黏附性G蛋白偶联受体F1在胰腺导管腺癌中的表达及其促进癌症进展的机制研究

目的·分析黏附性G蛋白偶联受体F1(adhesion G protein-coupled receptor F1,ADGRF1)在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)发生及发展过程中的表达变化,探究ADGRF1对PDAC细胞增殖的影响以及促进PDAC进展的潜在分子机制。方法·基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库分析ADGRF1在正常胰腺组织及PDAC组织中的mRNA水平表达。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测ADGRF1在正常胰腺导管上皮细胞hTERT-HPNE及多种PDAC细胞中的表达情况。利用免疫组织化学染色(immunohistochemistry staining,IHC)检测PDAC患者的癌组织及癌旁组织中ADGRF1的表达差异。转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低ADGRF1后,通过CCK8和平板克隆形成实验检测PDAC细胞AsPC-1、SW1990增殖能力的变化。构建稳定过表达ADGRF1的Patu8988细胞,通过CCK8实验检测过表达ADGRF1引起的PDAC细胞增殖变化。利用RNA测序(RNA-sequence,RNA-seq)、基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)和免疫浸润分析预测与ADGRF1促进PDAC癌症进展相关的信号通路。结果·TCGA数据库和GEO数据库的分析结果显示ADGRF1 mRNA在PDAC组织中的表达高于正常胰腺组织(均P=0.000)。qPCR和Western blotting结果显示,与hTERT-HPNE细胞相比,多种PDAC细胞中ADGRF1的mRNA和蛋白水平均有所上调(均P<0.05)。IHC结果显示ADGRF1在PDAC患者癌组织中的表达也高于癌旁组织。此外,下调ADGRF1能够抑制PDAC细胞AsPC-1、SW1990的增殖能力;而过表达ADGRF1则促进Patu8988细胞的增殖能力(均P<0.05)。RNAseq、GSEA富集分析和免疫浸润的结果显示,ADGRF1的表达与干扰素α(interferon-α,IFN-α)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)等信号通路有关。结论·ADGRF1在PDAC细胞和组织中高表达,促进PDAC细胞的增殖,其机制可能与多个免疫相关信号通路有关。

猪肠病毒G型部分VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究扩增猪肠病毒G型(EV-G)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-G-VP1多克隆抗体具有良好的免疫原性和反应性,可以特异性识别EV-G感染Marc-145细胞表达的VP1蛋白,为猪肠病毒G型免疫学检测方法的建立提供良好的生物学材料。

一个水稻小G蛋白OsRan1的克隆及表达分析

逆境对于水稻产量和品质有很大影响,研究在逆境下水稻基因的表达变化对于研究水稻抗逆有着重要意义。运用荧光差异显示(Fluorescence Differential Display,FDD)技术,从低温处理的水稻中克隆到OsRAN1基因并通过半定量PT-PCR分析该基因在低温和高盐逆境下的表达。该基因cDNA序列全长为984bp,含有一个编码221个氨基酸残基的开放阅读框,推测分子量为25.0KD,此氨基酸序列具有GTPase活性区域,属于小G蛋白Ran亚家族,通过氨基酸相似性比对发现,Ran家族氨基酸序列高度保守,OsRAN1与TaRAN1和AtRAN1相似性分别达到98.19%和92.76%。通过半定量PT-PCR分析,发现在低温胁迫下,OsRAN1在根和叶鞘中表达量均有增加,尤其是高盐胁迫下根中OsRAN1表达量有迅速升高然后降低的变化。推测该基因在水稻逆境应答中起着重要作用。

