苏格兰报告甲型H1N1流感病毒血凝素突变株D222G

苏格兰的一个研究小组从苏格兰西部收集了58例甲型H1N1流行性感冒患者的资料，包括社区感染病例和重症病例，并将重症甲流病例分为死亡组和治疗后痊愈组。检测58例甲流患者样本中流行性感冒病毒血凝素基因（HA）的HA1亚基并测序，研究结果发现死亡病例（2／23，8．7％）D222G的发生率高于社区感染病例和治疗后痊愈病例（0／35，0％）；

2004年北京婴幼儿中甲3型流感病毒血凝素基因特性对其抗原性改变的提示

目的了解2004年流感流行季节(2004年8月—2005年4月)北京地区婴幼儿急性呼吸道感染患儿中分离到的甲3型流感病毒是否存在抗原性的改变以及其变异程度。方法提取1株于2004年3月和32株于2004年流感流行季节从北京地区急性呼吸道感染患儿中分离到的甲3型流感病毒的病毒RNA,经RT-PCR扩增得到HA1区基因片段并进行核苷酸序列测定,使用生物信息软件分析HA1区基因序列。结果所测定的血凝素HA1区基因均为987bp,编码一个含329个氨基酸的蛋白质。将33株甲3型流感病毒流行株的血凝素(HA1)氨基酸序列与近年WHO推荐的参考疫苗株比较,我们发现一致的多处位点的氨基酸突变,而且突变位点涉及2个抗原决定簇(A、B)和受体结合部位。而2004年3月分离到的毒株在进化分析和氨基酸变异上均不同于2004年流行季节的毒株。结论对血凝素基因HA1区的序列分析结果提示2004—2005年流行季节的甲3型流感病毒较春季的流行株和2004年疫苗株出现了较大的漂移,提示其抗原性可能出现了改变。这种变异对于病毒抗原性的影响以及对于疫苗效果评价的意义值得密切关注。

流感病毒血凝素衍生肽对T细胞活化抑制作用的研究

目的研究人类白细胞抗原(HLA)-DRB1结合性流感病毒血凝素(HA)308-317变构肽在HLA-DR4限制性T细胞激活中的作用。方法采用固相法合成HA308-317原型肽及其变构肽。通过计算机模拟及流式细胞术分析HA308-317原型肽及其变构肽与HLA-DR4分子的结合作用;并检测这些多肽对T细胞激活信号CD69表达和白细胞介素(IL)-2分泌的影响及对T细胞增殖的抑制作用。结果HA308-317变构肽能结合细胞表面HLA-DR4分子,对T细胞激活信号CD69表达和IL-2分泌无明显影响,并能抑制HA308-317原型肽诱导的T细胞活化。结论替换HA308-317多肽中识别T细胞受体(TCR)的氨基酸残基形成的HA变构肽可与HLA-DR4分子结合,而且可抑制其原型肽诱导的T细胞活化。

柳州市2016年流感暴发流行期H3N2流感病毒血凝素基因特征分析

H3N2流感病毒自1968年第1次引起流感大流行以来，一直在人群中呈现季节性流行并不断发生变异，因此，世界各国均对其进行监测分析。柳州市CDC微生物检验科自2009年加入国家流感监测网络实验室以来，一直对柳州市的流感病毒进行监测，据监测数据显示，柳州市每年均有H3N2流感病毒流行，并间隔一段时间就有一次不同规模的疫情发生。

绿色荧光蛋白-流感病毒血凝素蛋白-宫颈癌细胞特异性穿膜肽融合蛋白的表达及其体外穿膜活性分析

目的获得具备从内含体逃逸的宫颈癌特异性穿膜肽GFP-HA-PTP融合蛋白,探讨其在宫颈癌细胞中的靶向穿膜效应。方法构建p ET15b-GFP-HA-PTP融合原核表达质粒,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导和NI-NTA树脂纯化得到融合蛋白,经Western blotting分析确认后,于荧光显微镜下观察GFP-HA-PTP的靶向穿膜活性。结果大肠杆菌高效表达了经Western blot鉴定正确的FP-HA-PTP融合蛋白,且此融合蛋白能够靶向宫颈癌细胞株Siha和Caski,并高效地从内含体中逃逸进入胞浆。结论 GFP-HA-PTP融合蛋白能够高效靶向穿膜进入培养宫颈癌细胞。

