共表达分子伴侣蛋白提高III型普鲁兰水解酶在短小芽孢杆菌中的分泌表达及发酵优化

本研究旨在通过共表达分子伴侣蛋白以及优化发酵条件来提高III型普鲁兰水解酶(TK-PUL)在短小芽孢杆菌中的分泌表达水平。通过构建共表达TK-PUL和分子伴侣蛋白的多种重组短小芽孢杆菌,并以胞外酶活为指标对其进行筛选,确定最有利于TK-PUL分泌表达的分子伴侣蛋白及对应的重组短小芽孢杆菌。在此基础上采用单因素实验和响应面法优化重组短小芽孢杆菌的发酵条件。结果表明,共表达分子伴侣蛋白PrsA^(Ba)的重组短小芽孢杆菌的胞外酶活达到98.79 U/mL,提高了0.31倍。该重组短小芽孢杆菌的最佳培养基包括19.65 g/L葡萄糖、21.46 g/L酵母提取物、12.01 g/L MgCl_(2)·6H_(2)O、9.02 g/L脯氨酸、0.01 g/L FeSO4·7H_(2)O、0.01 g/L MnSO4·4H_(2)O、0.001 g/L ZnSO4·7H_(2)O。在发酵温度为35℃、起始发酵pH为7.0的条件下,该重组短小芽孢杆菌于最佳培养基中培养66 h时,其胞外酶活达到192.68 U/mL,提高了1.56倍。本研究通过共表达分子伴侣蛋白和发酵优化实现了TK-PUL在短小芽孢杆菌的高效分泌表达,为TK-PUL的应用提供了基础。

暗褐脉柄牛肝菌产淀粉水解酶最适温度及最适初始pH研究

以20113和21014暗褐脉柄牛肝菌菌株为试材,采用刚果红、卢戈氏碘液变色圈法,研究了温度、pH对暗褐脉柄牛肝菌产淀粉水解酶能力的影响,以期为研发暗褐脉柄牛肝菌淀粉高效利用方案提供参考依据。结果表明:刚果红变色圈试验中,随着温度升高,菌丝生长速率、淀粉水解酶指数逐渐升高,并在28℃达到最大值,随后逐渐下降;卢戈氏碘液变色圈试验中,随着温度升高,菌丝生长速率、淀粉水解酶指数逐渐升高,并分别在30℃和28℃达到最大值,随后逐渐降低;随着初始pH逐渐升高,淀粉水解酶指数逐渐升高并在pH 6.5时达到最大值,pH 7.0~8.0变化不显著;随着pH升高,21014菌株生长速率逐渐降低,20113菌株生长速率无显著变化。综上,暗褐脉柄牛肝菌产淀粉水解酶最适宜温度为30℃,最适初始pH为6.5。

穿心莲糖苷水解酶基因ApGH的克隆、生物信息学分析及表达研究

目的:对穿心莲糖苷水解酶(ApGH)基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析。方法:取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框(ORF)设计特异性引物,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式。结果:克隆所得ApGH基因的ORF全长1734 bp,编码577个氨基酸(GenBank登录号:OR887606)。ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1家族。将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta(DE3)中成功表达出重组蛋白质。实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低。结论:克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达。研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据。

嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶协同压热制备莲子抗性淀粉的工艺优化及其功能特性研究

本研究以莲子淀粉为原料,采用嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶(TK-PUL)与压热联合制备RS3型抗性淀粉(EHP-LRS3)。通过单因素实验和响应面试验对TK-PUL与压热联合制备EHP-LRS3的工艺参数进行了优化,采用扫描电子显微镜和X-射线衍射对EHP-LRS3的形貌、晶体结构进行了观察与分析,并考察了EHP-LRS3对长双歧杆菌的促增殖能力。结果表明,在TK-PUL酶解温度为80℃时制备EHP-LRS3的最佳工艺为:向质量分数为35.32%的莲子淀粉乳(pH5.00)中添加25.00 U/g(莲子淀粉)的TK-PUL,将混合物于80℃处理12.70 h,再将其依次于121℃压热处理10 min、4℃回生处理24 h。在最佳工艺条件下,EHP-LRS3的得率为58.46%。扫描电镜分析显示EHP-LRS3呈不规则的沟壑状结构。X-射线衍射分析表明EHP-LRS3的晶体结构呈现出不同于莲子淀粉A型晶体结构的B型晶体结构。EHP-LRS3对长双歧杆菌的促增殖能力优于压热法制备的RS3型抗性淀粉(HP-LRS3)。本研究采用TK-PUL与压热联合制备得到高得率的RS3型抗性淀粉(EHP-LRS3),并验证了EHP-LRS3对长双歧杆菌的促增殖能力,为莲子淀粉的高值化利用提供了理论依据。

亚低温对新生儿缺氧缺血性脑病患儿血清泛素羧基末端水解酶-L1、低氧诱导因子-1α表达水平及神经发育结局的影响

目的探讨亚低温对新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)患儿血清泛素羧基末端水解酶-L1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase-L1,UCH-L1)、低氧诱导因子-1a(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)表达水平及预后的影响。方法选取2015年8月至2022年8月邯郸市妇幼保健院新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit,NICU)收治的110例中重度HIE患儿作为研究对象。根据家属是否同意患儿接受亚低温治疗,将患儿分为亚低温治疗组(n=70)和传统治疗组(n=40);亚低温治疗组患儿除常规治疗外,于出生后0~6 h实施选择性头部亚低温治疗。传统治疗组患儿给予常规治疗;治疗前和治疗后第3天,采用酶联免疫吸附实验双抗夹心法检测UCH-L1、HIF-1α表达水平。随访患儿出生后12~15个月神经发育结局。统计学方法采用独立样本t检验、配对t检验、χ^(2)检验或Fisher确切概率法。结果亚低温治疗组与传统治疗组治疗后血清UCH-L1[(1.9±0.4)与(3.1±0.3)μg/L,t=16.495,P<0.001]、HIF-1α表达水平[(1.40±0.22)与(2.75±0.19)μg/L,t=32.486,P<0.001]比较,亚低温治疗组明显低于传统治疗组;亚低温治疗组患儿治疗后血清UCH-L1表达水平低于治疗前[(1.9±0.4)与(3.3±0.5)μg/L,t'=18.293,P<0.01]。亚低温治疗组和传统治疗组在治疗3 d后,虽然两组血清中HIF-1α表达水平均出现高于治疗前[(1.40±0.22)与(1.23±0.29)μg/L,t'=3.907,P<0.001;(2.75±0.19)与(1.27±0.35)μg/L,t'=23.504,P<0.001],但是,亚低温抑制血清HIF-1α表达水平升高的效果明显优于传统治疗组。随访结果显示,亚低温治疗组患儿神经发育正常的比例高于传统治疗组[68.6%(48/70)与32.5%(13/40),χ^(2)=13.408,P<0.001];亚低温治疗组神经发育迟缓的比例低于传统治疗组[11.4%(8/70)与37.5%(15/40),χ^(2)=10.462,P<0.001]。结论亚低温治疗可以明显降低中重度HIE患儿血清UCHL1表达水平,抑制血清HIF-1a表达水平升高的作用明显优于传统治疗,这可能是低温治疗的神经保护机制之一。

黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶提取工艺、酶学性质、实际应用研究

目的研究黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶(sbslGUS)提取工艺、酶学性质、实际应用。方法在单因素试验基础上,以粒度、加水量、提取时间、提取次数为影响因素,酶活性为评价指标,正交试验优化提取工艺。分析底物(黄芩苷)浓度与酶解速度的关系,计算V_(max)、K_(m),考察pH值、温度、金属离子对酶活性的影响,评价pH稳定性、热稳定性。sbslGUS酶解黄芩苷以制备黄芩素,考察pH值、温度、反应时间、底物初始浓度、加酶量对转化率的影响。结果最优提取工艺为粒度40目,加水量10倍,提取时间15 min,提取次数3次。酶解符合酶促反应动力学,K_(m)为0.0063 mol/L,V_(max)为70.42μmol/h,在pH值6.0、温度45℃、金属离子100 mmol/L Cu2+下酶活性最强,sbslGUS在pH值4.0~7.0、温度4~30℃范围内稳定性良好。最优制备工艺为pH值6.0,温度45℃,反应时间12 h以上,底物初始浓度67.2 mmol/L,加酶量1 mL/0.269 mmol黄芩苷,转化率为97.83%。结论sbslGUS酶解效率高,条件温和,可为获取黄芩素提供简便的制备方法,并且拓展了黄芩茎叶应用途径。

保幼激素环氧水解酶基因在蠋蝽滞育过程中的表达模式及其功能研究

保幼激素(juvenile hormone,JH)缺乏是引发昆虫生殖滞育的主要原因,保幼激素环氧水解酶(JHEH)作为JH的主要降解酶,通过调控JH滴度水平在昆虫滞育中发挥重要作用。为研究JHEH在蠋蝽生殖滞育中的调控功能,克隆获得了蠋蝽JHEH基因(AcJHEH),该基因编码452个氨基酸,具有典型环氧水解酶结构特征,无跨膜结构域,存在1个信号肽位点。同源性及系统进化分析结果表明,AcJHEH在不同物种间具有较高保守性,与茶翅蝽(Halyomorpha halys)的JHEH相似性较高,达65.46%。利用RT-qPCR技术测定了AcJHEH在蠋蝽不同组织及滞育不同时期的表达量,发现AcJHEH表达量在滞育诱导期先下降后升高,滞育诱导20 d时表达量最低;滞育初期(诱导40 d)表达量最高,滞育维持期(诱导50~60 d)的表达量稳定在较高水平,与成虫初羽化时水平接近。AcJHEH在滞育蠋蝽的头部表达量最高,其次是中后肠和脂肪体,在卵巢中表达量最低。利用RNAi敲降蠋蝽初羽化成虫的JHEH基因表达后,雌虫体内的卵黄蛋白原(vitelliogenin,Vg)基因表达量上升,卵黄沉积明显,推测滞育诱导期高表达的JHEH基因可能通过抑制Vg基因的表达,抑制卵黄蛋白沉积和卵巢发育,从而促进蠋蝽的生殖滞育。本研究结果为解析JHEH在生殖滞育中的调控作用提供了参考依据。

紫苏磷脂酸磷酸水解酶基因(PfPAH1)的鉴定及功能分析

本文基于紫苏基因组数据筛选获得两条PfPAH1基因序列,分别命名为PfPAH1-1和PfPAH1-2。应用生物信息学工具分析PfPAH1s蛋白理化性质、功能结构域及系统进化。定量PCR(qRT-PCR)检测PfPAH1s在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子的表达谱。进一步克隆到高表达的PfPAH1-1基因的编码序列并进行烟草瞬时转化以鉴定其功能。结果表明,PfPAH1-1和PfPAH1-2基因的开放阅读框(ORF)长度均为2715 bp,编码904个氨基酸残基,含有Lipin_N、Lipin_mid和属于HAD_like超家族的LNS2三个保守结构域。系统进化分析显示紫苏PfPAH1-1蛋白与唇形科植物一串红的SsPAH1亲缘关系最近,其次是葡萄和芥菜。PfPAH1-2蛋白则与唇形科的芝麻SiPAH1亲缘关系最近,其次为油橄榄,紫苏和芝麻均为油料作物,推测PfPAH1-2和SiPAH1可能具有相似功能。qRT-PCR分析表明PfPAH1-1和PfPAH1-2基因均在开花后40 d种子中表达量最高,预示着其可能参与油脂合成积累。烟草瞬时转化揭示过表达PfPAH1-1基因烟草叶片总脂肪酸及中性脂含量均高于野生型烟草,然而磷脂含量降低。

