细胞器应激反应与自噬及铁死亡参与氯化钴诱导的血管平滑肌细胞损伤

目的:综合采用生物信息学分析和体外细胞实验验证,研究化学性低氧诱导剂氯化钴(CoCl2)诱导血管平滑肌细胞损伤与细胞器应激反应及自噬性死亡(自噬)和铁死亡之间的关系。方法:从基因表达数据库(GEO)中获取CoCl2处理血管平滑肌细胞的基因芯片数据集GSE119226,采用R语言分析数据,探讨CoCl2处理与细胞器应激反应(高尔基体应激、内质网应激)及两种细胞死亡方式(铁死亡、自噬性死亡)间的关系。采用原代培养的大鼠血管平滑肌细胞(rVSMC)和CoCl2诱导的体外缺氧模型,CCK-8法检测细胞活力变化,DCFH-DA法检测细胞内活性氧水平,Western blot法检测缺氧关键分子HIF-1α、高尔基体应激标志物GM130与p115、内质网应激标志物GRP78与CHOP、自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin1以及铁死亡标志物GPx4与xCT的表达水平,并观察给予相应的处理剂来诱导或抑制细胞器应激反应或细胞死亡对CoCl2诱导的细胞损伤作用的影响。结果:对GSE119226数据集进行差异表达基因筛选分析,结果显示CoCl2处理血管平滑肌细胞对细胞器功能与应激反应、自噬和铁死亡相关基因有明显影响,其中内质网应激、内质网蛋白加工、高尔基体对质膜蛋白转运的调控、自噬/自噬性死亡、铁离子调节与铁死亡等是主要富集的信号通路和生物学过程。体外实验结果显示,与培养的正常对照rVSMC相比,CoCl2处理后细胞活力明显降低,细胞内HIF-1α蛋白表达与活性氧水平升高。CoCl2处理后,rVSMC中反映高尔基体应激发生的高尔基体结构蛋白GM130与p115的表达水平降低,反映内质网应激发生的标志分子GRP78与CHOP升高;同时CoCl2也使细胞自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin1水平降低,提示自噬水平降低,而铁死亡标志物GPx4与xCT的表达水平降低则提示细胞发生铁死亡。与CoCl2处理组相比,诱导高尔基体应激、内质网应激或铁死亡可使细胞活力进一步降低,而抑制上述过程可改善细胞活力;另一方面,升高自噬水平可改善CoCl2降低的细胞活力。结论:CoCl2诱导低氧可导致血管平滑肌细胞损伤,高尔基体应激、内质网应激和铁死亡发生以及自噬水平降低在其中起重要作用,抑制细胞器应激反应和铁死亡或升高自噬水平可改善CoCl2导致的血管平滑肌细胞缺氧损伤。

电感耦合等离子体原子发射光谱法测定氯化钴中14种元素

文章研究了采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)测定氯化钴中的镍、铜、铁、铅、锌、镉、铬、硫、锰、钠、钙、镁、铝、汞元素的分析方法。上述14种元素的测定范围为0.001%~0.05%,对氯化钴中14种元素的检出限和测定下限进行了测定,并考察了基体及共存元素对待测元素的影响。试验通过标准加入法消除了钴对各元素的基体干扰,各元素的线性范围均为0~5.0μg/mL,在拟定条件下各元素的RSD在0.46%~3.32%之间,加标回收率在90.5%~114.0%之间,与其他方法的对照结果一致,满足氯化钴中杂质元素的测定要求。

