非洲猪瘟病毒p30蛋白氨基酸序列分段表达及反应原性分析

为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,经IPTG诱导、Ni柱纯化、透析后,获得p30蛋白氨基酸序列中8~101 aa片段(P-1#)、58~101 aa片段(P-2#)、101~158 aa片段(P-3#)、8~194 aa片段(P-4#),用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析p30蛋白氨基酸序列中不同片段与p30蛋白免疫兔血清和ASFV阳性猪血清的反应原性。结果显示,上述片段均获得诱导表达及纯化,表达形式有可溶性表达(P-1#、P-3#)和包涵体表达(P-2#、P-4#)。各片段以1.0 mg/L包被时,p30免疫兔血清与p30蛋白氨基酸序列中4种片段均能发生免疫反应,ASFV阳性猪血清与P-4#、P-1#反应较佳,与P-3#反应中等,与P-2#反应最弱。综上,p30蛋白氨基酸序列中不同片段反应原性的差异为认识p30抗原优势区域提供了数据,这将有助于非洲猪瘟血清学诊断抗原的科学筛选。

氨基酸序列分析揭示苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶在陆生植物中的演化

苯丙烷途径在陆生植物木质素和黄酮类等次生代谢产物的生物合成中至关重要,其中一步必需的反应为苯丙氨酸解氨酶(PAL)将底物苯丙氨酸脱氨催化为下游产物。最新研究发现了能够同时催化苯丙氨酸和酪氨酸脱氨的双功能酶—苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶(PTAL),但是对诸多问题,例如怎样精准鉴定PAL和PTAL、植物PAL演化为PTAL其氨基酸序列发生了什么变异、哪些植物类群包含PTAL等,仍属未知。为了探索PAL基因家族在陆生植物中的演化及关键变异,本研究利用PAL氨基酸全长序列构建了陆生植物不同类群系统发育树,比较和分析了PAL和PTAL氨基酸序列并模拟了其蛋白质三维构象。结果表明,以PAL氨基酸序列构建的系统发育树,能够反映已知陆生植物的系统关系,PAL和PTAL的氨基酸序列中存在着8个差异位点,其中121和123这两个关键位点非常稳定,可以联合用于准确鉴定包含PAL和PTAL的植物,并且I121L和F123H的关键变异,导致只能与苯丙氨酸结合的PAL演化为也能同时结合酪氨酸的PTAL。

新型桶形芋螺毒素BtIIIB的分离纯化、氨基酸序列测定及二硫键定位研究

采用凝胶色谱、高效液相色谱等方法从栖息于我国南海的桶形芋螺的毒液中纯化出一个新的芋螺毒素BtIIIB.采用氨基酸组成分析、质谱分析和Edman降解测定BtIIIB为15肽,其氨基酸序列为:CCELPCHGCVPCCWP.结构中含有6个半胱氨酸,形成3对分子内二硫键.采用部分还原的方法,分步还原毒素中的二硫键,用氰基化试剂衍生生成巯基,然后在碱性条件下将衍生的产物进行裂解,用MALDI-TOFMS测定裂解后片段的分子量,确定了其二硫键的配对方式为Cys1-Cys13,Cys2-Cys9,Cys6-Cys12的部分交叉式结构,是芋螺毒素中比较特别的配对方式.

人DAO氨基酸序列片段B-细胞表位的多参数预测

目的预测人二氨氧化酶 ( DAO)氨基酸序列片段 ( aa No.5 2 4- 6 18)的 B-细胞表位。方法应用 6种参数和方法进行综合分析 ,包括 Hopp & Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数、β-转角、万氏及吴氏综合预测方法。结果显示 B-细胞识别的表位可能在 5 43- 5 5 3和 5 6 9- 5 95残基或其附近 ,5 6 9- 5 95残基 4种参数和方法的预测值均高于 5 43- 5 5 3残基 ,这两个被预测的表位均含有β-转角和不规则卷曲结构。结论本研究为应用合成肽抗原制备抗人

铜绿假单胞菌AmpC酶基因、调控基因及氨基酸序列研究

目的 测定不同耐药谱铜绿假单胞菌AmpC酶ampC基因、调控基因及氨基酸序列。方法 筛选铜绿假单胞菌株 6株 ,获取AmpC酶及鉴定 ,菌落PCR扩增目的基因片段 ,鉴定产物 ,测序。结果 测出了铜绿假单胞菌AmpC酶部分ampC基因、调控基因ampR、ampD及部分ampE的核苷酸序列。结论 所观察耐药菌株的ampC基因和调控基因ampR、ampD及ampE与标准菌株染色体介导的AmpC酶基因及氨基酸序列具有同源性 ;发现一些新突变位点。

