动物细胞永生化研究进展

细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不多、永生化技术相对较难,肿瘤风险以及动物福利伦理等原因,还不能满足研发需求。目的细胞永生化不仅可以永久保存动物细胞遗传资源,还对多种疾病的诊断、治疗及细胞基质疫苗的研发等提供支持。本文就动物细胞永生化的原理、永生化机制及方法的研究最新进展进行综述,为未来的生物医学研究和应用提供参考。

永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

白芨外泌体的分离及对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的凋亡保护研究

探索鲜白芨(Bletilla striata)外泌体对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的生物活性,为其在护肤品上的开发提供数据。聚乙二醇(PEG)沉淀法提取白芨外泌体,透射电镜鉴定,BCA法测蛋白浓度;细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK8)法检测Hacat细胞存活率,流式双染检测凋亡,蛋白印迹法检测凋亡相关通路蛋白。白芨外泌体呈茶杯状具双层膜,平均粒径69.63 nm,每克鲜白芨含外泌体浓度为5.24E+8 Particles,内含蛋白19.53μg;白芨外泌体(≥5μg/mL)可显著提高体外Hacat细胞存活率(P<0.05);10μg/mL白芨外泌体处理48h,可显著降低H_(2)O_(2)氧化造模引起的Hacat细胞早凋亡、晚凋亡和总凋亡的细胞比例(P<0.01),同时,模型组caspase-9和caspase-3表达显著上升,外泌体处理能显著降低其表达,而Bcl-2表达在组间无差异(P<0.05)。PEG沉淀法分离的白芨外泌体,可促进体外Hacat生长,抑制H_(2)O_(2)引起的细胞凋亡且与蛋白caspase-9和caspase-3相关。

构建永生化细胞的研究进展

人类细胞在正常增殖分裂过程中会到达衰老期(M1期)和致死期(M2期),细胞会停止分裂并凋亡,这种不可逆的生理过程是机体内在的一种抗肿瘤机制。然而细胞有限的增殖能力限制了细胞在基础实验、临床应用和生物工程等领域的研究。建立稳定、持续增殖且结构功能正常的永生化细胞系是当前细胞生物学研究的热点和难点。永生化细胞也是生产工程化血细胞的重要来源。本综述总结了永生化细胞的构建技术和可逆转性永生化细胞的研究进展。

树鼩角膜基质永生化细胞系的构建及其在病毒感染性方面的研究

目的建立树鼩永生化角膜基质细胞(corneal stromal cells,CSCs)系,并探讨其在病毒感染中的应用。方法利用组织块贴壁培养法分离培养树鼩原代CSCs,将携带SV40T基因的慢病毒转染细胞后,再挑取单克隆进行传代培养,传至50代以上进行形态学观察并与40代细胞形态进行比较,波形蛋白(vimentin)和SV40T基因免疫荧光鉴定、核型鉴定、细胞增殖曲线测定。用单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)(McKrae株)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及甲型流感病毒H1N1(PR8株)在该细胞上进行病毒感染实验。结果传至50代以上的树鼩永生化CSCs呈梭形,细胞形态结构与40代相比仍较好。vimentin和SV40T基因免疫荧光表达阳性。增殖曲线结果显示:细胞生长旺盛,第4~5天时处于对数生长期。原代细胞核型的染色体数稳定为62条,而永生化细胞第21、56代突变为64条且保持稳定。病毒感染实验显示:树鼩永生化CSCs对HSV-1(McKrae株)、ZIKV(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及H1N1(PR8株)病毒敏感,产生较高感染滴度,分别为1.32×105、5.62×106、2.69×107、7.76×104CCID50/mL。结论成功建立了树鼩永生化CSCs细胞系,提示该细胞系可用于单纯疱疹病毒、寨卡病毒、登革病毒和甲型流感病毒感染眼角膜疾病的作用机制及抗病毒药物的研究。