蜂巢小甲虫保幼激素环氧水解酶基因JHEH1和JHEH1-2生物信息学及表达分析

保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)是调节昆虫保幼激素(juvenile hormone, JH)代谢的关键酶之一,是选择性杀虫剂的潜在靶标。本研究利用生物信息学方法对蜂巢小甲虫JHEH1和JHEH1-2基因编码蛋白的理化特性、结构特征和系统进化进行分析,采用RT-qPCR技术检测并分析蜂巢小甲虫成虫不同发育时期卵巢(未出土,1日龄、2日龄和3日龄)和未出土成虫不同组织(卵巢、脂肪体、足、胸部、头)中JHEH1和JHEH1-2的相对表达量。结果表明,预测JHEH1编码460个氨基酸,等电点(pI)为8.06,蛋白分子式C_(2425)H_(3707)N_(603)O_(660)S_(16);JHEH1-2编码461个氨基酸,等电点(pI)为8.70,蛋白分子式C_(2420)H_(3713)N_(597)O_(656)S_(15);两者分子量均为52 kDa,均具有环氧水解酶的N端结构域。系统进化树分析表明,蜂巢小甲虫JHEH1与光肩星天牛Anpoploppor aglabripennis的JHEH聚为一支;JHEH1-2较为保守,其分支处于的置信度较低。RT-qPCR结果显示,蜂巢小甲虫JHEH1和JHEH1-2在成虫不同发育时期和各组织中均有表达,且在未出土成虫的卵巢中高表达(P<0.05),表明JHEH在卵巢发育过程中发挥重要作用。本研究可为后续深入研究JHEH基因对蜂巢小甲虫生长发育调控机制提供理论基础。

基于Fosmid文库筛选山羊瘤胃源酯类水解酶基因及其原核表达验证

试验旨在挖掘瘤胃微生物中潜在的酯类水解酶基因并进行原核表达,研究其酶学性质及对芥子碱的降解效果。利用功能筛选方法,从前期构建的山羊瘤胃微生物Fosmid文库中鉴定出潜在的酯类水解酶基因,并在大肠杆菌中异源表达,通过酶活测定及芥子碱的降解研究来筛选功能酶,最后分析酯类水解酶的酶学性质。结果表明:从山羊瘤胃微生物Fosmid文库中鉴定到6个酯类水解酶基因Estg1、Estg2、Esty1、Estp、Estk1和Estk2,并在E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得的酯类水解酶的活性均高于空载对照(P<0.05),其中Estp和Estk1的活性最高,分别为205.33 U/mL和212.67 U/mL,其分子量为33、28 ku,且能够降解芥子碱,降解率分别为13.26%和11.66%;酯酶Estp和Estk1在温度为40℃、pH 11时活性最高,在40~50℃、pH8~11条件下相对稳定;金属离子Mn^(2+)和Ni^(2+)对酯酶Estp和Estk1的活性有促进作用(P<0.01),有机溶剂正己烷能增强其活性(P<0.05);而EDTA、金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)、Co^(2+)和Fe^(3+)、有机溶剂乙腈以及表面活性剂吐温-80和曲拉通X-100会抑制Estp和Estk1的活性(P<0.01)。本研究从山羊瘤胃宏基因组文库中筛选了2个高产酯类水解酶的基因,异源表达后具有嗜中温、耐碱、耐有机溶剂等特性,且能够降解芥子碱,可为酯类水解酶的深入挖掘及应用提供理论依据。

