GZ-B1株属于C基因型、血清4型,与国内流行株FAdV-4 LC1611亲缘关系最近,同源性最高。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组毒株GX-C4CG6致病性探究

为评估猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组毒株GX-C4CG6对小猪的致病性,选择PRRSV抗原、抗体均为阴性的小猪进行攻毒试验,然后通过攻毒后猪只体温变化及死亡情况、临床症状评分、血清抗体变化、攻毒后平均日增重、解剖后肺脏眼观及显微病理变化、血清/肺脏病毒拷贝数等指标,对该毒株致病性进行评估。结果显示:GX-C4CG6毒株攻毒组有4头猪出现发烧,平均体温在攻毒后第12、13天大于40℃,最高体温达40.4℃,未出现死亡;被攻毒猪仅表现轻微减料,未表现出明显的呼吸障碍;攻毒后7 d,攻毒组猪只抗体开始转阳,至攻毒后14 d,攻毒组猪只ELISA抗体S/P平均值达最高;攻毒组在攻毒后第1周和对照组平均日增重差异不显著,至第2周差异显著(P<0.05),攻毒组显著低于对照组;被攻毒猪出现肺脏间质性肺炎,血清和肺脏病毒拷贝数浓度较高,分别达9.2×10^(5)和1.6×10^(7)copies/mL。结果表明,PRRSV GX-C4CG6毒株对小猪表现温和致病性。本研究为PRRSV重组毒株流行的控制提供了基础资料。

探究非洲猪瘟弱毒株防控存在的问题及策略

非洲猪瘟自2018年首次传入我国以来,各生猪养殖场户都在积极寻找合适的方法与防控技术来应对非洲猪瘟,但是目前来看,一旦生猪养殖场发生疫情,都会对养殖户造成严重经济损失。非洲猪瘟的传播速度非常快,发病率、致死率都非常高,无论是野猪,还是家猪,都非常容易被感染。非洲猪瘟与普通猪瘟的症状非常相似,目前还没有有效的药物进行治疗,也没有疫苗可以免疫预防。很多养殖户对非洲猪瘟流行毒株可能还是一知半解,认为弱毒株病毒弱,而忽视它给生猪带来的影响,最后会造成不可挽回的损失。为此本文针对非洲猪瘟弱毒株的特点和防控存在的问题进行深入分析,并提出相关策略,以期能够为生猪养殖提供科学的参考依据。

某规模猪场暴发繁殖与呼吸综合征类NADC30毒株的诊疗

某规模化养猪场在2024年1-4月期间,出现母猪流产、死胎增加的现象,仔猪死淘率升高,部分批次超过20%,送检病料检测到猪蓝耳病病毒核酸阳性且为NADC30-like毒株。本案例探讨了猪场蓝耳病毒NADC30-like毒株感染后的防控方法。

季节性流感疫苗毒株药学变更管理的探讨

世界卫生组织(WHO)每年都会对全球流行性感冒病毒进行监测,并给出相应指引,引导当年季节性流感疫苗的生产。疫苗生产企业每年根据WHO推荐的流行性感冒病毒生产当季流感疫苗。对于季节性流感疫苗毒株的变更,涉及流行性感冒监测系统,数据收集分析,疫苗株推荐,类似株/种子株筛选及分发、扩增制备,疫苗生产及检定、分发、接种等多个环节,疫苗生产企业如何进行变更管理,关系到疫苗的安全性、有效性和质量可控性。本文就季节性流感疫苗毒株药学变更的国内外法规要求、国内季节性流感疫苗毒株药学变更现状、毒株变更开展的药学工作进行了探讨,以期为疫苗生产企业季节性流感疫苗毒株药学变更管理提供参考,同时也为其他疫苗毒株药学变更管理提供思路。

当前形势下非洲猪瘟病毒弱毒株防控策略

2018年非洲猪瘟病毒(ASFV)基因Ⅱ型强度株首次传入我国境内辽宁省,之后随着病毒的基因变异和毒株重组,病毒出现了多元化、弱毒化的趋势,非洲猪瘟的鉴别诊断以及防控也变得更加困难。本文就当前非洲猪瘟常态化防控形势下,非洲猪瘟弱毒株的流行病特点、临床症状、如何鉴别诊断等方面做了介绍,并提出了具体的防控建议,以期给广大养殖户提供参考。

应用荧光定量PCR方法检测伪狂犬病病毒弱毒株在猪体组织中的分布

为了解伪狂犬病病毒(PRV)TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪体组织中的分布情况,针对PRV gB基因保守区设计并合成1对特异性引物,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法特异性强且敏感度高,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株免疫仔猪后可少量存在于大脑、小脑、肝脏、脾脏、肺脏、扁桃体和颌下淋巴结中,部分仔猪鼻甲骨病毒含量较高。应用本研究建立的荧光定量PCR方法阳性检出率为79.2%,而常规PCR方法阳性检出率仅为45.8%。结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法为了解弱毒株在猪体的分布提供了快速、敏感的检测手段。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪组织中的分布情况为进一步揭示其组织嗜性、安全性和免疫机制提供了数据。