孔石莼质体蓝素氨基酸序列分析和分子进化

以孔石莼(Ulvapertusa)质体蓝素氨基酸序列在NCBI以BLASTp进行同源性检索,将获得具有一定同源性的不同生物的质体蓝素氨基酸序列进行生物信息学分析。共比较37种生物的38个氨基酸序列,包括13种藻类,1种苔藓,23种陆生被子植物的24个氨基酸序列。发现孔石莼质体蓝素的氨基酸序列与其它序列的同源性从26.4%￣88.8%不等,所有生物的质体蓝素氨基酸序列表现出较大的保守性和进化性;基于不同生物质体蓝素成熟肽的氨基酸序列之间的同源性,构建了它们的系统进化树,这些系统进化树能够较准确地表现各种生物系统进化关系,可以说生物的质体蓝素的氨基酸序列可作为生物系统进化的一个分子依据。

无指盘臭蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与氨基酸序列测定

在抗菌活性跟踪下对四川冕宁产无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤分泌物进行一系列层析分离,最终纯化得到4种抗菌肽,分别命名为Odorgrin A、Odorgrin B、Odorgrin C和Odorgrin D.质谱测得单一同位素分子量Mr分别为3364.8、3817.9、4859.4和3287.9.Edman降解法测得OdorgrinA的氨基酸序列为GLLDTFKNLALNAAKSAGVSV-LNSLSCKLSKTC.将以上结果与国内外对该物种抗菌肽研究的已有结果进行了比较分析,证明本研究分离到的4种抗菌肽与前人分离到的部分抗菌肽间具有一致性.

猪釉基质蛋白的提取及N末端氨基酸序列分析

目的：从猪牙胚提取釉基质蛋白并做氨基酸测序，为进一步研究釉基质蛋白诱导牙周组织再生的生物活性奠定基础。方法：选择乙酸提取法获得釉基质蛋白，采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和印迹膜测序法分析Ｎ末端氨基酸序列。结果：提取的釉基质蛋白分子量条带主要位于２０ＫＤａ以下，优势条带为２０ＫＤａ、１３ＫＤａ、５ＫＤａ。２０ＫＤａ、５ＫＤａ釉基质蛋白Ｎ末端前１０个氨基酸残基均为：Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ。结论：乙酸提取法可获得典型的釉原蛋白。印迹膜测序法简易、快速、敏感。

竹叶青蛇毒凝血酶样酶氨基酸序列报道

蛇毒凝血酶样酶可作为蛋白酶结构与功能研究的良好模型，并已广泛用于各种血栓疾病的诊断和治疗，因而测定其一级结构具有重要意义．利用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法，扩增出竹叶青蛇毒凝血酶样酶（ＴＳＶ－ＴＥＬ１）的ｃＤＮＡ；将扩增的ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，经末端终止法测定核苷酸序列，推导出竹叶青蛇毒凝血酶样酶的全序列．竹叶青蛇毒凝血酶样酶由２３４个氨基酸组成并含有１个位于Ａｓｎ２０的Ｎ－型糖基结合位点．竹叶青蛇毒凝血酶样酶序列与其它蛇种来源凝血酶样酶具有较大相似性，其与黄绿烙铁头蛇毒凝血酶样酶序列相似度为８４％，与美洲矛头蝮蛇毒凝血酶样酶序列相似度为６８％，而与牛凝血酶Ｂ链序列相似度仅为２５％．

玉米降血糖活性肽制备分离及其氨基酸序列分析

以水解度(DH)和游离氨基酸含量为指标优化玉米蛋白粉的酶水解工艺,结果显示,在pH 8.5,60℃条件下经过正交试验得到最适组合为:酶底物比3.5g/100g,水解时间2h,料液比120(g/mL),在该条件下其DH为27.02%,多肽含量为85.23%。同时,还优化了玉米肽的脱色工艺,最佳条件为:温度50℃,pH 3.5,活性炭用量1.5g/100mL,脱色时间45min,该条件下玉米肽得率为77.86%,脱色率为87.27%。将脱色脱盐后的玉米多肽经过凝胶色谱分离得到3个组分。体外降血糖活性结果显示,CP1促进正常HepG2细胞葡萄糖消耗效果最优,并且其α-糖苷酶抑制活性也最高(34.64%);CP1经过RP—HPLC制备柱纯化得到含量较高的14个组分,其中CP1-13的α-糖苷酶抑制活性最強,达到39.50%。经UPLC—Q—TOF—MS/MS测定,其氨基酸序列为A-P-A-L-L-P-F。