氯化钴诱导体外人髓核细胞缺氧模型的建立

目的观察氯化钴(CoCl_(2))对体外培养的原代髓核细胞的影响,探寻符合研究目的体外化学干预低氧模型。方法利用贴壁法培养原代髓核细胞,使用100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L CoCl_(2)溶液分别处理12 h、24 h、36 h、48 h,形成最终13个分组:空白对照组,CoCl_(2)处理组(100μmol/L-12 h组,100μmol/L-24 h组,100μmol/L-36 h组,100μmol/L-48 h组;200μmol/L-12 h组,200μmol/L-24 h组,200μmol/L-36 h组,200μmol/L-48 h组;300μmol/L-12 h组,300μmol/L-24 h组,300μmol/L-36 h组,300μmol/L-48 h组)。利用CCK-8实验观察不同条件下细胞生长、凋亡情况,并通过免疫印迹(western blot)及实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果与空白对照组比较,CoCl_(2)处理组的细胞生存率整体趋势随着浓度升高、时间延长而降低(P<0.05),但在低浓度、短时间的CoCl_(2)诱导下,髓核细胞的生存率反而提高(P<0.05)。HIF-1α与VEGF的mRNA及蛋白表达亦随CoCl_(2)浓度升高和时间延长而增加(P<0.05)。但在300μmol/L CoCl_(2)的诱导下,HIF-1α、VEGF蛋白的表达进入平台期。结论CoCl_(2)对原代髓核细胞的增殖、凋亡及相关基因、蛋白的表达与时间和浓度相关,总体成逐渐升高趋势。本文成功建立起一种体外培养原代髓核细胞缺氧诱导方法,可以作为研究椎间盘髓核细胞缺氧模型的参考。

氯化钴模拟法构建绒毛外滋养细胞缺氧模型

目的:探讨适宜的绒毛外滋养细胞(EVT)化学性缺氧模型。方法:选取2022年4月至2023年1月在广西医科大学第一附属医院妇科选择人工流产的正常孕妇(6~9孕周)的绒毛组织,分离和培养原代EVT,利用免疫细胞化学进行纯度鉴定。利用氯化钴(CoCl_(2))构建细胞缺氧模型,CCK-8实验检测不同浓度(0、50、100、150、300μmol/L和600μmol/L)CoCl_(2)在不同时间(6、12、24h和48h)对原代EVT细胞存活率的影响,实时荧光定量聚合酶链反应实验(RT-qPCR)检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA表达。结果:成功分离和培养原代EVT。EVT的细胞存活率与CoCl_(2)浓度和缺氧时间有关。相对于对照组(0μmol/L),0~150μmol/L浓度组细胞存活率下降不明显;300μmol/L浓度组作用24h后对细胞生长明显抑制。600μmol/L浓度组的细胞毒性作用出现最早,24h后细胞基本全部死亡。150μmol/L CoCl_(2)缺氧6、12、24、48h各组的HIF-1α mRNA相对表达量分别是对照组(0h)的0.50倍、0.64倍、1.45倍和3.00倍。缺氧时间24h, 50、100、150μmol/L CoCl_(2)各组的HIF-1α mRNA相对表达量分别是对照组(0μmol/L)的1.23倍、1.28倍、1.58倍。结论:CoCl_(2)可用于构建原代EVT的化学性缺氧细胞模型,综合CoCl_(2)的细胞毒性作用及HIF-1α mRNA表达水平,CoCl_(2)的适宜作用浓度是150μmol/L,作用时间是24h。

氯化钴对小鼠肝氧化损伤及铁死亡相关指标的影响

目的观察氯化钴暴露对小鼠肝氧化损伤及铁死亡相关指标的影响。方法将24只雄性SPF级C57BL/6小鼠随机分为对照组和实验组,每组6只,实验组分别腹腔注射4、8和12 mg/kg氯化钴溶液,对照组腹腔注射等量生理盐水,每天染毒一次,共染毒30 d。染毒结束,计算动物肝脏脏器系数;采用试剂盒测定动物肝组织匀浆上清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG);Western blot检测动物肝组织谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁死亡抑制蛋白1(FSP1)和长链酯酰辅酶A合成酶4(ACSL4)蛋白表达水平。结果与对照组比较,4 mg/kg染毒组动物肝脏脏器系数显著升高(F=6.15,P=0.027),12 mg/kg氯化钴暴露组SOD降低(F=6.56,P=0.028);MDA随着氯化钴染毒剂量增加而增加(F=30.93,P<0.001);GSH和GSH/GSSG随着氯化钴染毒剂量增加而降低(F值分别为22.78和24.57,P<0.01);GPX4和FSP1表达水平随着氯化钴染毒剂量增加而降低(F值分别为41.47和19.397,P<0.01);ACSL4表达水平随着氯化钴染毒剂量增加而增加(F=16.01,P=0.004)。结论氯化钴暴露可引起小鼠肝脏氧化损伤,通过降低GPX4和FSP1表达,升高ACSL4表达促发肝脏铁死亡。