层粘连蛋白对晚G_1期人胃癌BGC-823细胞生长的促进作用

为研究层粘连蛋白(laminin,LN)促进肿瘤细胞生长作用,采用脉冲标记计数有丝分裂百分率(percentage labeling mitosis,PLM)法测得体外培养人胃癌(BGC-823)细胞周期时间为41h,其中G1期时间为24.5h.分裂细胞脱离法获取分裂期细胞,继续培养23h,在细胞运行进入G1晚期时,将其置于LN0、0.11、0.55、1.10μmol/L基质上孵育4h;细胞荧光光度计检测晚G1期细胞内Ca2+浓度、钙调蛋白、DNA含量.结果显示,LN与其膜上受体结合后引起细胞内Ca2+浓度、钙调蛋白、DNA含量增加,尤以在0.55μmol/LLN作用显著(P<0.001).蛋白质免疫印迹分析证明,cPKC-α呈现表达,提示LN与其受体结合可增强其细胞cPKC-α的活性;分析G1期细胞周期蛋白E(cyclinE)、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2表达水平,呈现逐渐增强的趋势;LN可诱导c-Myc蛋白呈现高表达,提示LN与其受体结合增强与细胞增殖密切相关的基因表达;在LN作用前后的BGC-823细胞均未检测到Bax蛋白表达.结果提示,在人胃癌(BGC-823)细胞G1/S期交界处,层粘连蛋白与其膜上受体结合引起细胞内Ca2+浓度升高,诱导钙调蛋白的释放,其含量增加,增强蛋白激酶C的活化,导致细胞内DNA含量增加、G1/S期细胞周期蛋白与CDK表达增强、诱导原癌基因c-Myc呈持续表达状态,而凋亡基因Bax不表达.

过量表达异三聚体G蛋白γ亚基基因RGG2提高水稻抗旱性

【目的】探究水稻异三聚体G蛋白γ亚基RGG2在提高水稻抗旱性中的作用。【方法】利用酵母双杂交和荧光素酶互补实验,鉴定RGG2与RGB1的相互作用。施加外源ABA,检测RGG2的表达水平和RGG2过量表达系的种子萌发率,用于阐明RGG2是否参与ABA响应。通过比较野生型和RGG2过量表达系的离体叶片失水率和干旱处理后的植株存活率,解析RGG2在干旱胁迫响应中的作用。【结果】RGG2与RGB1之间存在相互作用。RGG2的表达水平可以被ABA、PEG-6000和干旱处理显著诱导。ABA处理条件下,日本晴和武运粳7号背景下RGG2过量表达系种子萌发率和根长均明显下降,且显著低于野生型,表明RGG2正调控ABA响应。过量表达系离体叶片的失水率低于野生型,但干旱条件下的植株存活率高于野生型。干旱处理条件下,多个ABA和干旱胁迫响应相关基因的表达被诱导,并且在过量表达系中的表达水平明显高于野生型。【结论】RGG2正调控ABA和干旱胁迫响应,过量表达RGG2可以提高水稻抗旱性。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

总蛋白含量不同的水稻品种谷蛋白含量分析及Gt1启动子序列比较

选取3种总蛋白含量差异较大的水稻为材料,在分析其谷蛋白含量的基础上,克隆它们的Gt1启动子,并采用vectorNTI软件对这3个Gt1启动子序列进行比较.结果显示,在不同总蛋白和谷蛋白含量的水稻品种中,Gt1谷蛋白基因启动子是有差异的.

水稻类受体蛋白激酶基因OsESG1的克隆与生物信息学分析

类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase,RLK)在植物生长发育等多种信号的响应中发挥重要作用。以水稻基因组为模板,通过PCR方法,扩增到一条全长2.2 kb左右的目的片段,序列分析结合RT-PCR表明,该片段由一个完整的开放阅读框组成,无内含子,命名为OsESG1(GenBank登录号:HE 584611),其编码蛋白产物包含749个氨基酸残基。结构分析显示,该蛋白产物包含1个跨膜区、胞外S位点糖蛋白(SLG)、PAN_AP结构域和S_TKc结构域,属于S-结构域型类受体蛋白激酶,推测其在植物生殖发育过程中起作用。

