产河豚毒素微生物的研究进展

【背景】河豚毒素(TTX)是已知毒性较强的海洋毒素之一,广泛分布于河鲀等海洋生物体内。作为典型的钠离子通道阻断剂,TTX在镇痛、戒毒和抗心律失常等医疗领域展现出巨大的应用价值。然而,因获取困难和产量低下,TTX在医药领域的应用受到制约。因此,利用微生物发酵生产TTX成为了一个备受关注的研究方向。【目的】了解TTX的概况、产TTX微生物的分布和分类学多样性、TTX的发酵生产研究及TTX在微生物和环境中的迁移机制。【进展】目前,学界对TTX的理化性质已有较为清晰的认识,但其来源仍无明确定论。自1986年以来,科研人员陆续从河鲀、蓝环章鱼(Octopus maculosus)等生物及其栖息环境中分离出约150株产TTX菌株,其中以弧菌属、芽胞杆菌属为主,这些发现不仅为TTX的微生物起源说提供了强有力的理论支撑,也为后续利用微生物发酵生产TTX的研究奠定了坚实的基础。许多学者对TTX菌株发酵产毒中关键影响因素以及TTX迁移机制进行了探究,并取得了一定的成果。【展望】未来研究可重点考虑定向改造产TTX菌株、完善菌株大规模培养条件、探索影响菌株产TTX能力的关键因素以及分析微生物群落的相互作用对其合成TTX的影响,从而为TTX生物合成机制的阐明提供借鉴。【意义】通过对产TTX微生物的综述,阐明TTX的生物合成途径,为实现TTX规模化生产,解决TTX获取困难、成本高的难题,推动其在医药领域的应用提供理论参考。

HPLC-柱后衍生荧光法测定水产品中河豚毒素含量结果的不确定度评定

通过建立HPLC-柱后衍生荧光法测定水产品中河豚毒素含量的不确定度评定方法,量化分析测定结果的不确定度分量,并对各分量相对贡献进行比较。结果表明:测定结果的不确定度主要来源于标准品的校准过程、样品称量、实验过程移取及定容、样品重复实验误差、前处理过程中的回收率不同等。其中校准不确定度中标准溶液配制的不确定度贡献最多,称样量不确定度最小;当水产品中河豚毒素的含量为90.6μg/kg时,其扩展不确定度为0.69μg/kg(包含因子k=2)。

河豚毒素对BV-2细胞氧化应激损伤的诱导作用

目的探究河豚毒素(TTX)暴露对小鼠小胶质细胞BV-2的氧化应激损伤的诱导作用。方法选择BV-2细胞进行TTX体外暴露。首先采用不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μmol·L^(-1))TTX对BV-2细胞进行单独暴露,观察细胞形态和活力变化,利用CCK8法确定TTX联合暴露浓度。使用藜芦定(VTD)和毒毛旋花苷G(O)的混合物与TTX对BV-2细胞进行联合暴露,根据细胞形态和细胞活力验证BV-2细胞膜上离子通道类型。通过测定TTX单独暴露后乳酸脱氢酶(LDH)释放量、钙离子荧光量、活性氧(ROS)含量和细胞凋亡率水平,分析TTX暴露对BV-2细胞的影响。结果100μmol·L^(-1)TTX可改变BV-2细胞形态,抑制细胞活力。联合暴露情况下,TTX能够拮抗VTD和O混合物造成的细胞膜内外钠离子浓度差异,延缓细胞损伤状态。与对照组比较,100μmol·L^(-1)TTX可促使细胞膜通透性改变,释放4.01 U/g LDH。在100μmol·L^(-1)TTX暴露下分别升高细胞内钙离子和ROS水平,细胞相对荧光强度提升至84.78%和63.48%;100μmol·L^(-1)TTX暴露下,BV-2细胞凋亡率增加2.9倍。结论TTX暴露可以抑制BV-2细胞增殖能力,改变细胞膜的通透性,促使ROS在细胞内蓄积,诱导细胞氧化应激损伤,造成细胞凋亡。