甲型流感病毒血凝素基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白。方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒rBacmid-HA。rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒rBac-HA。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测重组杆状病毒基因组HA基因,间接免疫荧光法、Western blot法和ELISA法检测HA蛋白的表达。结果穿梭质粒rBacmid-HA经PCR鉴定构建正确;第3代rBac-HA的滴度为3×107 pfu/ml;感染rBac-HA的sf9细胞经PCR扩增可见4 216 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western blot鉴定与鼠抗甲型流感病毒HA(H1)单抗和鸡抗流感病毒(California株)多抗发生特异性反应,ELISA检测与鼠抗流感病毒(PR8株)多抗特异性结合的能力强于与鸡抗流感病毒(California株)多抗结合的能力。结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了甲型流感病毒HA蛋白。

稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立

目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。

2017年贵州省H7N9禽流感病毒血凝素基因特性分析

为了解2017年贵州省H7N9禽流感病毒的分子特征和疾病风险,运用生物信息学软件对14株病毒HA基因的同源性、遗传进化、受体结合关键位点、致病相关和糖基化位点进行分析,明确了其HA基因核苷酸同源性为95.9%~100%,与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013疫苗株的同源性分别为96.8%~97.8%和96.8%~97.9%;14株毒株均属于长三角分支,来源于5个不同的毒株;其中13株为低致病性禽流感毒株,而A/Guizhou-Weining/CSY01/2017为高致病性禽流感毒株;受体结合关键位点14株毒株均存在G186V的突变,13株存在Q226L的突变;潜在糖基化位点无变异。

人感染 H7 N9禽流感病毒血凝素蛋白线性 B 淋巴细胞抗原表位的预测及鉴定

目的：预测并鉴定人感染H7N9禽流感病毒血凝素（HA）蛋白的线性B淋巴细胞抗原表位及H7亚型的特异性。方法选取绍兴市人民医院提供的人感染H7 N9患者不同时间的三份血清样本和一份健康对照血清样本，采用TMHMM Sever v．2．0预测蛋白质胞外区，采用DNAStar Lasergene’ s Protean、BcePred和ABCpred预测其优势B淋巴细胞抗原表位，并用间接酶联免疫吸附试验（ ELISA）验证预测的B淋巴细胞抗原表位的免疫原性。使用Clustal X2．1软件将预测抗原表位与GenBank上H7N9和H1～H16亚型流感病毒HA蛋白的氨基酸序列进行多重序列比对以分析预测抗原表位的H7亚型特异性，采用Cn3D 4．3．1软件分析预测的线性B淋巴细胞抗原表位在H7N9禽流感病毒HA蛋白中的分布情况。结果 HA蛋白可能的B淋巴细胞表位位于胞外区N端的第172～183、363～380、452～472和第491～506四个区段。 ELISA结果表明，四个预测的B淋巴细胞表位均与已确诊患者血清发生阳性反应。多重序列比对结果发现第172～183和452～472区段与其他亚型氨基酸序列差异最大，可能具有更好的H7亚型特异性。 HA蛋白的三维结构进一步证明预测的四个B淋巴细胞抗原表位均位于HA蛋白表面。结论鉴定出了四个 HA蛋白线性B淋巴细胞抗原表位，其中第172～183和452～472区段具有更好的H7亚型特异性，可作为新型疫苗表位设计和H7抗原和抗体的特异性检测的依据。

类风湿关节炎患者HLA—DR4／1表型与流感病毒血凝素特异性T细胞增殖及其抗体的关系

目的探讨类风湿关节炎（RA）患者人类白细胞抗原（HLA）-DR4／1表型与流感病毒血凝素（HA）308-317多肽特异性T细胞增殖和血清抗HA308-317抗体之间的关系。方法将HA308-317多肽与70例RA患者外周血单个核细胞（PBMC）共孵育5d，^3H掺入法测定T细胞增殖。用ELISA法检测RA患者血清HA308-317抗体水平。以序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）技术对RA患者进行HLA-DR分型。结果在70例RA患者中，27例HLA-DR4／1表型阳性。其中，HA308-317多肽可刺激T细胞增殖的RA患者有17例（62.9％），10例无反应性；15例（55．6％）HLA-DR4／阳性RA患者抗HA308-317抗体阳性。在HLA-DR4／1表型阴性的RA患者中，T细胞对HA308-317多肽有反应性者10例（23．3％），无反应性者33例；25例（58．1％）患者抗HA308-317抗体阳性。HLA-DR4／1表型阳性组HA308-317特异性细胞增殖高于HLA-DR4／1表型阴性组（P〈0．01），但两组血清中HA308—317抗体水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论RA患者HA308-317特异性T细胞增殖与HLA-DR4／1表型有关，HA308-317抗体生成与HLA-DR4／1亚型无明显关系；HA308—317多肽可能通过诱导HLA-DR4／1特异性T细胞活化参与RA的发病。