枸杞籽油对中波紫外线诱导人永生化角质形成细胞光损伤的防护作用

明确枸杞籽油对中波紫外线(ultraviolet B,UVB)诱导人永生化角质形成细胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)光损伤的防护作用,进一步提高枸杞籽油的利用率。采用GB 5009.168—2016、GB 5009.83—2016、DB64/T 1514—2017、《保健食品中功效成分检测方法》和GB 5009.82—2016(第一法)提供的方法分别测定枸杞籽油主要活性成分脂肪酸、β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素、谷甾醇以及维生素E的含量,利用HaCaT细胞构建UVB光损伤模型,检测枸杞籽油对UVB诱导的光损伤HaCaT细胞存活率、凋亡率、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、凋亡相关细胞因子和炎症因子的影响。结果表明,与模型组相比,枸杞籽油可明显提高UVB光损伤HaCaT细胞的存活率(P<0.05),促进抗凋亡因子B淋巴细胞瘤/白血病-2 mRNA的表达(P<0.01),抑制细胞内ROS的生成(P<0.05),降低细胞凋亡率(P<0.01),抑制细胞凋亡相关因子Bcl-2相关X蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9和p53 mRNA的表达(P<0.01),减少炎症因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6的蛋白含量及mRNA表达(P<0.05)。结果表明枸杞籽油可通过调控细胞凋亡及减轻炎症反应来缓解UVB所致HaCaT细胞光损伤。

紫铆花素对人黑色素瘤细胞A375与人永生化角质形成细胞HaCaT共培养细胞生物学活性的影响

目的探讨紫铆花素对人黑色素瘤细胞A375与人永生化角质形成细胞HaCaT共培养细胞生物学活性的影响。方法建立A375细胞与HaCaT细胞的共培养细胞体系,实验分为对照组(等体积培养液),紫铆花素低、中、高剂量组(以下简称低、中、高剂量组,0.5,1.0,5.0μg/L)。采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;采用流式细胞仪检测细胞的周期分布和线粒体膜电位;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法检测干细胞因子(SCF)和其受体c-Kit,以及小眼畸形相关转录因子(MITF)的mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞酪氨酸酶相关蛋白1,2(TRP-1,TRP-2)及SCF,c-Kit,MITF的蛋白表达水平。结果与对照组比较,中、高剂量组细胞的增殖率均显著升高(P<0.01);与对照组比较,各剂量组G0/G1期细胞比例均显著降低,S期和G_(2)/M期细胞比例均显著升高(P<0.01),高线粒体膜电位细胞比例均显著升高(P<0.05或P<0.01),SCF,c-Kit,MITF的mRNA表达水平及SCF,c-Kit,MITF,TRP-1,TRP-2的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论紫铆花素可能通过调节SCF,cKit,MITF的表达而影响A375细胞与HaCaT细胞共培养细胞的增殖、细胞周期和线粒体膜电位等细胞生物学活性。

乳腺癌源性肿瘤相关成纤维细胞的永生化及鉴定

目的:构建可在体外稳定培养和传代的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并鉴定其生物学特征。方法:取人乳腺浸润性导管癌组织,采用酶解-组织块培养法和差速贴壁法分离纯化CAFs,用免疫荧光检测α-肌动蛋白、血小板源性生长因子受体β和广谱细胞角蛋白;采用人端粒酶表达慢病毒感染CAFs使其永生化;在商品化FGM-2(fibroblast growth medium-2)培养基的基础上添加谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗坏血酸以优化培养条件,在体外连续培养传代,并用β-半乳糖苷酶染色鉴定各代细胞中衰老细胞的比例。对构建成功的CAF1、CAF2和CAF3细胞系进行高通量RNA测序,分析差异表达基因(DEGs)及其相关信号通路;基于3个CAF细胞系CAF亚型标志基因的表达水平,鉴定其生物学特征。结果:成功分离原代CAFs,并构建3株永生化CAF细胞系;成功优化了CAFs的培养条件,使CAF细胞系在体外培养时不易发生细胞衰老表型(t=2.972、7.049,均P<0.05);RNA测序结果分析显示,CAF1与CAF2有3150个DEGs,CAF2与CAF3有3544个DEGs;而CAF1与CAF3有343个DEGs。对DEGs进行GO富集分析(gene ontology enrichment analysis)表明,CAF2高表达基因主要参与蛋白水解、细胞外基质重塑、血管生成和细胞黏附等信号通路;CAF1和CAF3高表达基因主要参与细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂等信号通路。对3个CAF细胞系亚型特征性分析表明,CAF1和CAF 3具有炎性CAFs特征,CAF2具有基质型CAFs特征。结论:成功构建得到3株可在体外稳定传代且具有不同生物学特征的CAF细胞系,为CAFs在乳腺癌发生和进展中作用机制的研究提供了可靠的细胞模型。

