洋桔梗萜类合成酶基因家族系统进化与表达分析

萜类化合物是花香物质的主要成分之一,其中萜类合成酶(terpenoid synthase,TPS)在萜类化合物合成过程中起关键作用。本研究利用生物信息学方法,共鉴定出26条洋桔梗TPS基因的全长序列,并对其分子进化、基因结构和表达模式等进行探究。结果表明:洋桔梗TPS基因可分为5个亚家族(TPS-a、TPS-b、TPS-g、TPS-e和TPS-f),并进一步细分成10个小分支。在这些分支中,只有TPS-a.1分支上有扩增,其他大多数分支都发生了基因丢失。基因共线性分析显示,在经历了2次全基因组复制事件后,洋桔梗仅有5组TPS共线性基因对被保留,而大部分经过基因组加倍的TPS基因对都发生了丢失,进一步支持了大多数洋桔梗TPS基因发生丢失的结论。转录组表达分析表明,在花瓣发育早期,只有EgTPS-g1、EgTPS-g2和EgTPS-g3少量表达,TPS-a、TPS-b亚家族成员在花瓣中不表达,可能是其缺乏花香的原因之一。未来的研究应该重点关注TPS-a和TPS-b亚家族成员,通过恢复这些亚家族基因的表达,有望赋予洋桔梗花香,从而提高其观赏价值。

洋桔梗组培苗玻璃化原因及恢复的研究

为了找出能够克服或降低洋桔梗组培苗玻璃化的最适培养条件,以YELLOW和PINK2个洋桔梗品种为试材,研究MS培养基中添加的激素、蔗糖、活性炭及温度对洋桔梗组培苗玻璃化的产生和恢复的影响。结果表明:品种、6-BA、NAA对洋桔梗玻璃化芽的产生均有影响,玻璃化率随6-BA及NAA浓度的增大而升高;适宜浓度的蔗糖对洋桔梗玻璃化芽的恢复有促进作用,但添加0.5 g.L-1的活性炭及15℃的低温培养没有明显地促进作用。

洋桔梗叶片培养不定芽发生和微繁研究

以洋桔梗叶片为材料,建立了洋桔梗叶片高效不定芽发生、植株再生体系。研究了不同激素及其组合对外植体不定芽发生、壮苗和生根的效应。结果显示,MS+BA 1mg/L是叶片不定芽发生的适宜培养基;MS+BA 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L是试管嫩梢形成壮苗的适宜培养基;MS+IAA 0.1mg/L培养基是壮苗生根的适宜培养基。草炭珍珠岩基质是生根苗移栽的适宜基质。

洋桔梗高频再生系统的建立及其卡那霉素敏感性测定

以Double Mariachi Pink洋桔梗叶片为外植体,研究了切割方式、培养基中6-BA与NAA配比对其不定芽分化的影响以及叶片不定芽分化对卡那霉素(Km)的敏感性。结果表明:五刀切与三刀切对不定芽分化数量的影响无显著性差异;MS+1.0 mg/L6-BA为叶片不定芽分化的最适培养基,不定芽分化率达100%,在1.0 cm×1.0 cm叶块上的不定芽分化数平均达25.4;25 mg/L Km为抑制叶片不定芽分化的最低浓度。

萘乙酸对洋桔梗种子发芽的影响

[目的]研究萘乙酸(NAA)对洋桔梗种子萌发的影响。[方法]比较不同浓度的NAA对洋桔梗种子的发芽势、发芽率、发芽指数等指标的影响。[结果]在0.001～1.000 mg/L浓度范围内,不同浓度的NAA处理能明显提高洋桔梗种子的发芽势、发芽率、发芽指数,以0.100 mg/L浓度处理的效果最好,与对照相比,达到了0.01水平的极显著差异。NAA浓度0.010～0.100mg/L浸种能显著提高胚轴的伸长;NAA浓度1.000～10.000 mg/L浸种抑制胚根的伸长,当浓度达10.000 mg/L时,对洋桔梗种子的萌发有明显的抑制作用。[结论]低浓度的NAA能提高洋桔梗种子的发芽势、发芽率、发芽指数;高浓度NAA处理则抑制其种子的萌发。

洋桔梗种子育苗基质与施肥配方的筛选

在洋桔梗育苗试验中,采用4种泥炭与珍珠岩、生石灰进行不同搭配制作了9种基质,筛选了5种不同氮、磷、钾、钙、镁、比例的肥料配方。通过测量F1杂交种子苗成苗率、冠幅、根长、冠重、根重等指标,发现通过添加生石灰调整基质pH至6.3~6.8,可显著提高成苗率、冠重和根重。在此基础上,筛选出2种国产泥炭Y-6和Y-3以1∶1混合使用,1种进口泥炭K-876单独使用并添加生石灰育苗效果最佳。5种施肥配方中N、P、K、Ca、Mg比例为10∶5∶10∶8∶3时的育苗效果最佳。

