机械通气相关高拉伸通过miRNA-mRNA相互作用调节气道平滑肌细胞嘌呤代谢影响细胞刚度

目的机械通气为呼吸危重症患者提供生命支持,但也引起肺损伤(VILI),后者因病理机制不明一直是呼吸与危重症学科的重大难题。气道平滑肌细胞(ASMC)是气道内对拉伸极为敏感细胞,但ASMC在VILI中的作用及其机制尚不清楚。本研究结合全基因组测序、生物力学和细胞分子生物学相关方法,在机械通气相关高拉伸条件下分析ASMC对机械通气的主要响应机制及力学调控作用。方法采用Flexcell-5000在体外高拉伸(13%)处理人ASMC,全基因组测序分析细胞mi RNA和m RNA表达并进行mi RNA-m RNA生物信息学的整合分析,光学磁微粒扭转系统、牵张力显微术分析细胞力学特性。结果全基因组学mi RNA-m RNA整合分析发现机械通气相关高拉伸主要通过影响mi RNA-m RNA相互作用调节ASMC嘌呤代谢,如通过mi R-370-5p(↓)-PDE4D/AK7(↑)调节ATP、c AMP合成;体外细胞水平研究发现高拉伸调节ASMC内的c AMP/ATP并改变ASMC细胞刚度,且可以被mi R-370-5p模拟物部分逆转。结论本研究揭示了机械通气相关高拉伸(>10%应变)通过调控mi RNA-m RNA网络调节ASMC力学行为从而影响肺功能,为VILI的生物标志物筛选及新型治疗靶点提供新见解。

抑制Rho/ROCK通路对气道平滑肌细胞增殖与迁移的影响及相关机制

目的研究抑制Ras同源基因(Ras homolog gene,Rho)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rhoassociated coiled-coil forming protein kinase,ROCK)通路对心肌素(myocardin,MYOCD)参与的气道平滑肌细胞增殖与迁移的影响及分子机制。方法体外构建腺病毒载体Ad-ZsGreen-shRNA-hROCK1感染人气道平滑肌细胞,将细胞随机分为4组:ROCK1基因沉默对照(shNC)组、shNC+花生四烯酸(arachidonic acid,AA;Rho/ROCK通路激活剂)组、ROCK1基因沉默(shROCK1)组、shROCK1+AA组(各组n=3)。采用实时荧光定量聚合酶链反应法、Western blot法检测ROCK1、MYOCD mRNA和蛋白表达水平,ELISA法检测球状肌动蛋白和丝状肌动蛋白水平,免疫荧光染色法及细胞划痕实验检测细胞增殖及迁移情况。结果与shNC+AA组相比,shROCK1+AA组ROCK1、MYOCD mRNA和蛋白表达水平降低,球状肌动蛋白、丝状肌动蛋白表达降低,细胞增殖、细胞迁移能力降低(P<0.05)。结论抑制Rho/ROCK通路致气道平滑肌细胞增殖及迁移能力受抑,其机制可能与MYOCD的下调有关.

β1,4-半乳糖基转移酶1对气道平滑肌细胞炎症反应的影响

为了探究β1,4-半乳糖基转移酶1(β4GalT1)在气道平滑肌细胞中的功能,通过高通量基因表达数据库(GEO)分析β4GalT1在气道平滑肌细胞炎症反应存在功能,采用脂多糖刺激气道平滑肌细胞后检测白介素1β及β4GalT1的表达;采用慢病毒包装构建过表达β4GalT1的稳转细胞,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测稳转细胞中炎症相关细胞因子表达随时间的变化,同时通过细胞增殖实验、细胞周期和划痕实验检测稳转细胞的生物学行为变化,研究过表达β4GalT1的细胞分泌液在调节细胞因子表达过程中的作用。结果表明:脂多糖能引起白介素1β及β4GalT1的表达量增加;随着培养时间的延长,过表达β4GalT1的细胞中促炎因子表达量减小,抑炎因子表达量增加,同时过表达β4GalT1可改变气道平滑肌细胞的增殖、迁移行为,进而起到炎症修复功能;过表达β4GalT1的细胞可通过分泌液调节细胞因子的表达,表明β4GalT1能快速响应对气道平滑肌细胞的炎症刺激,并通过分泌物质调节气道平滑肌细胞的细胞行为及细胞因子变化。

