胞嘧啶脱氨基酶/5-氟胞嘧啶系统对人胰腺癌细胞恶性增殖的抑制作用

目的 探讨大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶 (CD) / 5 -氟胞嘧啶 (5 - FC)系统对人胰腺癌细胞的体内外生长抑制作用。方法 将含 CD基因的重组逆转录病毒载体导入人胰腺癌细胞形成转化细胞系 ,对转化细胞进行体内外药物敏感实验 ,包括 :(1)计算转化细胞在前体药物 5 - FC作用下的细胞生长抑制率和克隆形成抑制率 ;(2 )MTT法检测旁观者效应 ;(3)观察 5 - FC对转化细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。结果 转化细胞在 5 - FC作用下其生长抑制率为 80 .0 % ,克隆形成抑制率为 79.0 % ,均明显高于未转化细胞生长抑制率 4.8%和克隆形成抑制率5 .0 % (P<0 .0 1) ;混合细胞中含 10 %的转化细胞时 ,生长抑制率已达 5 0 .7% ;转化细胞的裸鼠移植瘤在 5 - FC作用下体积缩小。结论 CD/ 5 -

胞嘧啶脱氨基酶APOBEC1研究进展

为全面理解载脂蛋白B mRNA(ApoB mRNA)编辑酶催化多肽-1(APOBEC1)的作用机制,介绍了APOBEC1和ApoB mRNA的蛋白及核酸序列,总结并绘制了APOBEC1与不同的辅助蛋白的结合模型,阐述了APOBEC1催化ApoB mRNA第6666位的胞嘧啶(C6666)脱氨基化分子机制.列举了啮齿动物APOBEC1抑制多种逆转录病毒的研究报道,介绍了兔源APOBEC1结合人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的病毒粒子并编辑病毒基因组的机理.同时介绍了APOBEC1通过编辑胞嘧啶或与AU富集元件(ARE)结合来调控癌症等疾病相关的细胞因子表达.

吡格列酮对脂多糖诱导星形胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用

目的研究吡格列酮(Pio)对脂多糖(LPS)诱导星形胶质细胞(AC)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制作用及其作用机制。方法 AC分别加入Pio 0.1,1.0和10.0μmol·L-1,c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125 20.0μmol·L-1,p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂SB20358020.0μmol·L-1或过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)抑制剂GW9662 10.0μmol·L-1,1 h以后加入LPS 10.0 mg·L-1,继续作用24 h。Griess法测定培养AC上清液中一氧化氮(NO)含量。免疫印迹法和免疫荧光法检测iNOS的表达水平。结果与正常对照组相比,LPS 10.0 mg·L-1组iNOS表达水平和NO分泌水平均显著增高(P<0.01)。Pio 0.1,1.0和10.0μmol·L-1可明显抑制LPS诱导的iNOS表达上调及NO分泌增加(P<0.05),Pio 10.0μmol·L-1组iNOS蛋白表达水平由LPS组1.711±0.283下降到0.157±0.082(P<0.01),NO分泌量由LPS组(16.63±2.25)μmol·L-1下降到(6.92±1.30)μmol·L-1(P<0.01)。GW9662 10.0μmol·L-1可抑制Pio 1.0μmol·L-1的上述作用,iNOS蛋白表达水平由Pio1.0μmol·L-1组0.562±0.100增加到0.847±0.088(P<0.01),NO分泌量由(9.27±1.23)μmol·L-1增加到(15.54±2.30)μmol·L-1(P<0.01)。SB203580 20.0μmol·L-1和SP600125 20.0μmol·L-1的作用与Pio作用相似,使iNOS蛋白表达水平降低到0.434±0.082和0.434±0.076,NO分泌量下降到(11.53±2.40)μmol·L-1和(8.81±0.58)μmol·L-1;而单独应用SB203580 20.0μmol·L-1和SP600125 20.0μmol·L-1对AC的iNOS表达和NO分泌没有影响。结论 Pio能通过抑制LPS诱导的大鼠皮质AC的iNOS表达,从而减少NO的分泌,这种抑制作用可能与其激活PPARγ和阻断JNK和p38MARK信号转导通路有关。

活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶表达与黑素瘤侵袭转移、预后的相关性分析

目的探讨活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶（AID）与黑素瘤侵袭转移、预后的关系和临床意义。方法免疫组化sP法检测AID蛋白在80例黑素瘤、23例色素痣石蜡包埋组织切片中的表达，结合临床病理生物特性进行分析。结果黑素瘤AID蛋白的阳性表达率53．75％（43／80），色素痣的表达率13．04％（3／23）。差异有统计学意义（P〈O．05）。AID蛋白的表达与黑素瘤淋巴结转移、Clark分级、浸润深度及预后密切相关（P〈0．05），在年龄、性别、民族之间差异无统计学意义（均P〉O．05）。19例发生BRAF突变黑素瘤组织中，AID蛋白17例阳性表达，其中15例BRAFV600E突变的黑素瘤AID蛋白均阳性表达。结论AID蛋白可能诱导了黑素瘤BRAF突变，并参与黑素瘤的侵袭、转移，与预后相关。