土大黄提取物对人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT)增殖的影响

目的土大黄根醇提物化学组分分析及其对人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)增值的影响。方法利用D101大孔树脂、HPLC对土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)进行分离纯化、主要化学组分分析,同时观察对HaCaT细胞增殖的作用。结果通过D101大孔树脂处理得到了30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位的出膏率分别为5.4%、14.8%、11%、0.72%。HPLC检测得知,30%洗脱部位占0.151%,成分为大黄素;50%洗脱部位占1.952%,成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;70%洗脱部位占21.409%,成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;90%洗脱部位占1.927%,成分为大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)占1.591%,成分为芦荟大黄素和大黄酸;对HaCaT细胞增殖的抑制作用由强到弱依次为90%乙醇洗脱部位、70%乙醇洗脱部位、50%乙醇洗脱部位、70%乙醇提取物(原粗提取物)、30%乙醇洗脱部位,抑制率分别为17.55%、16.66%、10.99%、10.25%和7.86%。结论土大黄根醇提物70%乙醇洗脱部位是最佳富集部位(21.409%)、也是最佳洗脱部位。土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)及其不同洗脱部位均对HaCaT细胞增殖具有一定的抑制作用,其作用可能与土大黄所含的蒽醌类成分有关,提示土大黄具有治疗银屑病的作用。

永生化下颌骨髁突软骨细胞的微囊化研究

为了探讨微囊包裹软骨细胞在软骨组织工程中的适用性 ,根据气流切割原理采用海藻酸钠 -多聚赖氨酸 -海藻酸钠 ( APA)对永生化下颌骨髁突软骨细胞 ( Im mortalized mandibular condylar chondrocyte,IMCC)进行微囊包裹。用倒置显微镜观察、台盼蓝染色、细胞记数、HE染色、免疫组化等方法检测微囊的大小、细胞的生长及微囊内组织的软骨特性等情况。研究发现 ,IMCC可在微囊内存活 ,活细胞率 >80 % ,微囊直径平均 779μm。细胞数量随着培养时间的延长逐渐增多 ,约 2 0 d左右达到平台期 ,细胞在囊内呈簇样生长 ,高表达软骨特异的蛋白多糖和 型胶原。提示 IMCC可在微囊内形成类软骨组织样结构 。

农药重组全长抗体实现抗体的“永生化”

近日,中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所农产品质量安全检测技术创新团队首次制备了乙嘧酚农药重组全长抗体,实现了抗体的“永生化”,相关研究成果发表在《危害物杂志(Journal of Hazardous Materials)》。

肝细胞永生化研究进展

许多研究表明,肝细胞治疗已成为肝功能衰竭及先天性肝代谢疾病的主要治疗方法,但是肝细胞获取困难。近年来,随着分子生物学和基因技术的发展,肝细胞永生化已成为可能。本文就肝细胞永生化的研究进展进行综述。