H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫／杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Sf9昆虫细胞。将重组杆状病毒感染HFive细胞,72h左右收获细胞,超声波裂解,SDS—PAGE结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得表达。蛋白胶薄层扫描分析显示:表达的HA蛋白占重组杆状病毒感染细胞总蛋白含量的17．1％。Western-blot 及血凝实验结果显示,表达的禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白具有生物学活性。表达的H5 HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5 HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIV H5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100％的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡:为研制禽流感H5N1亚型病毒亚单位疫苗,防制禽流感奠定了基础。

甲型流感病毒宿主特异性研究进展（摘要）

大量证据显示，哺乳动物甲型流感病毒可能来源于野生水禽。甲型流感病毒由水禽传播给家禽和哺乳动物是近年流感爆发的根源；但不同物种来源的甲型流感病毒不能在其他物种中有效繁殖，表明甲型流感病毒存在宿主特异性。本文简要概述了近年来流感病毒宿主特异性的相关知识及研究进展，重点介绍宿主受体唾液酸衍生物种类、唾液酸-半乳糖基连接键型对病毒感染宿主特异性的影响以及流感病毒血凝素的受体特异性。

基于流感病毒M2蛋白的通用疫苗研究进展

目前,疫苗免疫仍然是防控流感病毒最有效的措施,但当前商品化的流感疫苗主要是通过诱发流感病毒血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗体起免疫保护作用。由于流感病毒亚型众多,HA有16个亚型,NA有9个亚型,

甲型H1N1流感病毒裂解疫苗引起心悸、血压升高1例

病例：患者,男,43岁,既往体健,否认药物及食物过敏史。2009年11月5日,按计划先禁食到医院体检,当时测血压（BP）110/70mmHg（1mmHg=0.133kPa）。体检结束后遂接种甲型H1N1流感病毒疫苗。接种剂量：0.5mL,含甲型H1N1流感病毒血凝素15 g;于左上臂外侧三角肌肌内注射;接种后留院观察30分钟;

人禽流感H5N1病毒HA1蛋白抗原表位及主要免疫功能区特征的研究

目的确定人禽流感H5N1病毒HA1蛋白的单克隆抗体(McAb)抗识别表位及主要免疫功能区。方法将16条人禽流感H5N1病毒HA1基因重叠片段克隆入真核表达载体pDisplay,构建表达HA1蛋白的重叠肽段重组质粒,转染HeLa细胞后制备细胞抗原片。利用灭活的H5N1病毒免疫BALB/c小鼠,制备病毒特异单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗),采用间接免疫荧光法分析单抗、多抗与HA1肽段的反应性,确定HA1蛋白的单抗识别表位及主要免疫功能区。结果成功克隆、表达了16条不同长度的H5N1肽段,并制备、获得30株分泌抗H5N1型禽流感病毒McAb的杂交瘤细胞株,其中18株为抗HA的单抗,18株中有6株单抗具有中和病毒活性。利用表达的H5N1肽段对单抗识别表位进行分析,初步确定3B5、3D1、3B2、M6、M3等18株McAb识别表位区域分别位于氨基酸残基aa133-143、aa155-165、aa166-196、aa166-176、aa34-66及aa296-328之间,其中3B5、3D1、3B2、M6等McAb识别表位为序列依赖型表位,M3和M7等具有中和活性的McAb识别表位为构象性中和表位。结论利用制备的H5N1病毒特异性McAb和表达的病毒HA1蛋白重叠肽抗原,初步确定了18株抗HAMcAb的识别表位和HA1蛋白的主要免疫功能区,为进一步研究开发新型疫苗提供了重要理论依据。

抗流感病毒单克隆抗体CR6261在糖基工程酵母中的表达及分析

目的:在糖基工程酵母中表达抗流感病毒单克隆抗体CR6261,并对其进行结构分析和活性测定。方法:从GenBank获得CR6261抗体的全基因序列,构建轻重链表达载体pPICZα-CR6261-H-L,电转入糖基工程酵母,利用甲醇诱导型启动子AOX1表达CR6261抗体蛋白,通过SDS-PAGE、Western印迹筛选表达菌株,用Protein A亲和层析、Superdex200凝胶过滤柱分离纯化抗体蛋白,应用ELISA方法对纯化后的蛋白进行活性鉴定。结果:CR6261抗体蛋白分泌在培养上清中,且纯化后的蛋白与糖基工程酵母表达的流感病毒血凝素蛋白HA5、HA7有结合活性,与商业化三价流感病毒裂解疫苗亦有结合活性。结论:实现了抗流感病毒单克隆抗体CR6261在糖基工程酵母中的表达,并初步检测了其广谱活性,可为酵母表达抗体蛋白药物制备提供参考,ELISA初步评价还显示了其在诊断上的应用前景。