宣肺化浊方治疗感染新型冠状病毒奥密克戎毒株的2例孕妇验案

宣肺化浊方是甘肃省防治新型冠状病毒肺炎的“甘肃方剂”之一,用于治疗湿浊阻肺型新型冠状病毒肺炎患者。本次奥密克戎毒株新型冠状病毒肺炎在甘肃省呈现的致病特征为湿毒疫邪,以疫毒兼夹湿邪为主。孕妇是新型冠状病毒肺炎的特殊易感人群,本研究对应用宣肺化浊方治疗感染新型冠状病毒奥密克戎毒株的2例孕妇验案进行报告,观察其效果。

儿童与成人新型冠状病毒肺炎Delta毒株合并肝损伤特征分析

目的探讨新型冠状病毒肺炎(COVID-2019)Delta毒株患者合并肝损伤的临床特征及影响因素。方法纳入2021年11月至12月河南省新型冠状病毒(SARS-CoV-2)定点收治医院确诊的Delta毒株新型冠状病毒肺炎79例患者。按照肝功能状态及年龄,将病例分为肝功能异常组(n=16)和肝功能正常组(n=63)、儿童组(n=50)和成人组(n=29),检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素(TBIL)、乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞、C-反应蛋白(CRP)、淋巴细胞计数、总T淋巴细胞计数、辅助/诱导T淋巴细胞计数(CD4^(+)T)、白介素6(IL-6)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酐(Cr)及Delta毒株核酸Ct值等水平,两组计量资料比较,不符合正态分布的采用非参数检验(秩和检验);计数资料采用Fisher精确概率检验。总结分析COVID-2019 Delta毒株合并肝损伤的原因及特征。结果与肝功能正常组相比,肝功能异常组患者淋巴细胞计数、总T淋巴细胞计数均显著减少(P<0.05);儿童组肝功能异常率明显低于成人组(P<0.05),但儿童组肝功能指标LDH则高于成人组(P<0.05);各组间患者鼻咽拭子SARS-CoV-2 Delta毒株核酸Ct值比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论COVID-2019 Delta毒株感染患者在各年龄段均会出现不同程度肝损伤,其中淋巴细胞及T淋巴细胞计数减少与肝损伤发生密切相关,在轻型及普通型患者中儿童组肝功能异常率低于成人组,肝功能指标LDH水平可作为评估儿童早期肝损伤的重要依据。

PCV3吉林野毒株全基因组序列分析及其Cap蛋白的亚细胞定位

为了研究吉林省猪圆环病毒3型(PCV3)野毒株遗传变异情况及其衣壳蛋白(Cap)的亚细胞定位特征,本试验对收集到的10株PCV3吉林野毒株进行全基因组序列测定和分析,并构建真核表达载体pcDNA3.1V5/HisA-Cap转染猪肺巨噬细胞(PAM);继而用本实验室已构建的兔源PCV3-Cap多克隆抗体,通过激光共聚焦检测Cap蛋白在PAM中的定位。序列分析结果显示,10株PCV3吉林野毒株与国内外参考株之间的全基因组核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,处于PCV3a和PCV3b两个亚群;基因重组分析结果显示,仅中国参考株MF589102(2016年)、MH445396(2019年)和分离株JL-2在80~303 nt、840~1196 nt和1885~2001 nt处发生3处重组。激光共聚焦检测结果显示,Cap蛋白大部分定位于细胞核,少部分定位于细胞质。结果表明,目前吉林省PCV3比较保守,没有出现较大变异,Cap蛋白在PAM的细胞核和细胞质中均有分布。

黄酮类单体抗奥密克戎毒株药理活性研究

目的探讨黄酮类单体化合物抗新型冠状病毒的药理活性及作用机制。方法利用Autodock Vina分子对接软件将橙皮素、橙皮苷、芹菜苷、木犀草素、木犀草素-4’-葡萄糖苷对接到新型冠状病毒RNA聚合酶三维结构7BV2的底物结合位点处,研究化合物分子与靶酶活性位点之间的相互作用;并利用奥密克戎毒株转染的Vero细胞模型测试这些黄酮类化合物单体的抗病毒活性。结果橙皮素、橙皮苷、芹菜苷、木犀草素、木犀草素-4’-葡萄糖苷均可竞争性地结合于靶酶7BV2的底物进入通道处从而阻碍正常的核苷酸类底物进入,故可对靶酶执行的核酸复制生物学功能起到抑制作用;初步细胞水平抗病毒活性测试实验发现橙皮素和木犀草素具有明显地抑制奥密克戎毒株核酸复制的药理作用,而橙皮苷、芹菜苷、木犀草素-4’-葡萄糖苷抗病毒活性较弱。结论经初步实验发现,橙皮素和木犀草素具有一定的抗新型冠状病毒及其变异株的药理活性,可作为先导化合物行进一步开发,实验数据可为抗新型冠状病毒药物开发提供一定参考。