辐射联合脂质体介导的胞嘧啶脱氨基酶/5-氟胞嘧啶系统体外抑杀人胰腺癌细胞的研究

目的探讨辐射联合脂质体介导的胞嘧啶脱氨基酶(CD)/5-氟胞嘧啶(5-FC)系统对胰腺癌的协同治疗作用。方法在脂质体介导下,将CD基因导入人胰腺癌PC3细胞,经G418筛选出稳定表达的克隆。用RT-PCR法鉴定CD基因的整合及表达;MTT法检测给入前药5-FC后细胞的存活率及其旁观者效应;细胞克隆形成实验检测钴-60(60Co)体外照射传代培养后细胞的辐射敏感性。结果CD基因在转染了CD基因细胞中获得了稳定表达;5-FC对转染CD基因细胞具有较强的杀伤及旁观者杀伤效应(P<0.05),联合辐射能进一步增强这一杀伤效应(P<0.05);5-FC处理过的转染了CD基因的PC3细胞对辐射的敏感性明显提高(P<0.05),临床相关剂量(2 Gy)照射时转染CD基因细胞的放射增敏比达到1.5。结论CD/5-FC系统对转染了CD基因的细胞具有明显的辐射增敏效应,联合应用辐射和CD/5-FC系统能显著增强CD/5-FC系统对PC3细胞的杀伤作用。

组织特异性CD/5-FC系统对大肠癌的原位基因治疗

目的 探讨癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)组织特异性胞嘧啶脱氨基酶基因对不同分泌CEA大肠癌组织的靶向杀伤作用。方法 脂质体法将CEA 组织特异性逆转录病毒载体G1CEACDNa在PA317细胞中进行包装,大肠癌细胞LoVo和SW480分别接种到BALB/c裸鼠大腿皮下,成瘤2周后,瘤内多点注射法行原位基因转染,每天腹腔注射500mg/kg的5 FC(5 fluorocytosine),观察治疗效果。结果 病毒滴度为5.6×106CFU/L。经多次注射法转染,目的基因在肿瘤组织中能有效表达,治疗21天后,基因治疗组有明显的抑瘤作用,但对LoVo 细胞肿瘤的抑瘤作用明显大于对SW480细胞肿瘤。结论 CEA组织特异性CD/5 FC系统对LoVo细胞肿瘤的抑瘤作用更明显。

组织特异性CD/5-FC系统热化疗对裸鼠结肠癌肝转移的疗效

目的:探讨组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(cytisine deaminase/5-fluorocytosine,CD/5-FC)系统热化疗对结肠癌肝转移裸鼠模型的治疗作用。方法:将含CEA启动子调控CD基因表达的逆转录病毒载体进行扩增、纯化、包装,并收集病毒上清。45只裸鼠经门静脉注射人结肠癌LoVo细胞,成瘤后2 d腹腔注射病毒上清(0.2 ml/次,每天1次,共5 d)。随机分为对照组、常温化疗组和热化疗组,分别经腹腔注射生理盐水、室温前药5-FC和43℃前药5-FC[均为500 mg/(kg.d)]进行治疗。治疗21 d后处死裸鼠,观察肝脏转移率和转移结节数,RT-PCR检测CD基因在肿瘤组织的表达,光镜及电镜下观察肿瘤病理学的变化。结果:病毒滴度为5.6×106CFU/L。CD基因在移植瘤组织中有效表达。热化疗组的肝转移率与转移结节数均低于常温化疗组[13.3%vs40.0%,(0.20±0.56)个vs(0.80±1.01)个;均P<0.05]。光镜下见对照组肝转移瘤组织细胞生长活跃,热化疗组较化疗组肝转移瘤细胞生长受抑制更明显。电镜下见化疗组、热化疗组肝转移瘤细胞有不同程度的凋亡改变。结论:组织特异性CD/5-FC系统热化疗对裸鼠结肠癌肝转移瘤有明显的抑制作用。

原位基因治疗联合前药热化疗治疗结肠癌肝转移的实验研究

目的:探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)基因联合5-氟胞嘧啶(5-FC)热化疗对裸鼠结肠癌肝转移的治疗效果。方法:30只BALB/c裸鼠经门静脉注射人结肠癌Lovo细胞建立结肠癌肝转移模型,随机分为转基因组和非转基因组,每组15只。转基因组:经腹腔注射病毒上清(0.2mL/d,共5d)进行原位基因转染;非转基因组经腹腔注射生理盐水(0.2mL/d,共5d),2组同时腹腔注射42℃500mg·kg-1.d-1)5-FC。治疗21d后将动物处死,观察肝脏转移率和转移结节数,PCR法检测目的基因在肿瘤组织的整合,RT-PCR法检测目的基因在肿瘤组织的表达,观察肿瘤病理学变化。结果:目的基因成功转染并在肿瘤组织中有效表达。转基因组与非转移基因组肝脏转移率分别为26.7%(4/15)、100.0%(15/15),2组比较差异有统计学意义(P<0.05),肝脏转移结节数分别为0.60±0.83、2.40±0.99(P<0.001)。镜下转基因组肝内转移癌细胞变性,染色体消失,可见凋亡小体,而非转基因组未见明显变化。结论:原位基因治疗联合前药热化疗对裸鼠结肠癌肝转移有明显抑制作用。