肝癌组织中GPSM2、TGF-β1蛋白表达水平及临床意义

目的 探讨肝癌组织G蛋白信号调节蛋白(GPSM)2、转化生长因子1(TGF-β1)蛋白表达与临床病理参数及预后的关系。方法 选取原发性肝癌患者80例,取手术切除的肝癌组织和癌旁正常组织。采用免疫组织化学染色法检测GPSM2、TGF-β1在癌组织和癌旁正常组织中的表达差异,分析癌组织中GPSM2、TGF-β1表达水平与临床病理参数及预后的关系。结果 肝癌组织中GPSM2、TGF-β1高表达率分别为71.25%、82.50%,高于癌旁正常组织的18.75%、13.75%(P<0.05)。GPSM2在分化程度低的肝癌组织中高表达率较高(P<0.05),TGF-β1在分化程度低、有血管转移的肝癌组织中高表达率较高(P<0.05)。生存曲线显示,GPSM2、TGF-β1低表达患者的累积生存率(77.27%、85.71%)高于高表达患者(47.37%、48.48%),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 GPSM2、TGF-β1在肝癌组织中高表达率较高,其表达水平与分化程度密切相关,GPSM2、TGF-β1高表达患者预后较差。

基于蛋白质组学探讨Ppp3cb和Ppm1g在NHE1基因敲除模型鼠海马组织中的表达

目的通过NHE1基因敲除模型鼠的海马组织差异蛋白质组学分析,发现并明确Ppp3cb和Ppm1g的表达特征。方法①选取6只2周龄NHE1基因敲除模型鼠作为模型组,同周龄野生型小鼠6只作为对照组,采用琼脂糖凝胶电泳检测其基因型;应用旷场实验和强迫游泳实验对模型组和对照组小鼠进行行为学评估,并按照Racine评分标准对模型鼠进行癫痫发作分级;②通过串联质谱分析技术对模型组和对照组的海马组织进行差异蛋白筛选,基因本体论(Gene Ontology Analysis,GO)分析差异蛋白并进行注释和富集,蛋白网络数据库(search tool for the retrieval of interesting genes,STRING)分析差异蛋白之间的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI);③应用qPCR和Western blot检测Ppp3cb和Ppm1g的转录和翻译水平,应用免疫组织化学技术分别观察其在组织中的表达量。结果①模型组小鼠NHE1基因未见表达,旷场实验中模型鼠的运动总距离较对照组减少(P=0.0073),跨越的格子数比对照组显著减少(P<0.0001)。强迫游泳实验结果显示,模型鼠不动的时间明显延长(P<0.0001);②以表达倍数(FC)≥1.2倍且P<0.05为筛选标准,检测到海马组织中845个差异表达的蛋白质点,其中有9个蛋白表达上调,7个蛋白表达下调。其中Ppp3cb下调,Ppm1g上调。GO功能注释结果表明,NHE1敲除后,分子功能(MF)富集在蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的差异最显著,细胞成分(CC)富集在质膜部分的差异蛋白数量最多,生物过程(BP)富集在负向调节生物过程、免疫系统过程的差异蛋白数量最多。STRING分析显示差异蛋白Ppp3cb和Slc9a1直接作用,Ppm1g通过Ppp3cb和Slc9a1间接作用,Ppp3cb和Ppm1g之间相互作用。③Ppp3cb的转录和翻译水平减少,在组织中的表达量下降,而Ppm1g转录和翻译水平增加,在组织中的表达量上升(P<0.05)。结论本研究确定了NHE1基因敲除小鼠海马组织中差异蛋白Ppp3cb表达下调,而Ppm1g表达上调,为进一步研究Ppp3cb和Ppm1g参与癫痫发病机制提供了依据。

水稻组蛋白H1三突变体的创建和转录组学分析

【目的】组蛋白H1对于染色质高级结构的维持和稳定具有重要作用,研究水稻H1对基因表达的影响,为深入理解水稻H1的生物学调控功能提供依据。【方法】通过半定量RT-PCR与RT-qPCR对水稻4个H1基因进行表达分析,利用CRISPR技术创建水稻H1基因编辑植株,鉴定突变体表型,对突变体进行转录组学分析。【结果】水稻4个H1基因的表达比较广谱,在根中的表达较低;在T_(0)代CRISPR突变体筛选过程中发现H1.1-H1.4发生多种突变;在T_(1)代筛选到一株Osh1.1 Osh1.3 Osh1.4纯合三突变体,该三突变体具有多种发育缺陷,成为转录组分析的材料;进一步在T_(2)代得到三突和四突群体,该群体约25%为白化苗,植株生长迟缓,在响应干旱胁迫方面发生缺陷;对三突变体进行转录组学分析,鉴定到1055个差异表达基因,显著上调的基因约为下调基因的2.5倍,说明H1可能具有抑制基因表达的功能。【结论】在突变体中,光合作用、胁迫响应、氨基酸代谢和RNA代谢等多种途径均发生调控紊乱;其中,核糖体蛋白和光合作用相关基因显著上调,与干旱胁迫相关的脱氢酶基因显著下调。核糖体途径基因过量表达可能造成蛋白质稳态失调,导致植物发育缺陷。