噻托溴铵调控MAPK/NF-κB信号通路对气道平滑肌细胞增殖的影响及机制研究

目的探究噻托溴铵通过MAPK/NF-κB信号通路对哮喘的影响及其潜在的机制。方法用10 ng·mL^(-1)血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)-BB和不同浓度(0、5、10、20、50μmol·L^(-1))噻托溴铵处理气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs),并通过CCK-8实验、克隆形成实验、划痕愈合实验和Transwell法分析ASMCs细胞增殖、迁移和侵袭;Western blot分析MMP2、MMP9、calponin和α-SMA的蛋白水平;Western blot检测MAPK/NF-κB信号通路的水平。结果噻托溴铵抑制PDGF-BB诱导的ASMCs的增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。噻托溴铵调节ASMCs的表型转变(P<0.05)。噻托溴铵可以抑制PDGF-BB诱导的MAPK/NF-κB信号通路激活,降低p-38、p-JNK、p-ERK、p-p65、p-NF-κB的表达(P<0.05)。结论噻托溴铵可以通过阻断MAPK/NF-κB信号转导抑制ASMCs的增殖和迁移。推测噻托溴铵可以作为一种治疗哮喘的有前途的药物。

机械通气诱导气道塌陷中气道平滑肌细胞力学行为异常的研究进展

机械通气为呼吸危重症患者提供生命支持,但也引起致命的肺损伤(ventilator induced lung injury,VILI),后者因病理机制不明一直是呼吸与危重症学科的重大难题。近年的研究发现,一方面VILI伴随同一气道多点塌陷现象,但这一现象很难用传统塌陷模型加以解释。另一方面,机械通气条件下气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMC)发生力学行为异常并伴随Piezo1表达变化和内质网应激等现象。这些现象显示,机械通气导致ASMC的力学行为异常与气道多点塌陷以及VILI密切相关。但要从细胞力学角度解释机械通气导致气道塌陷和VILI的机制,还需要系统深入地研究机械通气条件下ASMC力学行为变化规律与气道塌陷和肺损伤的相互关系及其力-化学信号耦合过程。本文综述了近期有关机械通气条件下气道塌陷现象、机械通气相关高拉伸对ASMC力学行为的调控及力-化学信号耦合机制等方面的研究进展,以期为进一步探索ASMC力学行为异常在VILI病理机制中的作用、有效防治VILI的新药干预靶点,以及临床优化的机械通气策略等提供重要的参考依据和启发性的研究思路。

自噬与哮喘中气道平滑肌细胞表型转化关系的研究进展

支气管哮喘是常见的呼吸道疾病,发病机制尚未完全阐明。气道重塑作为哮喘的关键特征之一,在哮喘早期即可发生。气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell,ASMC)是哮喘气道重塑的关键靶细胞,其表型从正常收缩型向增殖/合成型转化是气道重塑的重要特征之一。ASMC具有可塑性,其表型可受多种因素调节。自噬作为真核细胞生物的一种防御性保守生物过程,近年来被证实可通过调节ASMC的表型参与气道重塑。本文针对哮喘中自噬对ASMC表型的调控机制进行综述,以期对未来研究有所启发。