胶体金免疫层析法快速检测水产品中河豚毒素的研究

该文将特异性识别河豚毒素的单克隆抗体加以胶体金标记用作示踪物,建立了豚毒素的胶体金免疫层析技术快速检测方法。优化了胶体金体系的pH值、抗原抗体浓度、离子浓度、表面活性剂种类以及样品前处理方法。结果显示:在最优条件下,建立的胶体金免疫层析法对河豚毒素的定量检出限为0.5 ng/mL,线性范围为0.8~10.6 ng/mL,定性检出限(裸眼判别)为12.0 ng/mL。河豚、织纹螺等样品的加标回收率为70.5%~110%,相对标准偏差为3.7%~7.1%,检测结果与LC-MS/MS法一致。所建立的胶体金免疫层析技术在现场快速检测方面具有良好的可行性和实用性,可用于大量样品的快速筛查和河豚毒素中毒后的快速诊断。

产河豚毒素菌株的筛选、鉴定及透析培养

河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)在镇静、镇痛、麻醉、戒毒等神经性疾病治疗方面效果显著且无致瘾性,因此具有极好的应用前景,但由于其从河豚体内提取的成本过高,所以难以大量推广应用。越来越多的证据表明TTX来源于河豚体内共生的微生物。我们从野生横纹东方鲀(Takifugu oblongus)肝脏中分离得到了一株产TTX较高的芽孢杆菌3G2(Bacillus sp. 3G2),通过ELISA和胶体金的方法检测到其发酵液TTX含量为35 ng/mL。将该菌株接种于专用透析培养器中,不断流加新鲜培养基实现连续培养,同时实现简化分离工艺,对发酵液进行小鼠生物活性检测、TTX试纸条检测,并通过河豚毒素抗体免疫共沉淀纯化得到TTX粗品后进行高效液相色谱鉴定均表明发酵液中含有TTX且含量较高。本研究通过筛选产TTX的优质菌株进一步了证实河豚毒素外源性假说,并初步验证了透析法生产河豚毒素的优越性,为后续商业应用提供实践性基础。

河豚毒素的药用研究进展

河豚毒素(TTX)是在河豚鱼和其他海洋动物中发现的一种神经毒素。它是一种电压门控钠通道(VGSCs)阻滞剂,能够选择性地与VGSCs外前庭上的α-亚基结合,阻止钠离子进入通道,从而产生药理活性。作为典型的钠离子通道阻滞剂,TTX具有显著的镇痛作用。TTX能够选择性地阻断Na+通道而不影响其他离子通道,减少了常用抗心律失常药物引起不良反应的概率,降低了用药风险。此外,TTX在戒毒等方面亦有显著作用。因此,TTX具有很大的成药潜力。本文对河豚毒素的结构与性质、作用机制、药理活性和在研制剂进行综述,为其成药性评价研究和在药学领域的应用提供概要性支撑。

河豚毒素处方前初步研究

目的考察河豚毒素(TTX)在不同溶剂中的溶解性及稳定性,以及温度和pH值对稳定性的影响。方法配制TTX不同介质的溶液,采用高效液相色谱法(HPLC)测定其在不同温度、不同pH缓冲液中的浓度,分析计算其溶解度及稳定性。结果TTX在pH值为3.5时溶解度最大,随着pH值增加其溶解度逐渐降低。TTX在强碱条件下降解最为迅速,在70℃条件下、0.1mol/L的氢氧化钠溶液中,20min即完全降解。稳定性试验结果同样证明TTX在碱性条件下的稳定性最差,在37℃、pH值=7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中,TTX浓度在1~10 h时开始持续降低,28天降解率为88.07±0.27%。结论TTX易溶于pH值=3.5的酸性水溶液,几乎不溶于碱性水溶液。其稳定性与温度、介质pH值密切相关,在酸性水溶液中较为稳定,在碱性条件下易降解,温度升高会加速其降解过程。

河豚毒素缓释微球含量测定方法的建立

目的建立测定河豚毒素(TTX)缓释微球中的含量检测方法。方法采用HPLC法,色谱柱为Agilent Zorbax SB C 18柱(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相为5%乙腈-95%8 mmol/L庚烷磺酸钠溶液(0.005%TFA,pH4.0);流速1.0 ml/min;紫外检测波长200 nm;柱温30℃。结果该方法专属性好,TTX在1~20μg/ml浓度范围内线性良好,该方法日内精密度、日间精密度、稳定性、重复性均符合要求,加样回收率范围为98.0%~102.0%。结论本研究建立了适用于缓释微球中河豚毒素含量测定的HPLC方法,该方法准确可靠,专属性强,可以实现定量检测。