氯化钴诱导化学缺氧对N9小胶质细胞的损伤作用及机制

目的研究氯化钴(CoCl2)对N9小胶质细胞的损伤作用及机制。方法不同剂量CoCl2处理N9小胶质细胞后,XTT法检测细胞活力;倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;硫代巴比妥酸(TBA)显色法检测细胞上清液中丙二醛(MDA)含量;Hoechst 33258染色检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期变化。结果 CoCl2(50～1 000μmol.L-1)处理24 h后,细胞活力明显降低(P<0.01),且呈剂量依赖性。细胞形态发生明显改变,部分细胞出现皱缩、破碎,细胞密度减小,随CoCl2剂量增大,细胞形态损伤程度进一步恶化。MDA含量检测结果显示,氯化钴处理后,细胞上清液中MDA含量明显增多(P<0.05)。Hoechst 33258染色结果显示,氯化钴处理组的细胞凋亡比例较对照组明显增多(P<0.01),且比例随CoCl2剂量增大而增多。细胞周期检测结果显示,CoCl2可使细胞周期阻滞于G1/G0期。结论 CoCl2可呈剂量依赖性损伤N9小胶质细胞,机制与诱导细胞凋亡、引发氧化应激反应及细胞周期阻滞有关。

氯化钴化学模拟低氧对牙周膜成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究低氧对人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)的增殖及低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和Caspase-3表达的影响。方法:采用二氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)模拟低氧作用于人PDLCs,用MTT法检测人PDLCs的活力,并通过荧光定量PCR和Western印迹观察低氧处理后人PDLCs中HIF-1α和Caspase-3的表达变化。采用SAS6.12软件包对所得数据进行统计学分析。结果:低氧使人PDLCs存活率降低,并呈浓度和时间依赖;低氧促进HIF-1α蛋白的表达,而HIF-1α mRNA的水平未见影响(P>0.05);低氧使Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表达均上调。结论:低氧抑制人PDLCs增殖,这与低氧诱导HIF-1α表达,促进细胞凋亡有关。提示低氧在牙周炎发生和发展中起一定调控作用。

核酸酶P1活性中心金属离子与氯化钴(Ⅱ)相互作用

核酸酶P1是一种重要的DNA与RNA水解酶。本文利用ICP、VIS、NMR、酶活性测定等分析方法,首次拓展研究了核酸酶P1与CoCl2的直接相互作用。结果发现:核酸酶P1活性中心Zn?离子可被外加CoCl2中的Co?部分取代,而Co?进入酶的活性中心,生成相应的酶衍生物“Co?-P1”,并影响了酶的催化活性。与此同时还获得了Co?进入核酸酶P1活性中心Zn2位上的酶衍生物1HNMR谱。

可见吸收光谱法研究铜锌超氧歧化酶活性中心金属离子与氯化钴的相互作用

应用可见吸收光谱首次研究了铜锌超氧歧化酶（Ｃｕ２Ｚｎ２ＳＯＤ）活性中心金属离子在一定缓冲溶液中与无机氯化钴的直接相互作用。讨论了加入不同比例量的氯化钴、不同的ｐＨ值、不同酸盐及作用的平衡时间对这种相互作用的影响。结果发现，ＣｏＣｌ２中的Ｃｏ（Ⅱ）与Ｃｕ２Ｚｎ２ＳＯＤ中的Ｚｎ（Ⅱ）有交换作用，形成部分的Ｃｕ２中的Ｃｏ２ＳＯＤ，且上述四种因素对此均有不同程度的影响。本研究开创了金属酶活性中心金属离子与外加无机金属化合物的直接相互作用的研究。