汉麻籽抗氧化肽的制备与氨基酸序列分析

为开发具有较好抗氧化活性的植物源蛋白肽,采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合酶法水解汉麻籽粕获得汉麻籽蛋白水解物,经膜分离技术得到4种不同分子质量的多肽组分。通过DPPH自由基清除率、总还原力的测定,评价不同多肽组分的抗氧化活性,并对抗氧化活性最强的多肽组分进行氨基酸序列分析。结果显示:低分子质量的汉麻籽多肽组分具有更好的抗氧化活性,其中HP-Ⅳ组分(分子质量<1 kDa)的抗氧化活性最强;HP-Ⅳ组分中丰度较高的6个肽段的分子质量分别为364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41 Da,氨基酸序列分别为NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRREGGRG、NHNNQLDLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLDTSNVNNQLDDNPRRFY。汉麻籽蛋白水解物,尤其是分子质量小于1 kDa的多肽组分可作为功能性成分用于抗氧化相关功能食品和保健品的开发。

高等植物F3′HcDNA及其氨基酸序列的生物信息学分析

用生物信息学方法对GenBank中拟南芥、油菜、大豆、矮牵牛和高梁等的类黄酮3′-羟化酶基因的cD-NA序列及其编码氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域、功能域和进化关系进行了初步预测和分析。结果表明:不同植物类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列的相似性为69.5%,其起始密码子均为ATG,终止密码子均为TAA、TAG或TGA,包括5,′3′非翻译区和一个开放阅读框;不同植物类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列编码的氨基酸序列的理化性质基本一致,相似性为72.5%,含有6段保守氨基酸序列,是"PPGR"、"AGTDT"、"RPPN"、"AYNY"、"IKALLL"、"TPLS";在进化关系上可划分为两大类;不同植物类黄酮3′-羟化酶具有一个跨膜结构域、定位于内质网上,并有一段与细胞色素P450功能区相匹配的功能域;类黄酮3′-羟化酶属具转运肽的亲水性稳定分泌蛋白,其二级结构为α-β型,α-螺旋和无规卷曲为最主要的结构元件,延伸链和β-转角散布于整个结构。可为类黄酮3′-羟化酶基因的克隆和遗传操作提供理论参考。

反相高效液相色谱-质谱联用法测定抑菌肽功能单元的氨基酸序列

测定乳酸菌发酵液中小分子抑菌肽抑菌功能单元的氨基酸组成序列对于深入理解其抑菌原理并实际应用有重要意义。作者利用AssayMAP Bravo蛋白纯化系统平台,采用色谱-质谱联用法将相对分子质量为3 500的抑菌肽样品经过凝胶过滤色谱分离纯化,两步反相高效液相色谱分离纯化和二维质谱鉴定,得到高纯度、高抑菌活性的三个抑菌功能单元,氨基酸组成序列分别为Phe-Tyr-Pro-Ser-Tyr-Ala,Asn-Glu-Arg-His和Lys-Glu-Ile-Thr-Pro-Ser-Glu-Arg,即该小肽的功能单元由三个短肽组成。结果表明,利用该方法,能够有效地提取并检测该小分子抑菌肽,其在氨基酸组成上与Nisin不同。

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化及氨基酸序列测定

目的:从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出高纯度的纤溶酶并对其进行初步性质研究和氨基酸序列分析。方法:采用DEAE-Sepharose FF离子交换和两次Superdex75PG凝胶过滤,从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出可直接溶解纤维蛋白原的蛋白酶。结果:分离到的纤溶酶相对分子质量为25kD,HPLC分析纯度在97%以上,氨基酸序列分析其N末端为MSTEF QRYME IVVNHS MVKKY NGDSD KIKAW。结论:采用此工艺可从尖吻蛇毒中分离出高比活的纤溶酶,为进一步研究其药理作用奠定了基础。

二维核磁共振谱测定植物新环肽—太子参环肽A和B中氨基酸序列

在植物新环肽[太子参环肽A(HA)和B(HB)]的结构研究中,应用COLOC谱较成功地解决了其氨基酸序列。结果表明当J值选择在6Hz-15Hz时,COLOC谱能满意地给出氮上含有活泼氢的氨基酸序列。