水稻种子特异性谷蛋白GluB1启动子在水稻愈伤组织中驱动外源基因表达

【目的】水稻谷蛋白启动子GluB1(GluB1promoter,pGluB1)常用于外源基因在种子中特异性高效表达的研究,也是研究种子储藏蛋白基因表达调控机制的模型。前人研究表明,pGluB1只在水稻胚乳中表达,而在根、茎、叶片、叶鞘、颖壳等组织中均无表达活性。研究的目的是为了克服种子特异表达启动子筛选周期长的缺点。【方法】将由pGluB1驱动的霍乱毒素B亚单位和重组胰岛素原组成的融合基因(a fusion gene of the cholera toxin B subunit and human proinsulin, CTBIN)表达载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS经农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤组织。通过RT-PCR和蛋白质印迹杂交试验检测融合基因CTBIN在水稻愈伤组织中的转录和翻译表达。【结果】获得的7个转基因愈伤克隆中,有6个克隆的融合基因CTBIN在转录水平上表达。选取其中4个克隆进一步进行蛋白质印迹杂交试验检测证实融合基因CTBIN均在翻译水平上表达,而且从分子量大小推断融合蛋白包含的谷蛋白GluB1的N-端信号肽序列(24个氨基酸残基)在所测的愈伤组织细胞中均被成功切除。【结论】水稻种子特异性启动子pGluB1在愈伤组织中具有驱动外源基因表达活性,种子蛋白体亚细胞定位信号肽序列可在愈伤组织细胞中被切除。这为在愈伤组织细胞中快速检测种子特异表达启动子活性和探索愈伤组织中蛋白质的亚细胞分拣机制奠定了基础。

RGS16及HMGB1蛋白表达在高级别宫颈鳞状上皮内病变冷刀锥切术后复发中预测价值

目的探讨G蛋白信号调节子(RGS)16及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)蛋白表达在高级别宫颈鳞状上皮内病变(HSIL)冷刀锥切术(CKC)后复发中预测价值。方法选择2021年1月至2022年12月徐州医科大学附属连云港医院收治的患者均行CKC后且术后病理切缘阴性的238例宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)患者,术中采集病灶组织,采用免疫组化法测定RGS16、HMGB1蛋白表达情况。术后随访1年,根据患者术后1年是否复发分为复发组与非复发组。对比2组RGS16、HMGB1蛋白表达情况,对两组临床资料进行单因素分析,将单因素分析差异有统计学意义的指标纳入多因素Logistic回归分析,筛选HSIL患者术后复发的影响因素。绘制受试者工作特征曲线(ROC),以曲线下面积(AUC)评估预测价值。结果随访1年,无失访,HSIL患者术后复发24例,复发率为10.08%,剩余214例均未复发。单因素分析结果显示,复发组产次、有腺体累及、术后人类乳头瘤病毒(HPV)持续感染、术后液基细胞学阳性例数占比、RGS16蛋白阳性表达率、HMGB1蛋白阳性表达率高于非复发组(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,RGS16蛋白阳性表达、HMGB1蛋白阳性表达为HSIL患者术后复发的影响因素(P<0.05)。ROC曲线结果显示,RGS16蛋白、HMGB1蛋白阳性表达及二者联合预测HSIL患者术后复发的AUC值分别为0.740、0.790、0.818(P<0.05),且二者联合的AUC值更高(P<0.05)。结论RGS16蛋白、HMGB1蛋白阳性表达可用于预测HSIL患者术后复发风险,且二者联合具有更高的预测价值。