光谱、波谱法研究铜锌超氧歧化酶与氯化钴(Ⅱ)、组氨酸钴(Ⅱ)相互作用

我们首次发现的铜锌超氧歧化酶（Ｃｕ２Ｚｎ２ＳＯＤ）与氨基酸等发生直接相互作用的现象，是一种前人未研究过的重要的生化新现象［１］。在此新发现的基础上，本文用ＩＣＰ，ＶＩＳ，ＮＭＲ和酶活性测定等方法，又从不同角度拓展研究了Ｃｕ２Ｚｎ２ＳＯＤ酶与两类不同化合物，即无机氯化钴（ＣｏＣｌ２）、有机组氨酸钴（Ｃｏ（Ⅱ）（Ｈｉｓ）ｎ）的直接相互作用，发现酶活性中心金属离子同样与外加的这两类不同化合物发生相互作用，相应地影响了酶的催化活性。还发现Ｃｏ（Ⅱ）（Ｈｉｓ）ｎ比ＣｏＣｌ２与酶相互作用更强、更快，Ｃｏ（Ⅱ）（Ｈｉｓ）ｎ中的Ｃｏ（Ⅱ）更易进入酶中，更影响了酶的催化活性。

氯化钴模拟法构建骨骼肌细胞缺氧模型

目的观察CoCl2对体外培养的原代骨骼肌细胞的影响,探讨合理的体外化学模拟低氧模式。方法利用组织贴块法培养并鉴定原代骨骼肌细胞,给予CoCl2处理,观察不同时间和浓度细胞凋亡情况,以及通过免疫印迹及实时定量聚合酶链反应检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、BAX的表达变化情况。结果与对照组比较,CoCl2处理组的细胞存活率明显下降(P<0.05),凋亡率明显增加(P<0.05),且骨骼肌细胞存活率下降程度及细胞凋亡率增加程度均随着氯化钴浓度增加时间延长而升高。HIF-1α、BAX蛋白水平亦随CoCl2浓度升高和时间延长而增加。结论 CoCl2对原代骨骼肌细胞的增殖凋亡及相关基因的表达成呈时间和浓度依赖性,成功建立起一种体外培养原代骨骼肌细胞缺氧诱导模型,可以作为体外研究骨骼肌缺血缺氧的良好模型。

氯化钴诱导PC12细胞凋亡的分子机制

目的确定氯化钴(CoCl2)诱导PC12细胞凋亡的分子机制。方法500μmolLCoCl2诱导PC12细胞24h后,检测活性氧(ROS)生成量的变化以及抗氧化剂N乙酰半胱氨酸(NAC)、二硫代苏糖醇(DTT)对细胞存活率和ROS生成量的影响;琼脂糖凝胶电泳检测NAC、DTT对CoCl2诱导PC12细胞DNA片段化的影响;利用RTPCR法检测凋亡相关基因bclxl和bax在PC12细胞调亡过程中的表达及NAC、DTT对基因表达的影响;化学发光法检测NAC、DTT对Caspase3表达的作用。结果在CoCl2诱导PC12细胞凋亡中,ROS生成量明显上升,为正常时的2.92倍;NAC、DTT可提高细胞存活率,由53.1%上升为94.8%和92.3%(P<0.01),并有效抑制ROS的生成,为正常时的24.2%和82.1%(P<0.01);同时抑制DNA片段化的发生。bclxl在细胞凋亡过程中表达明显下降,bax表达无明显变化;NAC和DTT可使bclxl的表达明显上升。Caspase3在细胞凋亡中被激活,NAC、DTT可抑制Caspase3的表达(P<0.01)。结论ROS介导了CoCl2诱导的PC12细胞凋亡,这一过程与抑制bclxl表达,激活Caspase3有关。