生物细胞的永生化和去永生化在细胞镇痛中的应用进展

慢性疼痛和晚期癌痛的治疗研究一直是生命科学的重要课题之一,传统的药物止痛有着诸多不可避免的缺陷。目前,细胞镇痛在动物实验研究方面获得了大量的资料和经验,虽然生物细胞的永生化可暂时解决镇痛细胞的来源和存活等问题,但因其潜在的致瘤性,限制了其推广应用。迄今,随着可诱导的Cre-LoxP重组酶系统在细胞去永生化中的应用,在镇痛细胞的来源、存活和安全性等方面取得了突破性进展,为细胞镇痛的临床应用奠定了基础。

细胞永生化技术研究进展

细胞永生化作为细胞生物学研究的热点,在细胞实验中发挥很大的作用,使目的细胞永生化,建立永生化细胞系,可以更好地开展细胞实验。细胞永生化技术的成功应用,不仅为生物实验研究提供了有力的工具,也为有效准确地诊断疾病提供了新道路。本文在细胞永生化基本机制的基础上,就细胞永生化技术方法、检测方法以及存在的问题等方面研究进展进行概述。

永生化肝细胞系研究进展

衰老是体外培养的哺乳动物细胞的一般特性。从动物或人的组织细胞取材培养，体外经过第一次传代后的具有增殖能力的细胞群体称为细胞系。一些细胞系在体外有一定寿命，只能有限期传代，一般不超过50代，称为有限细胞系；另一类体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力、可以无限传代的细胞系称为永生化细胞系。

细胞永生化与细胞癌变之间关系的研究进展

背景:永生化细胞和肿瘤细胞在基因表达水平、蛋白水平及表型水平等方面存在诸多区别和联系,目前对两种细胞之间关系的认识仍存在争议。目的:分析永生化细胞与肿瘤细胞之间的关系,总结肿瘤细胞生成有关理论的研究进展和前景。方法:应用计算机检索PubMed数据库和SpringerLink数据库(2001-01/2010-01),以"cellular immortality,cancer mechanism"为检索词。应用计算机检索中国知网数据库(2001-01/2010-01),以"细胞永生化、癌变机制"为检索词。结果与结论:共收集95篇文献,中文35篇,英文60篇。排除发表时间较早、重复及类似研究,最终应用文献41篇。永生化细胞不是肿瘤细胞,普遍认为细胞永生化是细胞癌变过程中的必经阶段,若是如此,肿瘤细胞应易于培养。而实际上肿瘤细胞初代培养时非常困难,因此有的学者就二者之间的关系提出质疑。目前有关肿瘤细胞生成的理论存在非整倍体假说、DNA永生化链假说、肿瘤干细胞假说等。对二者之间关系的进一步研究,有利于永生化细胞的应用及肿瘤的治疗。

不同动物原代细胞的永生化方法及其应用

细胞永生化是一项运用多种手段人为地将不同类型的外源性永生化基因导入目的细胞,打破细胞的正常分裂周期并使其具备无限增殖能力的技术,现已被广泛应用于不同动物原代细胞中。为了探究促使细胞永生化的几种常用方法如何介导细胞永生化,不同方法之间的相关因素有何关联和区别,以及这些方法如何应用到不同动物的细胞中,本文通过对几种促使细胞永生化的作用机制、方法及其在不同动物细胞(如猪单核细胞/巨噬细胞系、牛肠上皮细胞系、牦牛瘤胃上皮细胞系、鸡前脂肪细胞系、鸡胚胎成纤维细胞系、鸭肠上皮细胞系、兔黑色素细胞系和斑节虾淋巴细胞系等)中的应用现状进行概述,发现细胞永生化主要涉及端粒与端粒酶激活、病毒基因[如人类疱疹病毒(EBV)、猴空泡病毒40(SV40)和人乳头瘤病毒(HPV)基因]的转染整合,以及运用Cre-LoxP介导的重组系统对细胞进行可回复性永生化等多个方法,且其核心都是对细胞端粒酶活性的调控。此外,不同动物细胞可通过上述多种方法实现永生,但是也有极少部分细胞受其自身性质的影响,只可选择某一特定方法。因此,对不同动物原代细胞永生化方法及其应用进行研究,不仅可为建立具备功能性的永生化细胞系提供理论依据,也为其在基础分子生物学研究和生物医药领域更广泛的潜在应用提供科学资料。