甲壳质酶蛋白-40、半胱氨酸蛋白水解酶-1及ASPECTS预测前循环大面积脑梗死介入取栓患者预后的价值研究

目的探讨甲壳质酶蛋白-40(chitinase protein-40,YKL-40)、半胱氨酸蛋白水解酶-1(cysteine proteolytic enzyme-1,Caspase-1)水平及ASPECTS对前循环大面积脑梗死介入取栓患者预后的预测价值。方法回顾性分析2020年6月—2023年2月于河北医科大学第一医院接受介入取栓治疗的180例前循环大面积脑梗死患者的病历资料。按照介入取栓3个月后的预后情况分为死亡组(41例)与存活组(139例),比较两组基线资料及介入取栓前YKL-40、Caspase-1水平。采用Cox回归分析探讨大面积脑梗死介入取栓预后的影响因素。利用ROC曲线分析探讨YKL-40、Caspase-1水平及ASPECTS预测大面积脑梗死介入取栓预后的效能。结果死亡组患者年龄及梗死灶面积大于存活组,ASPECTS低于存活组(均P<0.001)。死亡组患者的血清YKL-40水平([141.37±12.40)μg/L vs.(115.05±11.40)μg/L]、Caspase-1水平([13.05±1.15)ng/L v s.(8.61±0.64)n g/L]均高于存活组(均P<0.001)。C ox回归分析结果显示,梗死灶面积大(HR 1.011,95%CI 1.001~1.022)、YKL-40水平高(HR 1.033,95%CI 1.001~1.066)、Caspase-1水平高(HR 1.576,95%CI 1.264~1.966)均是前循环大面积脑梗死介入取栓后死亡的独立危险因素,ASPECTS高(HR 0.887,95%CI 0.794~0.991)是前循环大面积脑梗死介入取栓后死亡的保护因素。ROC曲线分析结果显示,血清YKL-40、Caspase-1水平及ASPECTS联合预测前循环大面积脑梗死介入取栓后死亡的效能(AUC 0.940,95%CI 0.890~0.990)优于上述3项指标单独预测[AUC分别为0.869(95%CI 0.806~0.933)、0.897(95%CI 0.828~0.966)、0.724(95%CI 0.642~0.806)]。结论YKL-40、Caspase-1水平及ASPECTS均与前循环大面积脑梗死介入取栓患者预后密切相关,可作为患者预后的预测指标。

铁皮石斛糖苷水解酶GH3基因家族鉴定及表达模式分析

利用生物信息学方法对铁皮石斛GH3基因家族成员进行筛选、鉴定,对其基因结构、蛋白理化性质、亚细胞定位、系统进化、蛋白质二级结构及跨膜预测、基序及染色体定位进行分析,同时分析GH3基因家族在不同组织以及低磷与正常磷水平下的表达模式。在铁皮石斛全基因组中筛选得到13个GH3家族基因,其中一个基因存在可变剪切,表达为14个GH3蛋白。GH3基因家族蛋白可分为3个亚家族,各亚家族中不同基因相对保守;各成员均含有内含子与外显子,内含子相位在0~2,13个基因分布在8染色体上。GH3基因家族在铁皮石斛的8个组织中均有表达,其中白根和花蕾表达量高,茎和唇瓣低,推测GH3基因家族可能参与铁皮石斛根系生长以及开花现蕾。低磷与正常磷水平表达结果表明,低磷水平下叶中基因LOC 110110392、LOC 110100144表达上调,根中基因LOC 110095762、LOC 110107269表达上调。该研究对铁皮石斛糖苷水解酶GH3基因家族成员生物信息学、在不同组织以及正常磷与低磷条件下的表达水平进行研究分析,筛选响应低磷信号的糖苷水解酶基因,为后期研究糖苷水解酶参与低磷条件下铁皮石斛多糖代谢调节机制提供研究基础。