金雀异黄素对氯化钴诱导的兔视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的:研究氯化钴对体外培养的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响。方法:采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜,以荧光比值来表示VEGF的表达,半定量分析氯化钴处理不同时间对体外培养的RPE细胞VEGF蛋白表达的诱导作用,以及Gen对低氧或氯化钴诱导的VEGF表达的影响。结果:对照组有低水平VEGF蛋白的表达,随着低氧或氯化钴处理时间的延长,荧光比值的变化表现为时间依赖性,在6 h点达到高峰。Gen(50、100、200μmol/L组)与二甲基亚砜(DMSO)对照组相比,均可明显抑制氯化钴诱导的VEGF的表达,且此种抑制作用呈浓度依赖性。结论:Gen可抑制氯化钴诱导的RPE细胞VEGF表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有潜在的预防及治疗价值。

慢性氯化钴处理对GK糖尿病大鼠缺氧诱导因子1的表达及心梗面积的影响

缺血导致的心肌细胞缺氧是缺血性心脏病的主要病理因素,糖尿病是缺血性心脏病最常见的合并症之一.冠心病合并糖尿病患者心肌损伤明显加重,预后差,可能与缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor1,HIF-1)表达减少有关.但糖尿病时HIF-1信号转导系统改变的机制目前尚不清楚.近年来的研究表明,提高HIF-1α在缺血心肌中的表达及活性能明显促进新生血管形成,促进心肌细胞存活,减少缺血再灌注损伤,降低心肌梗塞面积,提高心肌功能,因此,调节HIF-1α的表达及活性成为治疗缺血性心脏病的新方法.通过制作GK糖尿病大鼠心肌梗塞模型,应用免疫组织化学染色、RT-PCR等方法研究发现,GK糖尿病大鼠合并心肌梗塞时,HIF-1α表达减少,心梗面积增大,而给予糖尿病大鼠慢性氯化钴处理后,其血糖水平降低,HIF-1α表达增加,心梗面积减小,这为如何调节HIF-1信号转导系统治疗冠心病合并糖尿病提供一个可能的新的治疗视点和策略.

密闭电解槽电积氯化钴生产电钴的工艺研究

在CoCl2体系中,采用密闭电解槽为电解设备,进行无隔膜、永久阴极电积钴试验。结果表明,该工艺避免了氯气泄漏,改善现场作业环境,在电流密度为500A/m2时,吨钴直流电耗为3 400kWh。

氯化钴化学模拟低氧对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的观察氯化钴(CoCl2)对体外培养的肿瘤细胞增殖和凋亡的影响,探讨合理的体外化学模拟低氧模式。方法(1)MTT方法和流式细胞术检测不同浓度CoCl2在相应时间内对A549和HeLa细胞活力以及增殖和凋亡的影响。(2)免疫印迹测定HIF-1α和凋亡蛋白的表达。结果(1)CoCl2(≤200μmol/L)在24h内对肿瘤细胞活力影响较轻,增加浓度或延长处理时间明显降低细胞活力。(2)CoCl2(200μmol/L)引起细胞早期凋亡。增加浓度(800μmol/L)导致晚期凋亡和坏死。(3)CoCl2(200μmol/L)诱导两种肿瘤细胞HIF-1α上调,24h达高峰(P<0.05),增加浓度或延长处理时间则下调。在A549细胞CoCl2引起BAX/BCL-2和P53表达上调;P53不参与CoCl2引起的HeLa细胞凋亡。结论CoCl2对肿瘤细胞的增殖凋亡的影响呈时间和浓度依赖性,进行化学模拟低氧时,要考虑CoCl2的作用浓度和时间。