牛乳铁素的制备纯化与氨基酸序列分析

对牛乳铁素的制备和分离纯化方法进行研究。牛乳铁蛋白经胃蛋白酶水解,其产物经不同分离介质进行分离纯化,用毛细管电泳检测其纯度。用氨基酸分析仪确定其氨基酸组成,并进行适合度检验。结果表明,采用Butyl-Toyopearl650M树脂分离,其纯度为95.6%。纯化出的产物氨基酸组成和序列与已知的牛乳铁素无显著差异。

氨基酸序列中同源序列的识别↑

在现代分子生物学的研究中 ,对氨基酸序列进行序列分析是一个热门研究课题 .本文介绍了如何使用计算机技术对氨基酸序列的同源序列进行识别 ,给出了一种动态规划算法对两个序列识别的方法 ,以及各种改进的算法对多个序列识别的方法 ,并根椐实验结果对各种算法进行了讨论和评价 .

孔石莼质体蓝素的柱色谱纯化及其N-端氨基酸序列的分析测定

通过DEAE—Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-75凝胶过滤柱分离纯化得到了孔石莼（Ulva pertusa）的质体蓝素。其步骤为：将孔石莼样品以0．02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7．2）进行匀浆，然后离心去除沉淀，将上清液用硫酸铵分级盐析获得饱和度为40％～80％的盐析蛋白；通过DEAE-Sepharose柱色谱，在含有0～1．0mol/L NaCl的0．0lmoVL磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱下，盐析蛋白有3个主要的洗脱峰，然后在Sephadex G-75凝胶过滤色谱柱中进一步纯化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）显示，该蛋白质被纯化为单一条带。根据蛋白质电泳迁移率，纯化蛋白质的相对分子质量约为10000。该蛋白质不含糖。纯化的蛋白质经电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，以Edman降解法进行N-端氨基酸序列测定，前20个氨基酸残基序列为AAIVKLGPDDGSLAFVPSKI。通过对相关蛋白质数据库的检索，发现该序列与3种已报道的海藻的质体蓝素具有较高的序列同源性，其同源性分别为85％，85％和90％。据此，认为孔石莼的质体蓝素已获得纯化，其N-端20个氨基酸残基与已报道的海藻质体蓝素的氨基酸残基有较大的同源性，也存在着一定的变异。

磷脂酶A_1(Lecitase Ultra)的氨基酸序列分析及催化机理

研究磷脂酶A_1(Lecitase Ultra)的纯化、酶蛋白的氨基酸序列及活性中心的氨基酸残基组成,并推导水解磷脂酰胆碱(Pc)的机理。超滤法和RP-HPLC纯化酶液,除去了山梨醇和山梨醇盐,纯度97.7%;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI SYNAPT Q-TOF MS)和二级质谱(MS/MS)对酶蛋白进行分析,确定了氨基酸序列组成;数据库(http://www.matrixscience.com)比对,发现氨基酸序列信息与棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)脂肪酶高度吻合,序列中1-284是T.lanuginosus脂肪酶的氨基酸序列,序列中285-339是F.oxysporum脂肪酶的氨基酸序列;Lecitase Ultra和Sn-1-C16:0/sn-2-C2:0-PC的分子对接证实了酶活中心的三联体"Ser-His-Asp"催化机理。

南非2型口蹄疫病毒VP1基因的核苷酸及其氨基酸序列分析

VP1基因的遗传衍化关系是口蹄疫病毒分型的依据,而且许多重要的抗原位点也都位于VP1蛋白上。为了对南非2型口蹄疫病毒(SAT2-FMDV)VP1的编码基因序列及其氨基酸序列进行分析,为南非2型口蹄疫的诊断及疫苗设计提供理论基础,试验从NCBI下载大量的南非1/2/3型口蹄疫病毒(SAT1/2/3-FMDV)的1D2A2B基因片段,通过序列分析选择相似性较低的序列代表SAT1/2/3,将选中的代表序列连接于p UC57载体上进行合成,再对合成的含目的序列的穿刺菌进行划板、挑单克隆、摇菌、提质粒,得到重组质粒初步进行酶切鉴定后进行测序,测序正确后采用DNAStar软件包对这些合成序列进行分析。结果表明:SAT2-FMDV VP1的编码基因核苷酸序列变异度较大;虽然SAT2口蹄疫病毒VP1蛋白上主要抗原位点位置与其他血清型的差异性并不大,但是关键氨基酸已发生变化。