金银花提取物对哮喘模型小鼠气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨金银花提取物对哮喘小鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖和凋亡的影响,阐明其相关的作用机制。方法:构建小鼠哮喘模型,分离原代ASMCs并进行鉴定。采用白细胞介素4(IL-4)诱导巨噬细胞RAW264.7 M2极化并进行鉴定。RAW264.7细胞分为对照组及低、中和高剂量金银花提取物组,对照组诱导RAW264.7细胞M2极化后与ASMCs共培养,低、中和高剂量金银花提取物组分别用不同浓度(50、100和200 mg·L^(-1))金银花提取物处理RAW264.7细胞1 h,再用60μg·L^(-1)IL-4处理6 h,随后将ASMCs与RAW264.7细胞共培养24 h。流式细胞术检测各组RAW264.7细胞中巨噬细胞表面标记蛋白CD86和CD206阳性细胞百分率,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组ASMCs培养上清液中白细胞介素10(IL-10)水平,MTT法检测各组ASMCs增殖活性,流式细胞术检测各组ASMCs凋亡率。结果:细胞形态表现和免疫荧光染色结果证明所提取的细胞为ASMCs。RAW264.7细胞M2极化鉴定结果显示已诱导成为M2巨噬细胞。与对照组比较,低、中和高剂量金银花提取物组RAW264.7细胞中CD86阳性细胞百分率明显升高(P<0.05),CD206阳性细胞百分率明显降低(P<0.05),ASMCs培养上清液中IL-10水平和ASMCs增殖活性明显降低(P<0.05),ASMCs凋亡率明显升高(P<0.05);与低剂量金银花提取物组比较,中和高剂量金银花提取物组RAW264.7细胞中CD86阳性细胞百分率明显升高(P<0.05),CD206阳性细胞百分率明显降低(P<0.05),ASMCs培养上清液中IL-10水平和AMSC增殖活性明显降低(P<0.05),ASMCs凋亡率明显升高(P<0.05);与中剂量金银花提取物组比较,高剂量金银花提取物组RAW264.7细胞中CD86阳性细胞百分率明显升高(P<0.05),CD206阳性细胞百分率明显降低(P<0.05),ASMCs培养上清液中IL-10水平和ASMCs增殖活性明显降低(P<0.05),ASMCs凋亡率明显升高(P<0.05)。结论:金银花提取物可通过抑制巨噬细胞M2极化进而抑制哮喘小鼠ASMCs细胞增殖并促进其凋亡。

阿司匹林对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的探讨阿司匹林对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法选取30只SD大鼠作为研究对象,随机取10只作为对照组,其余20只建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型,造模成功后随机均分为模型组及阿司匹林组,阿司匹林组给予100 mg/kg的阿司匹林灌胃,对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃,连续30 d;灌胃结束后,提取大鼠肺组织进行苏木精-伊红(HE)染色法观察肺组织受损情况,采用Western blot实验检测其凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白质(Bax)的表达;取大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs),采用MTT检测细胞活力、Western blot实验检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2及Bax的表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果HE染色结果证明阿司匹林对肺部气道平滑肌组织具有较好的保护作用;MTT检测发现阿司匹林可以抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠ASMCs细胞的增殖能力;Western blot实验发现模型组ASMCs中PCNA蛋白表达水平较对照组升高,阿司匹林组ASMCs中PCNA蛋白表达水平较模型组降低(P<0.05);流式细胞术和Western blot实验证明,模型组ASMCs中Bcl-2/Bax比值较对照组升高,阿司匹林组ASMCs中Bcl-2/Bax比值较模型组降低(P<0.05)。结论阿司匹林可以抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌的增殖并诱导细胞凋亡,还可改善气道重塑以达到延缓慢性阻塞性肺疾病的病程。