由氯化钴制备四羰基钴盐的反应动力学

由氯化钴与ＣＯ制备四羰基钴盐是一个多相羰化反应。本文研究了影响反应速度的主要因素。测定了３２３～３４３Ｋ温度范围的动力学数据。根据实验数据得出反应速度方程式为：－ｄ［ＣｏＣｌ２］ｄｔ＝ｋ［ＣｏＣｌ２］［Ｒｅｄ］反应活化能为７４．０３ｋＪ·ｍｏｌ－１。

二氯化钴诱导化学缺氧对人牙髓细胞增殖和迁移的影响

目的:研究二氯化钴(CoCl2)诱导化学缺氧对人牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)增殖和迁移的影响。方法:改良组织块法体外培养获得的人DPCs,通过CoCl2化学模拟缺氧作用后,采用MTT法检测化学缺氧对人DPCs增殖的影响,Transwell法观察化学缺氧对人DPCs迁移能力的影响。结果:CoCl2诱导的化学缺氧可抑制人DPCs的增殖,并呈浓度依赖性;同时对DPCs的迁移有抑制作用。结论:CoCl2诱导化学缺氧能抑制DPCs的增殖和迁移。

咖啡酸和氯化钴对茉莉酸甲酯诱导抗病相关酶活性的影响

烟草愈伤组织在含咖啡酸 ( 5mmol/L)和 /或CoCl2 ( 1 0mmol/L ,乙烯合成抑制剂 )的MS培养基上暗培养 ,同时用茉莉酸甲酯 ( 1mg/ml,简称MJ)处理愈伤组织。处理后测定乙烯、水杨酸和病程相关蛋白(PR)含量及一些抗病相关酶活性。MJ明显促进乙烯产生、增加水杨酸和PR蛋白含量 ,提高苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、β1 ,3_葡聚糖苷酶和几丁酶的活性。咖啡酸降低MJ对乙烯和水杨酸诱导 ,CoCl2 明显降低MJ对乙烯的诱导 ,但没有明显影响MJ对水杨酸的诱导 ,两者都促进MJ诱导PAL活性而抑制MJ诱导β1 ,3_葡聚糖苷酶活性。咖啡酸明显影响MJ诱导内切几丁酶 ,几乎完全抑制对外切几丁酶的诱导 ;CoCl2 对MJ诱导内切几丁酶没有影响 ,促进对外切几丁酶的诱导。实验结果表明 ,不同的抗病相关酶活性诱导有不同的信号传递途径 ,在所测几种酶的诱导中 ,水杨酸起主要作用 ,乙烯作用较小 ,MJ的诱导作用主要是由水杨酸所转导。

氯化钴诱导大鼠原代脑微血管内皮细胞缺氧损伤的实验研究

目的建立氯化钴(CoCl2)诱导大鼠原代脑微血管内皮细胞(BMECs)缺氧模型,并观察细胞缺氧损伤情况。方法使用不同浓度(100、200、400、800μmol/L)CoCl2诱导大鼠原代BMECs缺氧,蛋白印迹法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白水平来反映细胞缺氧的程度,同时采用CCK-8法、化学比色法及TUNEL法检测细胞增殖、氧化应激和细胞凋亡水平。结果 200μmol/L CoCl2处理大鼠原代BMECs 6h后,HIF-1α蛋白水平较常氧阴性对照组显著升高(P<0.01);随着CoCl2处理浓度(200、400、800μmol/L)的增加,与常氧阴性对照组相比,细胞增殖抑制率逐渐升高,MDA水平明显增高(P<0.01),GSH水平和SOD活性显著降低(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论 200μmol/L浓度CoCl2处理大鼠原代BMECs 6h可以诱导明显的低氧HIF反应,而细胞增殖、氧化应激和细胞凋亡的损伤较轻,是模拟大鼠原代BMECs细胞缺氧的理想条件。