流式细胞仪分析法检测黑熊成纤维细胞周期同步化处理效果

分离培养黑熊皮肤成纤维细胞 ,传 3代 ,分别经血清饥饿 2～ 6 d和 10 g/ L Nocodazole处理 2 4 h后 ,用流式细胞仪分析 2个处理组和对照组细胞的周期相 ,以研究黑熊成纤维细胞同步化处理后的细胞周期时相的变化 ,探讨核移植供体细胞的细胞周期对核移植胚胎发育的影响。结果显示 ,血清饥饿组、Nocodazole处理组及对照组的 G0 +G1 期成纤维细胞的百分率分别为 (85 .0 5± 7.0 0 ) % ,(4 5 .9± 3.7) %和 (5 9.3± 6 .7) % ;G2 / M期细胞的百分率分别为 (10 .4± 6 .8) % ,(4 6 .3± 4 .2 ) %及 (2 3.0 5± 1.0 5 ) %。表明血清饥饿法能较好地使黑熊成纤维细胞同步于 G0 和 G1 期 ;Nocodazole处理可以使细胞较大程度同步于 G2 和 M期。

大鼠成纤维细胞同步处理的流式细胞仪分析

目的 :研究 SD大鼠成纤维细胞同步处理后的各细胞周期的变化 ,探讨供体细胞的细胞周期对核移植胚胎发育的影响。方法 :分离培养 SD大鼠皮肤成纤维细胞 ,传 3～ 5代 ,分别经血清饥饿 2～ 6d和 1 0 mg/ ml nocodazole处理 2 4 h,流式细胞仪分析处理组和对照组的细胞周期百分比。结果 :血清饥饿、nocodazole处理及对照组的 G0 + G1期成纤维细胞的百分比 ( % )分别为 74.5± 4.4、49.5± 4.65和 5 0 .1 2± 3.9;G2 / M期细胞的百分比 ( % )分别为 :1 9.2 5± 4.2、2 5 .98± 2 .7及 45 .9± 5 .2 1。结论 :血清饥饿能较好地使大鼠成纤维细胞同步于 G0 和 G1期 ;nocodazole处理则使细胞较大程度同步于 G2 和 M期。

应用流式细胞术检测细胞凋亡

细胞凋亡(Apoptosis)是受基因调控的细胞自然死亡的一种主要形式,是按照一定的规律和程序进行的,因而也称程序性细胞死亡(programmed celldeath PCD)凋亡与增殖、分化共同调控机体细胞群体的恒定。胚胎形成、衰老和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展转化等病理、生理过程都与细胞凋亡有密切的关系。近年来,研究细胞凋亡是和分子生物领域的热点之一。

人参皂甙Rg3在小鼠肝癌淋巴结转移模型中诱导细胞凋亡的作用

目的:观察人参皂甙Rg3对小鼠肝癌淋巴结转移模型中肿瘤细胞凋亡的诱导作用,探讨人参皂甙Rg3抗肿瘤淋巴结转移的机制。方法:建立小鼠肝癌淋巴结转移模型;光镜和透射电镜下观察各组(Rg3预防组、Rg3治疗组、Rg3与顺铂联合治疗组、顺铂治疗组及对照组)中原发瘤及转移瘤组织的形态学结构改变,并通过流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡。结果:Rg3预防组及治疗组电镜下(5份样品)可见较多细胞凋亡小体的形成(5/5,4/5);顺铂治疗组的形态改变以细胞破坏为主,凋亡的细胞较少;联合治疗组细胞的凋亡和坏死程度相当。流式细胞学检测分析结果为:Rg3预防组、治疗组及联合治疗组均见细胞凋亡的特征峰(5/5),而顺铂治疗组为1/5,对照组未见凋亡峰(0/5)。结论:人参皂甙Rg3抗肿瘤细胞淋巴结转移的作用与诱导细胞凋亡有关。

过氧化物酶体增殖物活化的受体γ特异配体罗格列酮对肝星状细胞生物学特性的影响

目的 研究过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(HSC)PPARγ 表达以及对HSC生物学特性的影响。 方法 设立空白对照组、3μmol L罗格列酮组、10μmol L罗格列酮组;分别 用RT PCR、Western印迹、免疫细胞化学方法检测PPARγ的表达;用Western印迹和免疫细胞化学方法检测α 平滑肌 肌动蛋白(α SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;四甲基偶氮唑盐(methythiazolyltetrazolium,MTT)法检测细胞增殖;流式细胞 仪分析细胞凋亡。 结果 10μmol L罗格列酮组HSC的PPARγmRNA表达明显高于对照组(t=10.87,P<0.01), PPARγ蛋白表达也明显高于对照组(t=4.627,P<0.01);10μmol L罗格列酮组HSC的增殖活性显著低于对照组(t ≥5.542,P<0.01),其α SMA及Ⅰ型胶原表达明显低于对照组(t≥4.627,P<0.01),其凋亡发生率显著高于对照组 (χ2=16.682,P<0.01)。 结论 PPARγ特异配体罗格列酮通过增加PPARγ的表达,能够抑制激活的HSC表达α SMA及Ⅰ胶原,抑制激活的HSC增殖,诱导激活的HSC凋亡。