钩藤碱固体脂质纳米粒抑制哮喘模型小鼠气道平滑肌细胞增殖的作用机制

目的研究钩藤碱固体脂质纳米粒(Rhy-SLN)抑制哮喘模型小鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖的作用机制。方法采用卵清蛋白+氢氧化铝过敏法制备哮喘模型小鼠,然后原代分离培养ASMCs并进行形态观察和鉴定[当ASMCs内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈红色,结蛋白(Desmin)呈绿色,表明ASMCs培养成功];将细胞分为空白组(正常小鼠ASMCs)、模型组(哮喘模型小鼠ASMCs)、Rhy-SLN组(哮喘模型小鼠ASMCs)、细胞因子信号转导抑制蛋白1(SOCS1)过表达组(转染SOCS1过表达载体的哮喘模型小鼠ASMCs)、SOCS1-RNAi组(转染SOCS1-RNAi载体的哮喘模型小鼠ASMCs)、SB203580组[p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂,哮喘模型小鼠ASMCs]。各组加入相应含药(均为10μmol/L)或不含药培养基培养24 h。采用MTT法检测ASMCs增殖,采用Western blot法检测ASMCs中α-SMA、白细胞介素1β(IL-1β)、SOCS1、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)蛋白表达水平。结果小鼠原代ASMCs形态大小不一,呈不规则形、梭形、三角形;细胞内α-SMA呈红色,Desmin呈绿色,表明ASMCs培养成功。与模型组比较,Rhy-SLN组、SOCS1过表达组和SB203580组ASMCs吸光度值及α-SMA、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达水平均显著降低,SOCS1蛋白表达水平(SB203580组除外)显著升高(P<0.05);Rhy-SLN组ASMCs中IL-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.05);SOCS1-RNAi组ASMCs吸光度值及α-SMA、SOCS1、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。结论Rhy-SLN可抑制AMSCs增殖,其作用机制可能与促进SOCS1过表达,抑制IL-1β、p38 MAPK蛋白表达有关。

半夏提取物通过AMPK/FOXO3a信号通路对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨半夏提取物(EP)对哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖、凋亡的影响及作用机制。方法:采用卵清蛋白致敏和激发方式构建哮喘大鼠模型,分离并培养大鼠ASMCs,免疫荧光染色鉴定ASMCs中的α-肌动蛋白(α-actin),符合ASMCs特征后将ASMCs分为对照组、模型组、EP组、Compound C组、EP+Compound C组,MTT检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清中炎症因子IL-6、TNF-α水平;Western blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK、叉头框蛋白O3a(FOXO3a)、p-FOXO3a蛋白表达。结果:免疫荧光染色显示98%细胞的细胞质中呈现绿色荧光的肌丝,α-actin呈阳性表达,证明培养的细胞为ASMCs。与对照组比较,模型组细胞OD490、CyclinD1、PCNA蛋白表达及上清中IL-6、TNF-α水平显著升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3蛋白表达及p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,EP组细胞OD490、CyclinD1、PCNA蛋白表达及上清中IL-6、TNF-α水平显著降低,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3蛋白表达及p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平显著升高(P<0.05),而Compound C组上述对应指标呈相反趋势(P<0.05);与EP组比较,EP+Compound C组细胞OD490、CyclinD1、PCNA蛋白表达及上清中IL-6、TNF-α水平显著升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3蛋白表达及p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平显著降低(P<0.05)。结论:EP可能通过激活AMPK/FOXO3a通路抑制哮喘大鼠ASMCs增殖,促进细胞凋亡。

改良组织块贴壁法培养小鼠气道平滑肌细胞及鉴定

目的采用改良组织块贴壁法建立小鼠气道平滑肌细胞体外培养模型。方法用I型胶原酶消化小鼠气道平滑肌组织块后再贴壁,培养出的小鼠原代气道平滑肌细胞经过细胞免疫荧光技术鉴定。结果相比单纯组织块贴壁法,改良组织块贴壁法获得的原代平滑肌细胞的纯度更高[(93.0%±1.8%)vs(96.1%±1.8%),P<0.01],酶消化法获得的平滑肌细胞的纯度(90.8%±1.9%)最低,与改良组织块贴壁法相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。结果还显示P5代细胞与P1代细胞相比,平滑肌细胞生长形态较前改变,呈不规则形,且α⁃SMA阳性表达减弱,Vimentin阳性表达增强,标志着平滑肌细胞的纯度会随传代次数增加而逐渐降低。酶消化法获得的ASMCs的增殖速度较单纯组织块贴壁法和改良组织块贴壁法获得的ASMCs的增殖速度慢(P<0.01)。结论改良组织块贴壁法经济稳定,可在短期内培养出数量多、纯度高、活性好的小鼠气道平滑肌细胞,此法成功建立了体外培养小鼠气道平滑肌细胞的模型。