血清白细胞介素1β、半胱胺酸天冬氨酸蛋白水解酶3水平与颅内动脉瘤患者术后发生脑血管痉挛的关系

目的探讨血清白细胞介素1β(IL-1β)、半胱胺酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)水平与颅内动脉瘤患者术后发生脑血管痉挛的关系。方法选取2020年1月至2022年1月于北京市平谷区医院及首都医科大学附属北京天坛医院拟行介入栓塞术手术治疗的80例颅内动脉瘤患者,根据术后脑血管痉挛发生情况将其分为发生组(n=33)和未发生组(n=47)。收集所有患者的基线资料,记录所有患者的实验室指标,采用Pearson相关性检验分析血清IL-1β、Caspase-3之间的相关性,采用Logistic回归模型分析颅内动脉瘤患者术后发生脑血管痉挛的影响因素,绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析血清IL-1β、Caspase-3对颅内动脉瘤患者术后发生脑血管痉挛的预测价值。结果发生组患者血清IL-1β、Caspase-3水平、白细胞计数均高于未发生组患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。多因素分析结果显示,血清IL-1β、Caspase-3及白细胞计数水平升高均是颅内动脉瘤患者术后脑血管痉挛发生的危险因素(OR﹥1,P﹤0.05)。Pearson相关性检验结果显示,血清IL-1β与血清Caspase-3之间呈正相关(r=0.853,P﹤0.01)。血清IL-1β、Caspase-3及两者联合预测颅内动脉瘤患者术后发生脑血管痉挛的曲线下面积(AUC)分别为0.784、0.783、0.845,预测价值均较高,两者联合预测的AUC最大。结论颅内动脉瘤患者术后脑血管痉挛发生风险较高,血清IL-1β、Caspase-3水平升高与颅内动脉瘤患者术后脑血管痉挛发生有关,且两者联合预测术后脑血管痉挛发生的效能较高,可能成为临床预测术后发生脑血管痉挛及治疗靶点的生物学指标。

禾谷炭疽菌中糖苷水解酶互作蛋白找寻及遗传关系预测分析

【目的】糖苷水解酶(GH)作为破坏植物细胞壁的重要酶类,在植物病原菌致病过程中发挥着重要作用。为了解GH蛋白之间的互作机制,对禾谷炭疽菌GH互作蛋白及其遗传关系进行研究。【方法】基于前期所获得的禾谷炭疽菌GH蛋白,通过STRING网络在线分析不同GH蛋白之间的互作关系,通过ProtComp v9.0在线分析GH蛋白的亚细胞定位,利用Clustal X和MEGA 11软件对GH蛋白进行多重比对和构建系统进化树,并选取互作关系多的蛋白通过GRAMM在线软件进行分子对接。【结果】禾谷炭疽菌中89个GH蛋白之间的互作表现为3大类的聚集关系,其中,Ⅰ类聚集了34个GH蛋白,Ⅱ类聚集了33个GH蛋白,Ⅲ类聚集了22个GH蛋白;85个GH蛋白定位于细胞外(分泌),仅4个GH蛋白定位于细胞核、内质网、细胞质膜。系统发育树分为4大类,有一些GH亚家族蛋白只存在于一类中,也有一些GH亚家族蛋白同时存在于两类及两类以上中;分子对接发现,互作蛋白之间均存在多个相互作用的氨基酸残基位点。【结论】禾谷炭疽菌GH蛋白之间有3种互作情况,即不同亚家族GH蛋白之间的互作、同一亚家族中不同GH蛋白之间的互作以及不存在互作关系;大部分GH蛋白定位于细胞外;大多数GH亚家族中不同蛋白亲缘关系较近,蛋白之间可通过氢键相互作用。