淫羊藿苷对缺氧诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

目的研究淫羊藿苷(icariin,ICA)对缺氧所致血管内皮细胞(vascularendothelialcells,VECs)损伤的影响。方法建立体外细胞缺氧模型,用MTT法观察ICA对缺氧损伤的血管内皮细胞活性的影响,测定细胞中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及乳酸脱氢酶(LDH)活力,并对细胞进行Hoechst33342荧光染色、电镜观察细胞超微结构,运用流式细胞仪及DNA琼脂糖凝胶电泳分析DNA断裂情况,以观察ICA对缺氧诱导的内皮细胞凋亡的影响。结果ICA能抑制缺氧引起的血管内皮细胞的减少,降低LDH活力,并抑制缺氧条件下MDA生成,提高SOD活力;缺氧能诱导血管内皮细胞凋亡,表现为细胞核浓缩,沿核膜排列成块状,DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型“梯形条带”,流式细胞仪分析呈现典型凋亡亚二倍体峰。ICA能显著抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡。结论ICA具有保护缺氧诱导的血管内皮细胞损伤的作用,其作用机制与抗脂质过氧化物产生、提高SOD活力以及抗细胞凋亡有关。

人表皮干细胞在不同培养基中生长状态的观察及其生物学性状的初步探讨

目的 筛选合适的保持人表皮干细胞特性的体外培养基,并观察其生物学性状。 方法 按不同培养基分组,配制FAD培养基和FAD加入不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)的培养基,即FAD、FAD1、FAD2、FAD3等组,以及角质化细胞专用无血清培养基(keratinocyte- SFM,K- SFM) ,同时应用同一个体的成纤维细胞经丝裂霉素处理后作滋养层,培养人表皮干细胞。通过细胞生长曲线及MTT检测,观察细胞的生长状态。在体外培养扩增表皮干细胞后,利用透射电镜、流式细胞仪分析、Brd U检测,观察细胞的生长状态;结合流式细胞仪分析,观察细胞周期的变化。 结果 人表皮干细胞在FAD组中生长良好,加入b FGF可进一步改善细胞的生长状态。扩增后细胞检测提示,人表皮干细胞在体外培养过程中呈典型的克隆性生长,生长周期长。流式细胞仪检测表明,人表皮干细胞80 .2 %处于G0 /G1 期;透射电镜观察见其细胞器少,细胞核浆比大。 结论 加入b FGF的FAD培养基并同时利用滋养层,更适合人表皮干细胞的生长,在稳定状态下是一种处于静止期的幼稚细胞。

槐米提取物对小鼠Lewis肺癌移植瘤细胞周期和PCNA表达的影响

目的研究槐米提取物对小鼠Lewis肺癌移植瘤细胞周期和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响,探讨槐米提取物对肺癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法建立Lewis肺癌的小鼠模型,以不同剂量的槐米提取物在移植前后连续灌胃,顺铂治疗采取腹腔注射给药方式。给药结束后,测定各组小鼠瘤重,计算抑瘤率;用流式细胞仪分析细胞周期分布;用免疫组化方法测定PCNA表达水平。结果与模型对照组比较,槐米提取物高剂量组、中剂量组能显著性抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长,槐米提取物中剂量+顺铂治疗组的作用更加显著。小鼠Lewis肺癌移植瘤的G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少;PCNA指数明显降低。结论槐米提取物对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长有明显的抑制作用,其机制可能与槐米提取物对肿瘤细胞周期和PCNA表达水平的调控有关。槐米提取物与顺铂联合使用,对肿瘤抑制作用明显增强。

芪红胶囊对柯萨奇病毒引起细胞凋亡的影响

目的探讨柯萨奇病毒是否能够引起心肌细胞凋亡,以及芪红胶囊对凋亡发生是否有抑制作用。方法将培养细胞分为4组:病毒感染对照组、芪红胶囊加病毒组、芪红胶囊对照组和正常细胞对照组。应用原位末端标记法(TUNEL)、Hoechst33258染色和Annexin-Ⅴ/PI染色观察各组细胞凋亡发生情况;并通过流式细胞仪分析各组细胞的凋亡发生率;应用RT-PCR方法观察与凋亡相关细胞因子的表达改变。结果病毒感染对照组细胞经Hoechst33258染色发现病毒感染后的细胞核出现强亮度的蓝色荧光,可观察到凋亡细胞的典型变化;Annexin-Ⅴ/PI染色可见HeLa细胞膜呈强绿色荧光,细胞核显强红色荧光;通过流式细胞仪检测PI染色的细胞DNA,发现病毒感染组出现明显凋亡峰;芪红胶囊加病毒组凋亡发生率明显下降,正常对照组细胞未发生凋亡;同时芪红胶囊能够调节与凋亡相关细胞因子的表达。结论芪红胶囊能够抑制柯萨奇病毒引起的细胞凋亡。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的感染对Sf9细胞周期的影响