G蛋白偶联胆汁酸受体1通过抑制内质网应激减轻内皮素-1介导的乳鼠心肌细胞凋亡

目的观察G蛋白偶联胆汁酸受体1(G protein-coupled bile acid receptor 1,TGR5)被激活后对内皮素-1(endothelin-1,ET-1)介导的心肌细胞凋亡的作用,并探讨其机制。方法首先分对照组和ET-1组,ET-1浓度分别为10-6、10-7、10-8 mmol/L,分别培养12、24、36、48 h,流式细胞术检测各组各时段凋亡率。选择凋亡率较高的ET-1浓度及时间,进行后续实验。后续实验分为对照组、ET-1组、TGR5激动组、TGR5表达抑制组、TGR5空病毒组,流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡率,CCK-8测心肌细胞存活率,RT-PCR检测TGR5mRNA,Western blot检测TGR5、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal protein kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)及门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(casepase-12)表达。结果ET-1在10^(-8)~10^(-6) mmol/L的浓度范围呈浓度依赖性,48 h内呈时间依赖性介导心肌细胞凋亡(P<0.05)。后续实验发现激活TGR5后,相较于ET-1组,心肌细胞凋亡率下降,心肌细胞存活率提高,且CHOP、p-JNK、Caspase12蛋白表达受到抑制(P<0.05)。而抑制TGR5表达后可阻断TGR5对心肌细胞凋亡的抑制作用,降低心肌细胞存活率,CHOP、p-JNK、Caspase12蛋白表达增加(P<0.05)。结论ET-1可介导心肌细胞凋亡,其机制可能与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)过度激活有关,而TGR5可能通过抑制ERS,拮抗ET-1对心肌细胞介导的凋亡作用。

GIT1蛋白通过调节血管形成促进骨折愈合

目的:探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)在骨折愈合过程中的作用。方法:应用GIT1基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠制作股骨骨折模型,每组30只。造模成功后7、14、21 d,应用X线、micro-CT、PECAM1免疫荧光染色等方法分析骨痂体积及新生血管情况。结果:与野生型小鼠相比,GIT1基因敲除小鼠骨折愈合延迟,骨痂内新生血管的体积和数量减少。结论:GIT1基因缺失导致骨痂区新生血管减少,从而延迟骨折愈合。

高温胁迫对水稻光合PSII系统伤害及其与叶绿体D1蛋白间关系

以水稻结实期的人工控温试验测定不同温度处理下水稻旗叶光合速率、叶绿素荧光参数的动态变化,并结合Western印迹与胶体金标记技术对叶肉细胞类囊体膜中D1蛋白的表达检测与活性定位,探讨了高温胁迫对D1蛋白存在形态与活性分布的影响,以及D1蛋白表达与叶片光合速率、PSII荧光参数的联系。结果表明,高温处理下叶片净光合速率下降、PSII潜在活性(Fv/Fo)和PSII光能转化效率(Fv/Fm)降低,且随着高温胁迫时间的持续和叶片功能的衰退,类囊体膜结构损伤越严重,光能转化效率越低;在D1蛋白的两类存在形态中,非磷酸化D1蛋白和磷酸化D1蛋白在高温胁迫下的表达量均有所下降,但前者下降更明显;高温处理下控制D1蛋白表达的叶绿体psbA基因在转录水平呈下调表达,使D1蛋白合成及周转过程受到抑制,进而类囊体膜PSII反应中心的功能受损与叶绿体光合效率下降,揭示高温胁迫对叶片PSII系统的伤害受D1蛋白磷酸化过程和psbA基因表达变化的共同作用,进而影响不同水稻品种在高温胁迫下的光合速率和耐热性。