有机溶剂和聚电解质提升MHET水解酶催化性能

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一种广泛应用的塑料,但由于其难以自然降解导致严重的污染问题.PET水解酶和对苯二甲酸单乙二醇酯水解酶(MHETase)被认为是级联降解PET的关键酶,但尚未实现工业应用,本文针对MHETase开展稳定性研究以促进其工业开发.首先,选用4种不同的水溶性有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇和乙腈构建反应体系探寻最佳的MHETase反应条件,随后进一步研究有机溶剂和聚电解质预处理对MHETase催化活力和稳定性的影响.结果表明,当反应体系DMSO含量不高于10%时MHETase的活力几乎不受影响,其他条件下有机溶剂均会抑制MHETase活性,但这种抑制作用是可逆的,即该抑制可以通过去除有机溶剂来恢复.此外,低浓度的有机溶剂预处理能够提高MHETase的催化活力,且DMSO预处理能够提升MHETase的储存稳定性及热稳定性,MHETase在4℃下10%DMSO中储存96 h后的活力为原有活力的113%,在30℃下10%DMSO中孵育6 h后也能保持原有活力的103%.研究发现,MHETase活力可以通过阴、阳离子聚电解质孵育来提升,与等量阴、阳离子聚电解质共孵育的MHETase在4℃下10%DMSO中储存144 h也能保持118%的活力,但与DMSO预处理相比,聚电解质预处理对MHETase活力提升程度有限.本研究系统考察了有机溶剂和聚电解质对MHETase催化性能的影响,并指出DMSO和聚电解质的预处理有助于MHETase在常温下的储存和应用,为MHETase的工业应用提供了更多参考.

芽孢杆菌环氧化物水解酶的生信分析、异源表达及催化活性研究

环氧化物水解酶是一类能催化环氧化物水解生成相应邻位二醇的酶,环氧化物水解酶不需辅酶与金属离子,具有底物专一性,在药物中间体的制备方面具有广泛的利用价值.在Bacillus sp.V3-13中的环氧化物水解酶含有383个氨基酸残基,理论分子量为44119.61 Da,理论等电点为5.33,不稳定系数为39.25,总平均亲水性为-0.493,属于稳定的亲水蛋白.该酶无信号肽、二硫键、跨膜区,含有EHN(pfam06441)和MenH(COG0596)保守结构域.该文利用pET-28a(+)作为载体、E.coli BL21(DE3)作为宿主,对该酶在30℃、0.4 mmol·L^(-1) IPTG、诱导10 h的条件下成功进行了表达.经镍柱亲和层析纯化后,获得了电泳纯的重组环氧化物水解酶.重组环氧化物水解酶在20 min内对苄基缩水甘油醚、3-(1-萘氧基)-1,2-环氧丙烷和氧化苯乙烯的水解率分别为14.40%、11.05%和8.17%.

有机磷水解酶异源表达纯化及抗乙基对氧磷中毒能力初步评价

目的异源表达纯化有机磷水解酶(OPH),初步评价其动物体内抗乙基对氧磷中毒能力。方法构建OPH的大肠杆菌表达菌株,采用镍柱亲和色谱及凝胶过滤色谱进行纯化,对纯化产物进行蛋白质谱鉴定;以乙基对氧磷为底物测定酶活力及其动力学常数K_(m),V_(max),k_(cat)和k_(cat)/K_(m);12只SD大鼠随机分为OPH组和溶剂对照组,OPH组按1 mg·kg^(-1)剂量iv给予OPH溶液,对照组给予等体积生理盐水,给药后2组立刻sc给予2倍半数致死量(LD_(50))乙基对氧磷(0.86 mg·kg^(-1))染毒,观察大鼠状态,对中毒症状进行评分。对存活大鼠每隔24 h重复sc给予2倍LD_(50)乙基对氧磷,根据大鼠存活情况与中毒症状分别绘制生存曲线与症状评分图,评价OPH的抗有机磷中毒能力。结果成功构建了OPH的大肠杆菌表达菌株,经过两步纯化后由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳表征得单一条带,OPH纯度较高,经蛋白质谱测定制备蛋白与目标蛋白序列一致;以乙基对氧磷为底物时,OPH的Km=7.5×10^(-5)mol·L^(-1),V_(max)=2.2×10^(-7)mol·L^(-1)·s^(-1),k_(cat)=158.4 s^(-1),k_(cat)/K_(m)=2.1×10^(6) L·mol^(-1)·s^(-1);对照组大鼠sc给予2倍LD_(50)乙基对氧磷后,出现严重中毒症状,15 min内全部死亡,实验组大鼠在首次染毒后均未出现中毒症状,连续染毒后中毒症状逐渐加重直至第4天全部死亡。结论成功制备高纯度OPH,且OPH在大鼠体内能有效对抗乙基对氧磷中毒。