洋桔梗离体快繁技术研究

[目的]建立洋桔梗高效的快速繁殖体系,为工厂化生产提供可行的操作程序。[方法]以国外进口的洋桔梗F1代种子(品种名称为Polestar yellow)无菌苗的叶片为外植体,对不定芽的诱导、单芽增殖、无菌苗生根等进行了研究。[结果]结果表明:6-BA和IBA组合对洋桔梗叶片不定芽的诱导效果较6-BA和NAA组合好,叶片最佳的分化培养基为MS+6-BA0.6 mg/L+IBA0.04 mg/L,1个月内正常芽平均分化数为8.3;最佳的单芽增殖培养基为MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.04 mg/L,1个月内正常芽的增殖倍数为7.4;无菌苗在含有IBA0.25 mg/L的1/2 MS培养基上,生根率、平均每苗的根数均最大。[结论]该结果为洋桔梗的工厂化生产奠定了基础。

农杆菌介导的洋桔梗遗传转化体系的建立

以洋桔梗叶片为外植体,建立了植株再生体系,并在此基础上,用根癌农杆菌介导法,研究了影响洋桔梗转化的若干因素。结果表明,诱导最佳培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.15mg/L,不定芽诱导率达74.5%;不定芽生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L,生根率达90%。不定芽分化阶段和生根阶段的Km筛选浓度分别为45mg/L和15mg/L;根癌农杆菌菌液浓度OD600值为0.6,侵染时间10min,共培养时间3d,有利于抗性芽的产生。Km筛选得到的抗性植株经过PCR和Southern检测表明,八氢番茄红素合成酶基因(PSY)已经整合到洋桔梗基因组中。

含无机盐的保鲜剂对洋桔梗切花的保鲜效应

研究了不同保鲜剂对洋桔梗切花的保鲜效果以及生理作用的影响.结果表明:各保鲜剂均能在一定程度上增加洋桔梗切花花枝鲜重,改善花枝的水分状况,提高切花的观赏品质,增大花径,延长切花的瓶插寿命,提高体内的SOD活性,并可明显延缓花瓣中可溶性蛋白质含量的下降.其中,以保鲜液2%蔗糖+100mg/L山梨酸+250mg/L Al2(SO4)3的保鲜效果最佳.

洋桔梗ISSR最佳反应体系的建立与品种遗传多样性检测

利用正交设计,对影响洋桔梗ISSR反应的主要因素进行了优化,建立了洋桔梗ISSR的最佳反应体系。在25μL的PCR反应体系中,含2.5μL 10×PCR buffer、1.5 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTPs、0.2μmol/L引物、30 ng/μL洋桔梗基因组DNA模板及2.0 U的TaqDNA聚合酶。试验结果表明,该反应体系具有良好的稳定性和通用性。8个不同基因型洋桔梗材料遗传多样性检测结果表明,该ISSR分子标记可有效地检测出其中4个不同品种之间、同一品种F1代及F2代之间的遗传多样性,但未能检测出同1个品种F1代2个株系之间或2个转基因株系之间的遗传多样性。

两种植物生长调节剂对洋桔梗离体培养的效应

研究了6-BA和NAA诱导洋桔梗外植体再生植株的效应.结果表明,培养基MS＋ 6-BA 0.1mg/L＋ NAA 0.05mg/L适于诱导洋桔梗外植体产生愈伤组织,MS＋ 6-BA 0.2 mg/L＋ NAA 0.1 mg/L适合愈伤组织的继代培养;随6-BA浓度的增加,不定芽的增殖率和玻璃化率提高,适于不定芽分化和增殖的培养基为MS＋ 6-BA 0.5mg/L＋ NAA0.1 mg/L,生根适宜的培养基为1/2 MS＋NAA 0.1～0.3 mg/L.因此,不同浓度的6-BA和NAA组合对洋桔梗茎、叶、芽等外植体愈伤组织和不定芽的诱导与增殖效果不同.试验结果为洋桔梗健康种苗生产奠定了基础.