河豚毒素研究综述

河豚毒素是自然界中所发现毒性最大的神经毒素之一,作为钠离子通道阻断剂主要麻痹肌肉与神经。鉴于对河豚毒素在医疗领域现有的认知,通过探讨河豚毒素的性质结构、原料来源、提取、分离及检测方法等方面的因素,旨在建立一种高效制备高纯河豚毒素的新工艺,从而加强高纯河豚毒素制品在局部麻醉、癌症晚期镇痛、戒毒等方面的应用。在解决毒性、注射有效剂量、安全剂量及给药方法等一系列难题上,高纯度河豚毒素有利于确保药品的稳定,提高药用的安全性。

分散固相萃取净化-UPLC-MS/MS法检测水产品中河豚毒素

对河豚鱼、织纹螺、贻贝等12种水产品共计120批次水产品中河豚毒素的定量分析,通过提取试剂的选择、净化方法的优化、净化试剂用量的研究、提取溶液pH的调整,以3.0、15、50μg·kg^(-1)3个添加水平,进行6次重复实验。结果显示实验平均回收率82.5%~93.3%,同一浓度水平RSD小于15%,线性在2~50 ng·mL^(-1)范围内达到0.999以上,检出限和定量限分别为1.0μg·kg^(-1)和3.0μg·kg^(-1)。表明以此前处理方法建立的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测水产品中河豚毒素含量可满足国内检测水产品中河豚毒素含量的要求。

间接竞争抑制性酶联免疫吸附试验测定豚毒鱼类中河豚毒素的研究

将河豚鱼样品的组织匀浆用０．１％乙酸溶液煮沸２次，合并滤液用乙醚脱脂２次，将水相用０．０５ｍｏｌ／ＬＰＢＳ稀释后（调ｐＨ６．５～７．０）供ＥＬＩＳＡ检测之用。结果表明，本法的最低检出浓度为１．０×１０－３ｍｇ／Ｌ（０．１ｎｇ／检测孔），线性范围为０．０１～１．０ｍｇ／Ｌ，方法的加标回收率为７３．８％～１１７．４％。用传统的小鼠生物试验比较了方法的准确性。测定结果表明，两种方法之间在统计学上无显著性差异（配对ｔ检验，Ｐ＞０．２），并具有良好的相关性（ｒ＝０．９１６）。

抗河豚毒素单克隆抗体的制备及其特性的初步研究

将用合成的匙孔形虫戚血蓝蛋白－甲醛－河豚毒素（ＫＬＨ－ＨＣＨＯ－ＴＴＸ）连接物免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Ｓｐ２／０融合，经３～４次亚克隆，建立了３个稳定分泌抗河豚毒素的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ｇ３、４Ｇ３、６Ｄ９。其中１Ｇ３和４Ｇ３分属ＩｇＧ２ｂ亚类，６Ｄ９属ＩｇＧ１亚类。腹水的抗体稀释度为１∶１０５～１：５×１０６。用竞争抑制性酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）测定三种抗体的最低反应浓度为１×１０－３ｍｇ／Ｌ。

柱后衍生高效液相色谱法测定水产品中河豚毒素含量

采用柱后衍生高效液相色谱法检测水产品中的河豚毒素含量，选用河豚（Takifugu）和织纹螺（Nassarius）为主要研究对象，样品先由0．1％乙酸提取，经过C18固相萃取柱净化。以庚烷磺酸钠为离子对试剂，应用反相离子对液相色谱分离河豚毒素，采用在线柱后衍生系统，在110℃高温和4mol·L^-1 NaOH强碱条件下，将河豚毒素衍生化成具有荧光特性的C9碱，荧光检测器定量检测。河豚毒素在5～1600ng范围内呈良好的线性相关，相关系数r=0．9997；1、2、8μg·g^-1，3个浓度水平添加样，日内和日间的回收率为80．9％～91．2％、相对标准偏差为1．93％～5．57％；方法定量限为1μg·g^-1；从添加样色谱图上看，河豚毒素目标峰附近没有干扰峰，定性准确性好。采用柱后衍生高效液相色谱法与小鼠生物法检测同一阳性河豚样，检测结果一致性好。实验结果表明，柱后衍生高效液相色谱法适用于水产品中河豚毒素的检测。