苗药吉祥草含药血清对气道平滑肌细胞增殖及IL-1β/COX-2信号通路的作用机制

目的 探究苗药吉祥草血清对气道平滑肌细胞增殖及白细胞介素(IL)-1β/环氧合酶(COX)-2信号通路的作用机制。方法 制备苗药吉祥草含药血清,分离并鉴定气道平滑肌细胞,把细胞分为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。CCK-8检测细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中IL-1β和COX-2的含量;Western印迹检测细胞中IL-1β和COX-2蛋白表达。结果 鉴定发现本实验所分离培养的细胞为ASMCs。与空白组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞在48和72 h时ASMCs细胞增殖能力、IL-1β和COX-2明显降低,凋亡率显著增加,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论 苗药吉祥草血清可抑制气道平滑肌细胞增殖,促进其凋亡;对细胞中炎性因子IL-1β和COX-2表达也能进行有效的抑制。

miR-339对气道平滑肌细胞增殖及ERK1/2通路的影响

目的对miR-339进行过表达后,探究其对气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖及细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路的影响。方法体外培养ASMCs细胞,设置对照组、模型组(5μg·L^(-1)TGF-β_(1))、miR-NC组(miR-NC+5μg·L^(-1)TGF-β_(1))、miR-339 mimics组(miR-339 mimics+5μg·L^(-1)TGF-β_(1))、miR-339 mimics+PD98059组(miR-339 mimics+10μmol·L^(-1)ERK1/2抑制剂PD98059+5μg·L^(-1)TGF-β_(1))。采用qRT-PCR检测各组miR-339的表达;MTT法检测ASMCs细胞活力;流式细胞术检测ASMCs细胞凋亡情况;Western blot检测ASMCs细胞内增殖、凋亡及通路相关蛋白表达情况。结果与对照组相比,模型组ASMCs细胞存活率、c-Myc、CyclinD1、PCNA、Bcl-2、p-ERK1/2/ERK1/2表达水平显著增加(P<0.05),细胞凋亡率、Caspase-3、Bax表达水平显著降低(P<0.05);miR-339 mimics组与模型组比较、miR-339 mimics+PD98059组与miR-339 mimics组比较,ASMCs细胞存活率、c-Myc、CyclinD1、PCNA、Bcl-2、p-ERK1/2/ERK1/2表达水平均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、Caspase-3、Bax表达水平均显著增加(P<0.05)。结论miR-339过表达对ASMCs细胞增殖的抑制,可能与抑制ERK1/2信号通路有关。