过表达枸杞LmPSY基因提高洋桔梗抗逆性的研究

类胡萝卜素与植物的光保护及耐盐有很大关系，八氢番茄红素合成酶（PSY）是类胡罗素合成重要酶．将来自枸杞（Lycium chinenseMiller）的八氢番茄红素合成酶（LmPSY）基因在洋桔梗中过表达，旨在提高其抗逆性．RT-qPCR 结果发现 LmPSY 基因在转基因洋桔梗中有组织差异表达．高效液相色谱结果说明转基因洋桔梗叶片总类胡萝卜素提高1.3倍，玉米黄质和叶黄素含量提高1.1倍．强光胁迫条件下，转基因洋桔梗鲜重和干重较非转基因植株有显著提高．200,mmol/L 氯化钠胁迫条件下，转基因洋桔梗过氧化物酶（POD）和超氧化物酶（SOD）含量有显著提高，转基因植株的荧光参数（Fv/Fm）提高8.0%～9.3%．强光和盐胁迫条件下对转基因植株生理生化指标的测定证明洋桔梗的耐强光性及耐盐性有显著提高．

洋桔梗种子低温春化处理对抽薹的影响

为开发洋桔梗夏季育苗秋冬季开花栽培的促进抽薹技术,研究了种子低温春化处理及春化处理后育苗夜温对抽薹的影响。洋桔梗吸水种子低温春化处理可以有效促进发芽和抽薹,以7～10℃35 d暗处理促进抽薹的效果较好;种子低温春化处理后,育苗期间白天30～35℃,夜间20～23℃的温度管理,幼苗可以正常抽薹,但23～26℃以上夜间高温有去春化作用。表明洋桔梗夏季育苗秋冬季开花栽培,采用种子低温春化处理、控制苗期夜间高温,可以有效防止簇叶化,促进抽薹。

洋桔梗花药离体培养与完整植株的诱导

以9个不同类型的洋桔梗品种为试材,研究了花药离体培养中胚状体的诱导及再生。结果表明：基因型是限制花药培养成胚的关键因素,9个品种中,有4个品种获得了胚状体及再生苗,再生率为3.8%～16.0%。用根尖染色体鉴定法鉴定了再生株的倍性,再生株群体的倍性组成比较复杂,以二倍体为主。

糖和无机盐预处液对洋桔梗切花的保鲜效应

试验研究4种无机盐预处液处理对洋桔梗切花的保鲜效应。结果表明,各预处液处理均能不同程度地延长洋桔梗切花瓶插寿命,增加花枝鲜重和花径,促进开花,维持水分平衡和花瓣可溶性糖含量,延缓MDA的产生,维持花瓣膜结构的相对稳定性;其中以2%S(蔗糖)+200 mg.L-1A l2(SO4)3+50 mg.L-1NaC lO的预处液处理效果最佳。

国内洋桔梗组培快繁技术的研究进展

通过查阅现有洋桔梗组织培养资料,对洋桔梗组培快繁技术体系的研究进展进行了综述,主要介绍了洋桔梗组织培养中的外植体的选择、初代培养、增殖培养、生根培养及练苗移栽等程序的研究进展。

激素对洋桔梗植株再生的影响及生根培养的研究

以MS为基本培养基 ,附加不同浓度的 6 BA、KT、NAA和IBA诱导洋桔梗叶片外植体的再生植株。结果表明 :MS +6 BA 0 .5～ 1 .0mg/L(单位下同 ) +NAA 0 .2和MS +6 BA 0 .5～ 1 .0 +IBA 0 .2培养基都能诱导外植体产生愈伤组织 ,但 6 BA的浓度必须小于 1 .0mg/L ,否则会导致组织的严重玻璃化 ;MS +KT 1 .0～2 .0 +NAA 0 .2或MS +KT 1 .0～ 2 .0 +IBA 0 .2培养基也能诱导外植体产生愈伤组织 ,愈伤组织出现的时间较早且质地较好 ,适合分化。继代培养时 ,MS培养基中仅加 6 BA 0 .5mg/L或KT 0 .5mg/L ,即能获得较高的分化率。生根培养研究中 ,培养液为 1 /2MS+5 0g/L糖 +IBA 2mg/L的前处理 ,生根效果较好 ,生根率接近基质生根培养的生根率。

农杆菌介导洋桔梗遗传转化影响因素的研究

以洋桔梗品种Double Mariachi Pink叶片为外植体,研究了影响农杆菌介导遗传转化效率的几个重要因素。结果表明,叶片外植体与农杆菌合适的共培养时间为5 d;以新的切割方法——"刺孔法"切割叶片,每个叶块外植体再生不定芽平均15.22个,明显多于"三刀切"的11个;"刺孔法"的叶块转化率达到77.7%,每个叶块再生卡那霉素抗性苗平均0.64株,明显高于"三刀切"的57.7%和0.38株;在"刺孔法"处理中,与孔外边缘切口相比,分布均匀的孔内切口利于更多不定芽的再生和卡那霉素抗性苗的形成。