病毒的感染导致细胞内部发生一系列变化。应用流式细胞仪FACS的荧光检测 ,测出Sf9细胞完成整个周期循环大约需要 18h ,G1、S、G2 /M各时相的时间间隔约为 6h ;AcNPV感染Sf9细胞 12 18h ,细胞被抑制于G2 /M期 ;Sf9细胞同步于G1/S期后释放细胞并用AcNPV感染 ,12h后 ,2 / 3的细胞处于G2 /M期 ,1/

来源于人胎肝干细胞的肝癌细胞系建立及初步研究

目的:研究肝癌细胞发生发展及变化规律,探讨胎肝干细胞体外长期培养的变异归宿问题. 方法:原代分离培养人胎肝干细胞,从中筛选出一生长旺盛之集落,体外长期培养,并对其生物学特性进行初步鉴定.进行了细胞倍体分析;应用流式细胞仪分析了细胞周期;在Scid鼠体内接种细胞进行成瘤性验证. 结果:从人胎肝组织中成功分离出一胎肝干细胞集落,在体外长期培养下可分化为肝癌细胞.其细胞增值核抗原指数高达100%;倍体分析常见多倍体细胞;流式细胞仪分析细胞周期,结果G1期细胞约占48%,G2期细胞约占18%,S期细胞约占34%.Scid鼠体内成瘤实验显示,接种细胞后2-3 wk 成瘤,具有100%的成瘤性.显微镜下所见细胞大小不一,异型性明显,核仁大,核分裂活跃. 结论:人胎肝中存在具有干细胞特性的原始细胞,确实可分化为肝癌细胞.从人胎肝干细胞中分离培养出肝癌细胞对于肝癌发生发展及其变化规律的深入研究奠定了基础.

D-氨基葡萄糖衍生物对人胃癌细胞系SGC-7901增生的影响

目的:观察D-氨基葡萄糖衍生物体外对人胃癌SGC- 7901细胞增生的影响,探讨其可能作用机制. 方法:采用MTT法,筛选药物作用最佳浓度.用流式细胞仪分析诱导凋亡前后的细胞DNA含量,透射电镜观察凋亡细胞的超微结构.免疫组化测定CD44表达. 结果:D-氨基葡萄糖衍生物能明显抑制胃癌细胞的增长(P<0.01),MTT法显示抑制程度具有时间和剂量效应关系,统计组间比较差异有显著性(P<0.01);流式细胞仪分析可见亚二倍体(Sub-G1)凋亡峰;电镜观察到凋亡细胞的典型变化,免疫组化及光密度检测示CD44表达下降(216.5±7.0 vs 190.0±14.2,P=0.000). 结论:D-氨基葡萄糖衍生物通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制人胃癌SGC-7901细胞增生,同时还有下调CD44的作用.

间充质干细胞不抑制体内T淋巴细胞的增殖

目的探讨不同种属来源的间充质干细胞(MSC)在体内是否具有相似的作用。方法用尼绒毛法分离不含脾脏细胞灌注模型(C57/BL)源脾脏T淋巴细胞,CFSE膜荧光染料标志的胞进行细胞标记,按2×107/只与C57/BL来源的MSC(1×105～1×106/只)共输注给γ射线照射的雌性BALB/c(5Gy)。不同时间段取受体的脾脏细胞,以单纯输注T淋巴细胞组为对照,流式细胞仪分析T淋巴细胞增殖状态。结果与体外结果明显不同,MSC输注对外源淋巴细胞比例没有影响,共输注不能抑制T淋巴细胞的增殖。结论异体MSC在组织工程构建和移植物抗宿主病治疗中的应用,提出了新的问题。

p15^(INK4B)基因转染对人食管鳞癌细胞EC109增殖的抑制作用

目的:探讨p15INK4B(p15)基因转染对食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖的影响.方法:根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组:p15转染组,空载体转染组,未转染组.应用PCR检测外源性p15基因,Westernblot方法检测转染细胞的P15蛋白变化:流式细胞仪分析细胞周期变化,应用MTT、集落形成实验、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p15基因对EC109细胞增殖和凋亡的影响.结果:p15转染细胞存在外源p15基因,并有P15蛋白高表达;EC109-p15细胞生长速度低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组,集落形成率显著低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组(20.8±1.3%vs54.3±3.2%,56.8±2.3%,P<0.01);流式细胞仪观察到P15蛋白高表达使EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(62.4±7.1%vs38.0±5.8%,34.4±1.0%,P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(21.1±1.3%vs35.5±2.4%,36.3±0.7%,P<0.01),并出现亚G1峰(凋亡峰).透射电镜亦发现p15转染组发生细胞凋亡.结论:p15基因转染可以抑制人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.