参芪补肺汤对慢阻肺大鼠气道平滑肌细胞中相关因子的影响

目的探讨参芪补肺汤对慢阻肺（COPD）大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖中组蛋白去乙酰基酶2（HADC2）、乙酰化组蛋白 H4表达的影响。方法将 SD 大鼠随机分为正常组和 COPD 模型组。原代培养大鼠 ASMCs 取4-6代细胞，分为空白组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组和氨茶碱组。其中空白组为正常培养 ASMCs，不予处理。模型组、中药低、高剂量组和氨茶碱组为 COPD 模型组培养 ASMCs，模型组加入香烟提取物（CSE）及正常组大鼠血清；中药低剂量组加入 CSE 及中药低剂量组大鼠血清；中药高剂量组加入 CSE 及中药高剂量组大鼠血清；氨茶碱组加入CSE 及氨茶碱。细胞免疫组织化学检测大鼠 ASMCs 增殖细胞核抗原（PCNA）及各组 ASMCs 中 HDAC2、H4蛋白的表达。结果与空白组比较，模型组大鼠 ASMCs 明显增殖，ASMCs 中的 HDAC2表达明显降低，乙酰化组蛋白 H4表达明显增高（P＜0．05）。与模型组比较，中药低剂量组 ASMCs 增殖和 HDAC2、乙酰化组蛋白 H4表达无统计学差异（P＞0．05）；中药高剂量组 ASMCs 平滑肌细胞增殖明显下降，ASMCs 中的 HDAC2表达明显增高，乙酰化组蛋白 H4的表达明显降低（P＜0．05）；氨茶碱组 ASMCs 增殖降低、ASMCs 中的 HDAC2表达明显增高（P＜0．05），乙酰化组蛋白 H4表达无统计学差异（P＞0．05）。结论参芪补肺汤可抑制 ASMCs 增殖，其机制可能通过提高 ASMCs 中 HDAC2的表达、抑制组蛋白 H4的表达，影响其平衡状态发挥作用。

ERK信号通道调控大鼠气道平滑肌细胞的增殖与凋亡(英文)

为了了解ERK信号通道对正常大鼠气道平滑肌细胞（aimay smooth nilscle cells，ASMCs）增殖与凋亡的调控．通过对正常大鼠ASMCs原代培养，4～7代用于实验，以ERK激动剂表皮生长因子（EGF）和抑制剂PD98059干预ASMCs生长，采用RT-PCR和免疫荧光染色观察ASMCs上ERK mRNA和蛋白的表达，MTT法、^3H-TdR掺入法检测ASMC增殖，Hoechst染色和Annexin-Ⅴ FITC PI双染色法检测细胞凋亡，Western免疫印迹检测ERK1／2、磷酸化ERK1／2和proeaspase-3蛋白的表达。结果发现ASMCs上存在ERK mRNA和蛋白的表达，与空白对照组比较，PD98059干预后ASMCs的A490值和细胞DNA合成量均减少（P〈0．05），细胞凋亡指数、早期凋亡细胞百分率均增高（P〈0．05），ERK1／2、磷酸化ERK1／2表达和ERK活化率均降低，procaspase-3蛋白的表达增高．EGF干预后ASMCs的A490值和细胞DNA合成量均增高（P〈0．05），细胞凋亡指数、早期凋亡细胞百分率均下降（P〈0.05），ERK1／2、磷酸化ERK1／2表达和ERK活化率均增高，procaspase-3蛋白的表达降低．P＋E组无明显差异（P〉0．05）．ERK信号通道参与大鼠ASMCs增殖和凋亡的调控，ERK对大鼠ASMCs凋亡的调控与proeaspase-3蛋白有关，这一发现将有助于对哮喘ASMCs异常增殖调控机制的深入研究．

1,25-二羟维生素D_3负性调控被动致敏人气道平滑肌细胞中的NF-κB信号通路

目的:探讨1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2D3]对被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs)中核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:原代培养HASMCs并使之被动致敏,以1,25-(OH)2D3作为干预因素。EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性;免疫细胞化学染色技术观察NF-κB p65的核易位情况;Western blotting法检测核因子κB抑制蛋白α(IκBα)及p-IκBα蛋白的表达水平;实时荧光定量PCR检测维生素D受体(VDR)、维生素D 24-羟化酶(CYP24)和IκBαmRNA的表达水平;放线菌素D处理实验检测IκBαmRNA的表达。结果:(1)1,25-(OH)2D3显著削弱被动致敏HASMCs中NF-κB的DNA结合活性及其亚单位p65的核易位;(2)1,25-(OH)2D3能通过增加被动致敏HASMCs中IκBα的mRNA稳定性及减少其蛋白磷酸化水平2个途径显著上调细胞中IκBα的表达;(3)1,25-(OH)2D3显著上调被动致敏HASMCs中VDR的mRNA表达并诱发其功能性反应。结论:1,25-(OH)2D3能通过上调被动致敏HASMCs中IκBα的表达抑制细胞NF-κB信号通路,且这一作用与VDR有关,这可能是其调控被动致敏HASMCs的重要作用机制。