基于不同载体免疫原制备河豚毒素抗体的研究

目的比较牛血清白蛋白（BSA）和匙孔型血蓝蛋白（KLH）两种载体蛋白合成的河豚毒素人工抗原的免疫原性，并对其制备的抗体进行研究。方法用曼尼希法将半抗原河豚毒素（TTX）分别与大分子载体BSA和KLH偶联合成人工抗原TTX-BSA及TTX-KLH，免疫6～8周龄Balb／c雌性小鼠，制备多抗；以卵清白蛋白（OVA）为载体蛋白，同样用曼尼希法制备包被抗原TTX—OVA。TTX—KLH多抗血清同时采用TTX-OVA和TTX—BSA作包被抗原检测，抗血清经问接酶联免疫吸附法（iELISA）以及间接竞争酶联免疫吸附法icELISA）检测。结果经TTX-KLH免疫获得的多抗血清较TTX—BSA免疫获得的多抗血清特异性高。两种包被抗原的检测效价一致：均为1：64000，而以TTX—OVA为包被原的检测值稍高，与TTX进行竞争酶联免疫检测，其IC50值波动范围为10～20ng／ml。结论TTX—KLH具有更好的免疫原性。

河豚毒素中毒机理与临床救治探讨

探讨河豚毒素(TTX)的中毒机理及临床TTX中毒的有效救治措施。

免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定海洋生物中河豚毒素

建立了海洋生物中河豚毒素的免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱分析方法。采用1%乙酸-甲醇提取样品,提取液通过磷酸盐缓冲液稀释,调节至pH 7~8,经免疫亲和柱富集和净化后,LC-MS/MS测定,外标法定量。在ACQUITY UPLC BEH Amide亲水柱上进行分离,流动相为乙腈和含有0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液,梯度洗脱,电喷雾正离子多反应模式监测。河豚毒素在0.3~20.0μg/L线性范围内,相关系数大于0.997,定量限为0.3μg/kg,回收率为88.7%~102.3%,相对标准偏差2.0%~6.4%。本方法重现性好、灵敏度高,适用于海洋生物中河豚毒素的测定。

河豚毒素(TTX)及其衍生物的电子结构和构效关系及与石房蛤毒素(STX)的比较研究

对河豚毒素(TTX)及其五个衍生物进行了量子化学计算,根据对其电子结构及相关分析研究结果,结合其空间结构特点,讨论了它们的活性部位、作用方式及构效关系,发现胍基是最重要的的正电中心,在与受体作用时发挥接受电子的重要作用;O(17),O(18),O(15),O(21),O(19)等氧原子是供电子的主要负电部位.对TTX与石房蛤毒素(STX)进行了电子结构和空间结构比较,发现它们具有相似的电子结构特征,而且主要活性部位在空间位置上基本相互对应.这表明钠离子通道阻断剂在与受体相互作用时具有共同的结构特征和作用方式,同时也为探讨受体结构提供了有价值的信息.

河豚毒素直接竞争ELISA检测方法的研究

本研究应用直接竞争ELISA法对河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）进行快速检测。用过碘酸钠氧化法合成酶标记抗原（HRP-OVA-TFX），用直接ELISA方法对合成的酶标记抗原进行鉴定表明其与抗TTX单克隆抗体具有特异性反应。在比基础上建立了包被单抗的直接竞争ELISA方法。该方法对TTX的检测限可达到1.1μg／L，IC50为20.4μg／L，线性范围3.3-137μg／L，批内变异系数小于6.25％，批间变异系数小于7.34%。对鲫鱼的肌肉组织添加TTX标准品，回收率为65％-93.2％，变异系数为9.41％-12.77％。

河豚毒素DNA适配子的制备及应用

人工合成78个碱基的随机ss DNA文库,采用指数富集配基的系统进化技术与诱变聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)结合的方法,通过筛选富集、克隆、测序,获得了与河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)特异结合的单克隆DNA适配子A3。DNA适配子A3的二级结构主要为茎环结构,与TTX的亲和力为1.254。对适配子和TTX结合的磷酸盐缓冲液p H值、荧光染料结合时间进行优化,结果表明,最适p H值为7.5,最佳结合时间为10 min。建立的快速筛选检测TTX的DNA适配子-荧光染料法对TTX的检出限为10-6 mo1/L。