阳性表达表皮钙粘蛋白增加G0/G1期人乳腺癌细胞比例及其分子机制

表皮钙粘蛋白 (E cadherin)阴性的乳腺癌细胞株MDA MB 2 3 1和MDA MB 43 5转染野生型表皮钙粘蛋白基因 ,通过流式细胞仪测量细胞周期发现表皮钙粘蛋白阳性细胞生长变慢 ,更多细胞停滞在G0 /G1期 ,蛋白质印迹证实由G0 /G1期进入S期的重要调控分子细胞周期蛋白 D1(cyclinD1)下降了 ,并发现表皮钙粘蛋白还能降低直接激活细胞周期蛋白 D1基因转录的 β 连环蛋白的蛋白质浓度 .蛋白激酶B (PKB)能通过抑制糖原合成激酶 3 β(GSK 3 β)的活性来抑制β 连环蛋白降解 ,并在乳腺癌高转移细胞株中普遍过表达 ,其表达同样受到了表皮钙粘蛋白的抑制 .并且在表皮钙粘蛋白阳性细胞中 ,作为PKB上游信号分子并能激活PKB的粘着斑激酶 (FAK)和整联蛋白相关激酶 (ILK)蛋白量也发生下降 ,能抑制PKB激活的PTEN蛋白量却增加了 .结果显示 ,表皮钙粘蛋白能通过降低乳腺癌细胞中的PKB蛋白浓度 ,并通过上游信号分子抑制PKB的激活 ,进而降低PKB对β 连环蛋白降解的抑制作用 ,导致 β 连环蛋白直接调控的靶基因细胞周期蛋白D1的表达量下降 ,引起更多的细胞停止在G0

Bt水稻Cry1Ab杀虫蛋白表达的时间动态及其在水稻土中的降解

采用ELISA技术检测了Bt水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)不同生育期茎和叶片中cry1Ab基因的表达水平,以及植株组织(茎和叶片)室内埋于不同稻田土壤中其Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态。结果表明,不论是KMD1还是KMD2,茎和叶片中cry1Ab基因的表达量为3.7～9.1μg/g鲜重,均以拔节期和孕穗期相对较低,灌浆初期显著升高,黄熟期又明显下降(但仍然维持在较高的表达量)。KMD1茎和叶片中Cry1Ab蛋白在3种水稻土即青紫泥田、黄松田和黄筋泥田中的降解,均以前期(处理后12d内)较快,但中后期明显较慢;处理后42d,这两种组织中的Cry1Ab残留量均稳定在μg级水平,分别仅有0.20～0.85μg/g干重和0.35～1.81μg/g干重。KMD1茎和叶片中Cry1Ab蛋白降解动态与土壤类型密切相关,青紫泥田中降解最快,黄筋泥田中次之,黄松田中最慢。淹水可加快土壤中茎和叶的腐解,从而促进其中Cry1Ab蛋白的降解。KMD2粉碎叶中Cry1Ab蛋白在有菌水稻土中的降解快于无菌土中,表明土壤微生物存在可加快Cry1Ab蛋白的降解。在各种土壤淹水与非淹水、灭菌与非灭菌处理条件下的Cry1Ab蛋白降解过程均可用指数方程进行拟合,算得其消减半衰期为2.2～11.6d不等。讨论了土壤类型、淹水等影响Cry1Ab蛋白降解的可能机制,认为土壤微生物是其中起关键作用的一个因子。

Cry1Ab杀虫蛋白在水稻-褐飞虱-拟水狼蛛食物链中转移与富集

采用ELISA方法检测了2个转 cry1Ab 基因水稻 (Bt水稻) 品系KMD1和KMD2不同生育期叶鞘内Cry1Ab杀虫蛋白的含量及其通过褐飞虱和拟水狼蛛的转移和富集情况。结果表明, 这2个品系中抽穗期和黄熟期叶鞘内Cry1Ab的含量均显著低于苗期、分蘖期和孕穗期, KMD1和KMD2中Cry1Ab杀虫蛋白可以通过食物链转移到Bt水稻非靶标害虫褐飞虱及其天敌拟水狼蛛体内。褐飞虱在KMD1或KMD2上取食2 d后, 体内均含有 Cry1Ab杀虫蛋白, 但连续取食2、4、6、8和10 d后,其体内含量并未因取食时间的延长而呈现明显增加的趋势。当拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时, 在捕食2、4、6、8和10 d后, 其体内均可检测到Cry1Ab杀虫蛋白, 其含量并未随捕食时间的延长而明显上升, 但均显著高于相应时间褐飞虱体内的含量。可见, 该蛋白可通过水稻转移至褐飞虱, 再转移至拟水狼蛛, 并存在明显的富集现象, 而这种富集并不随蜘蛛捕食时间的延长而加强。拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时, 其捕食量未受到显著影响, 其中肠酶粗提物对Cry1Ab杀虫蛋白具有明显的降解作用。

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。