1,25-二羟维生素D_3抑制被动致敏人气道平滑肌细胞的增殖

目的:检测1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2D3]对被动致敏的人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖的调节作用,探讨其对哮喘气道重塑的可能作用。方法:离体培养HASMCs,并将细胞分为对照组、哮喘组及1,25-(OH)2D3组。MTT法检测细胞增殖活力并确定1,25-(OH)2D3最佳作用浓度;用最佳作用浓度刺激HASMCs 48 h后以流式细胞术测定细胞周期,免疫细胞化学染色(SABC法)检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果:1,25-(OH)2D3在10-9-10-7 mol/L范围内能显著抑制哮喘血清被动致敏的HASMCs增殖(P<0.05),且10-7 mol/L时抑制作用最强;流式细胞术检测显示这一最佳作用浓度的1,25-(OH)2D3能显著抑制被动致敏HASMCs由G0/G1期向S期的转化;此外,1,25-(OH)2D3能显著抑制被动致敏HASMCs中PCNA的表达。结论:1,25-(OH)2D3能抑制哮喘血清被动致敏的HASMCs增殖,有助于哮喘气道重塑的防治。

哮喘豚鼠气道平滑肌细胞内钙释放通道的变化

目的检测哮喘豚鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)内钙释放通道功能的改变,探讨与支气管哮喘的关系,同时,寻找传代培养ASMCs的方法。方法以Flou-3/AM为细胞内钙离子示踪剂,观察ASMCs在工具药作用下细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的改变。结果①在ASMCs外无钙情况下,不同浓度ryanodine(5×10-5,10-4,2×10-4mol·L-1)作用于原代培养正常与哮喘ASMCs,[Ca2+]i迅速升高,哮喘组明显高于正常组(P<0·01)。10-4mol·L-1的组织胺(hista-mine)作用于原代培养的正常组与哮喘组ASMCs,[Ca2+]i升高无差异(P>0·05)。②传代培养哮喘ASMCs在10-4、2×10-4mol·L-1ryanodine作用下,[Ca2+]i迅速升高,与原代细胞比较无差异(P>0·05)。在浓度为5×10-5mol·L-1时,原代明显高于传代(P<0.01)。哮喘组传代ASMCs对10-4mol·L-1的histamine反应不明显。结论哮喘豚鼠ASMCs内钙释放通道(RyRs)功能升高,特定条件下,哮喘传代细胞仍然保持原代细胞内钙释放通道的特性。

小青龙汤含药血清对内皮素-1诱导的气道平滑肌细胞增殖作用的影响

目的:观察小青龙汤含药血清对内皮素-1(ET-1)诱导的气道平滑肌细胞(ASMC)增殖作用的影响。方法:实验分6组,正常组(10%正常对照组血清)、模型组(ET-1加10%正常对照组血清)、小青龙汤高剂量组(ET-1加10%小青龙汤高剂量组血清)、小青龙汤中剂量(ET-1加10%小青龙汤中剂量组血清)、小青龙汤低剂量组(ET-1加10%小青龙汤低剂量组血清)、地塞米松组(ET-1加10%地塞米松组血清),每组8孔。采用MTT比色法检测ASMC 24h、48h、72h增殖情况。结果:与模型组比较,小青龙汤低剂量组含药血清各期及中剂量组24h、72h对ASMC增殖均有显著性差异(P<0.05);小青龙汤高剂量组各期、中剂量组48h及地塞米松组各期均有极显著性差异(P<0.01)。结论:小青龙汤药物血清能有效抑制ET-1诱导的ASMC增殖作用,可知抑制哮喘大鼠平滑肌增殖是小青龙汤影响哮喘大鼠气道重建的途径之一。