植物病原丝状真菌中糖苷水解酶的研究进展

植物病原丝状真菌中的糖苷水解酶是碳水化合物活性酶中的一类,在植物病原真菌侵染植物的过程中通过分解其细胞壁中的碳水化合物组分从而实现真菌对植物免疫防卫反应的进一步操控。前期对植物病原丝状真菌中碳水化合物活性酶展开了综述性评价,近年来,随着生物技术和生物信息学、分子生物学等试验方法的发展,以及基因组学、代谢组学、蛋白质组学、转录组学等组学的不断发展,研究者对糖苷水解酶的研究不断深入和完善。旨在对糖苷水解酶进行综述性评价,重点关注其分类、功能及研究方法。在分类方面,主要涉及底物特异性、结构相似性、催化作用机制和水解位置。在功能方面,重点研究其在稻瘟病菌菌、禾谷炭疽病病菌和希金斯炭疽病病菌等病原丝状真菌侵染过程中的作用。此外,还探究了分离和鉴定、生物学特性及基因克隆和表达分析等方面的研究方法。研究的最终目标是深入分析上述研究成果,系统梳理糖苷水解酶在上述真菌中的功能,以期为今后解析病原丝状真菌中糖苷水解酶的功能提供重要理论支撑,并对今后学术界的研究重点、难点及热点进行展望,为未来开展糖苷水解酶功能解析、互作蛋白找寻及加工应用提供研究思路。

烟草糖苷水解酶GH3基因家族鉴定与表达分析

糖苷水解酶GH3基因家族在植物的糖代谢和生长发育中起着重要作用,而烟草GH3基因家族目前尚未见相关鉴定和分析研究报道。本研究采用生物信息学方法在烟草基因组中鉴定GH3家族基因,并对其在不同组织中及逆境条件下的表达模式进行了分析。结果表明,在普通烟草K326的基因组中共鉴定出35个GH3基因,其中23个被定位在14条染色体上,存在6对共线性基因;GH3家族蛋白均为热稳定性蛋白,其基因上游启动子区均包含多个激素和胁迫响应元件。转录组数据表明,GH3家族基因大多数在烟苗茎尖高表达,少部分在根和茎中高表达,表达量受光照时间影响;烟苗受到干旱胁迫后GH3家族成员都有不同程度的响应。挑选4个NtGH3基因进行qRT-PCR分析,结果表明,NtGH3-5、NtGH3-19、NtGH3-22、NtGH3-26可能参与响应低温以及ABA处理。这可为深入了解烟草GH3基因家族及其功能提供依据。

基于水解酶系均衡的米曲霉菌种复壮选育和诱变育种研究

针对米曲霉菌种在工业酿造过程中出现自发突变导致菌种衰退的问题,本研究以生产用米曲霉菌种X3042和JN1为研究对象,通过分纯单菌落并经固态发酵后测定其水解酶系活力的方法,复壮选育获得菌株X3042-4和JN1-3。酶活测定结果显示,X3042-4的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶活力较初始菌株X3032分别增加了22.37%、10.91%、15.23%和27.71%,而JN1-3与初始菌株JN1相比分别增加了10.71%、2.88%、7.81%和7.17%。针对复壮菌株的淀粉酶活力偏低问题,紫外诱变选育出菌株JN1-3-4,其淀粉酶活力是初始菌株JN1-3的2.69倍,并且蛋白酶、纤维素和脂肪酶活力也有不同程度的增加。本研究为工厂用发酵菌种的复壮选育和诱变育种提供了技术参考。