人胃癌细胞肿瘤相关基因的表达与甲基化调控

目的:旨在阐明胃癌的发生中多种抑癌基因和癌基因的甲基化情况,以期为进一步深入探索通过改变抑癌基因的甲基化而为胃癌治疗提供新方法. 方法:培养人胃癌细胞株MKN-45和HGC-27两种细胞,在MTT确定去甲基化制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza- 2’-deoxycytidine,5-aza-dC)浓度和时间对细胞生长活力没有影响后,分别以2,5,和10μmol/L,浓度分别干预24和72 h,然后提取其DNA和RNA,用RT-PCR的方法检测p16INK4A,p21WAF1,p53,c-Ha-ras和c- myc等多种基因的表达情况;同时以流式细胞仪分析药物干预后的MKN-45和HGC-27的细胞周期变化; DNA分析则通过亚硫酸氢盐修饰和测序和甲基化特异性PCR(MSP)的方法检测p16INK4A基因及c-myc启动子区甲基化的情况. 结果:我们所采用的5-aza-dC的浓度和时间对细胞的生长无显著性影响.5-aza-dC干预前,MKN-45和HGC-27两种胃癌细胞系中均有p16INK4A表达,5-aza- dC干预后在MKN-45和HGC-27两种胃癌细胞系中p16INK4A的表达增强,且不同的胃癌细胞株表达增强最明显时的时间与浓度不同.-p53,p21WAF1,c-myc,c-Ha-ras 等多种基因在干预前后均有表达,且在干预前后无明显变化.在5-aza-dC干预后,HGC-27细胞周期阻滞在G1期,而MKN-45细胞的周期无明显改变.p16INK4A启动子区存在甲基化使得该基因的表达减少,在去甲基化试剂处理后使其表达增强. 结论:人胃癌细胞系MKN-45和HGC-27中,p16INK4A 启动子甲基化是其在表达减弱的主要原因,其去甲基化程度取决于5-aza-dC干预的时间和浓度.

转染hTERT基因的大鼠神经干细胞生物学特性研究

目的:旨在研究hTERT基因所表达的蛋白对NSCs生物学特性的影响。方法:通过脂质体转染法将构建的重组质粒pEGFP-N1-hTERT转染到大鼠胎儿NSCs中,对转染的NSCs进行体外诱导分化试验、裸鼠致瘤性试验、RT-PCR、Western blot和流式细胞仪分析。结果:转染的NSCs在体外培养中仍具有干细胞的生长特性和多潜能性、无致瘤性,转染重组质粒的NSCs中,存在hTERT基因mRNA的转录产物和融合蛋白hTERT-GFP的表达。结论hTERT基因对神经干细胞端粒酶活性有上调作用,可促进NSCs的体外增殖和永生化趋势。

RASSF1A基因转染对人肺腺癌细胞株A549增殖的抑制作用

目的:观察外源性RASSF1A基因对人肺腺癌细胞A549增殖及NF κB亚单位P65表达的影响。方法:利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3. 0 RASSF1A质粒和空载体pcDNA3. 0质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Westernblotting检测RASSF1A基因表达。采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法、流式细胞仪分析转染细胞的生物学行为。RT PCR和Westernblotting检测基因转染对P65表达的影响。结果:经脂质体转染和筛选,建立了稳定表达RASSF1A基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较,转染RASSF1A基因的细胞生长速度明显减慢(P<0. 05),细胞周期中G1 /G0期比例明显增加(P<0. 05),而S期比例减少;转染组细胞核内P65蛋白表达明显降低(P<0. 05),而全细胞P65蛋白及mRNA表达未见明显变化。结论:RASSF1A基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。

鸡新城疫病毒诱导口腔鳞癌细胞凋亡的实验研究

目的检测鸡新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)对人口腔鳞癌细胞诱导凋亡作用。方法采用MTT染色法和流式细胞仪分析法检测NDV对人口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)颈淋巴结转移癌细胞系(GNM)及人舌鳞癌细胞系(TSCCa)体外细胞培养株诱导凋亡的作用。结果NDV作用后的GNM、TSCCa均出现明显的细胞凋亡特征,与对照组差异有统计学意义。结论NDV能够诱导OSCC凋亡。