永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立

目的 :建立永生化人成牙本质细胞系 .方法 :采用脂质体转染法 ,将人端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因导入原代人成牙本质细胞样细胞 .培养液加G4 18筛选约 1mo后 ,抗性细胞克隆形成 ,滤纸片法转移、扩增并连续培养 .检测转染细胞内hTERT的基因整和和表达 ,初步分析细胞系的生物学特征 .结果 :hTERT稳定转染入目的细胞 ,表达mRNA及其蛋白 .转染后共获得 5个细胞克隆 ,克隆 5b来源的细胞在体外长期连续培养下生长良好 ,具有较高碱性磷酸酶活性 ,在转录水平表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白 ,细胞核型正常 .该细胞系至今传代 5 6代 ,约 6mo,命名为hTERT hOd l.结论

宫颈永生化细胞和癌细胞的α、β、γ–微管蛋白比较分析

目的:探讨中心体α、β、γ–微管蛋白在人鳞状上皮宫颈永生化细胞(H8细胞株)和癌细胞(Caski细胞株)的表达差异及其在宫颈癌发生发展过程中的作用。方法:采用免疫细胞化学SP法检测中心体α、β–微管蛋白在人宫颈永生化细胞和癌细胞中的表达差异,提取两株细胞的骨架蛋白并用Western blotting对α、β、γ–微管蛋白的表达水平进行半定量分析。结果:Caski细胞中α、β–微管蛋白表达水平高于H8细胞,差异均有统计学意义(P<0.05)。半定量分析α、β、γ–微管蛋白,Caski细胞中的表达量高于H8细胞。结论:中心体异常可能是宫颈癌细胞恶性表型的特征之一,以中心体微管蛋白为治疗靶点的研究有着可期待的前景。

人乳头状瘤病毒诱导人胚食管上皮永生化细胞恶性转化

为了证实HPV18E6E7基因诱导的人胚食管上皮永生化细胞 (SHEE) 6 1代 (SHEE6 1)部份细胞 (SHEE6 1A)已经恶性转化 ,以寻找监控细胞早期恶性转化的方法。对培养的SHEE第 10代 (SHEE10 )和 6 1代 (SHEE6 1)细胞 ,用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及生长形式 ;用流式细胞仪分析细胞周期 ;用染色体G带核型分析和间期核染色体 1、7、8号着丝粒探针荧光原位杂交 (FISH)检测细胞染色体改变 ;用增殖优势克隆优选法选出生长快的细胞群体 ,接种裸小鼠和SCID小鼠。结果 :光学显微镜下见SHEE6 1细胞大小不等 ,重叠生长 ;电子显微镜下见细胞核多型性和核仁增大等增殖表型 ;流式细胞仪检测 ,SHEE6 1增殖指数和DNA >4n细胞高于SHEE10 ;SHEE6 1细胞染色体众数出现 5 7～ 6 0、6 3～ 6 5两亚群 ,1、7、9、13、17等染色体出现较多 3体、4体或 5体 ;FISH间期核 1、7号着丝粒数增多 ;SHEE6 1克隆优选的细胞SHEE6 1A接种SCID小鼠成瘤。这表明 :SHEE6 1细胞形态及生长特性有了改变 ,接触抑制减弱 ,高倍体和不整倍体细胞增多 ,染色体数目明显改变 ,SHEE6 1A接种SCID小鼠产生浸润性肿瘤 ,可以判定SHEE6 1部份细胞已恶性转化。用克隆优选法筛选和染色体检测可以监控永生化细胞早期恶性转化。