CD/5-FC系统抗肿瘤的作用

胞嘧啶脱氨基酶 (cytosinedeaminase ,CD) / 5 氟胞嘧啶 (5 fluorocytosine ,5 FC)系统是基因介导的酶前药疗法(gene directedenzymeprodrugtherapy ,GDEPT)之一 ,具有选择性和特异性杀伤肿瘤细胞的作用 ,近年来国内外研究活跃 ,细胞实验及动物模型研究表明 。

逆转录病毒介导的CD/5-FC对胰腺癌细胞的杀伤作用

目的 :探讨大肠埃希菌胞嘧啶脱氨基酶 (CD) /5 -氟胞嘧啶 ( 5 FC)系统对胰腺癌细胞的体外生长抑制作用。方法 :将含CD基因的重组逆转录病毒载体导入胰腺癌细胞形成转化细胞系 ,对转化细胞进行体外药物敏感实验 ,包括 :1)转化细胞在前体药物 5 FC作用下的细胞生长抑制率 ;2 )MTT法检测旁观者效应。结果 :体外实验 5 FC的有效浓度 >2mmol/L时 ,就表现出杀伤作用 ,当 5 FC的有效浓度 >6mmol/L时 ,几乎未见细胞生长 ,PA3 17/CD与TD2混育比例在 90 %时 ,杀伤作用最大 ,相同药物浓度下 ,混育 96h杀伤作用明显高于 2 4h。结论 :CD/5

模仿自然界——基于基因高频突变的蛋白质人工进化技术

从上世纪50年代发现DNA双螺旋结构以来,科学家积累了大量的有关生物的生理和病理分子机理的知识。人们期望从生物学的基础研究中衍生出高效、环保的生物相关制造产业,为人类服务。为了发展生物制造产业,生物基础元件蛋白质和基因的制造技术必不可少。最近出现了一种基于基因高频突变的蛋白质人工进化技术。这一技术已成功应用于新抗体的产生,以及抗体和荧光蛋白质的改造。这一技术的进一步发展将成为蛋白质改造、乃至新蛋白质制造的重要工具。

人乳头瘤病毒16E7_(49-57)的分子修饰与鉴定

目的对人乳头瘤病毒(HPV)16型E7抗原的人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞表位HPV16E749-57进行氨基酸置换修饰,并鉴定修饰表位。方法运用量化模体方案对置换后的多肽与人白细胞抗原A2分子的结合系数进行比较,以分子模拟方法确定合成序列,采用标准Fmoc方案进行合成与纯化多肽以及乳酸脱氢酶释放法检测特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结果修饰多肽符合人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞的表位要求,9肽RLHYNIVTF具有特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结论修饰表位(氨基酸序列RLHYNIVTF)具有更好的结合力和较强的抗原性,可以代替原有序列E749-57(氨基酸序列RAHYNIVTF)作为人乳头瘤病毒感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。

鸡源AID基因的克隆及其抗新城疫病毒作用

APOBEC家族成员中AID蛋白具有DNA/RNA编辑酶功能,同时具有抑制病毒增殖的作用,但具体机制尚不明了。本研究首先根据NCBI公布的鸡全基因组序列进行生物信息学分析,预测鸡AID的基因序列并通过设计PCR引物,成功在鸡法氏囊cDNA样品中扩增出鸡AID基因(chAID)。通过建立并优化chAID的实时定量RT-PCR(rRT-PCR)检测方法,对鸡体内AID基因的表达以及其分布情况进行检测;同时通过Western blot试验对chAID蛋白在鸡细胞中的表达进行检测。试验显示,chAID基因能够在鸡细胞以及组织脏器中正常表达。新城疫病毒(NDV)感染鸡原代成纤维细胞、淋巴细胞后能够引起内源性chAID基因水平的上调;SPF鸡感染NDV后,chAID基因在不同组织脏器中均出现上调现象,以免疫器官最为显著。为了进一步验证chAID基因对NDV增殖的影响,进一步检测在细胞中过表达chAID基因对NDV增殖的影响。研究结果表明:重组chAID蛋白具有抗NDV病毒活性,本研究为进一步研究鸡chAID奠定了基础。

APOBEC3F蛋白的结构与功能

载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(apolipoprotin B mRNA-editing catalytic polypeptide 3protein F,APOBEC3F,简称A3F)是一种天然抗病毒活性的胞嘧啶脱氨基酶。在HIV病毒复制过程中,A3F蛋白能被整合进入病毒颗粒内部,诱导病毒c DNA胞嘧啶脱氨基化变为尿嘧啶,阻断病毒复制。近几年,科研工作者开展了一系列A3F蛋白的结构生物学和脱氨基化反应的研究,以及与单链DNA(single-stranded DNA,ss-DNA)的结合位点、病毒感染因子(viral infectivity factor,Vif)作用界面的探索。本文通过对这些工作进行总结,以期为艾滋病、乙肝的防治提供新的理论基础。