两种海人酸癫痫小鼠模型的建立及比较研究

目的比较分析海人酸(kainic acid,KA)侧脑室(intracerebroventricular,ICV)注射和腹腔注射(intraperitoneal injections,IP)两种给药路径建立的颞叶癫痫小鼠模型早期的行为学和病理学差异。方法100只C57BL/6N野生型(wild type,WT)雄性小鼠(体质量为20~22 g),按随机数字表法分为4组:ICV+normal saline(NS)对照组(n=10),ICV+KA模型组(n=40),IP+NS对照组(n=10),IP+KA模型组(n=40)。ICV+KA模型组使用600 nL的KA(0.5 mg/mL)进行侧脑室注射,IP+KA模型组按25 mg/kg剂量进行腹腔注射,对照组使用等量的生理盐水进行侧脑室和腹腔注射。建立模型3 d后,进行行为学、分子生物学(Western blot)和神经病理损伤评估(FJB染色,TUNEL染色,免疫荧光染色)。结果两对照组无痫性发作,两模型组均出现痫性发作。IP+KA组与ICV+KA组死亡率分别为47.50%和65.00%,造模成功率分别为80.00%与60.00%。与IP+KA组比较,ICV+KA组小鼠模型成功率明显增高而死亡率明显减少。FJB染色和TUNEL染色结果显示,与IP+KA组比较,ICV+KA组海马的神经变性和凋亡改变程度变化更加明显(P<0.05)。与IP+KA组比较,ICV+KA组海马凋亡蛋白表达差异也有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果显示,ICV+KA和IP+KA组海马和皮层的星形胶质细胞和小胶质细胞较对照组明显激活(P<0.05),但是ICV+KA组海马和皮层的胶质细胞激活程度均强于IP+KA组(P<0.05)。ICV+KA组海马和皮层的GFAP和Iba-1蛋白表达均高于IP+KA组(P<0.05)。结论两种KA制备方法均可制备出成功的癫痫模型。但ICV路径制备癫痫小鼠具有更高的成功率和更少的死亡率,并且神经病理损害程度和胶质细胞激活程度更加明显。

黄芩苷对海人酸致痫小鼠海马神经细胞凋亡的影响

目的探讨黄芩苷对海人酸诱导的小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞凋亡的影响。方法 54只ICR雄性小鼠随机分为对照组、癫痫持续状态(SE)组、黄芩苷治疗组(100mg/kg)。采用腹腔内注入海人酸(12mg/kg)建立小鼠癫痫持续状态模型。通过TUNEL染色观察小鼠海马CA1、CA3区神经细胞的凋亡程度;免疫组化观察海马组织中caspase-3细胞的阳性表达情况;RT-PCR检测海马组织中Bax、Bcl-2 mRNA的含量;Western blot检测Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表达量。结果与癫痫持续状态组相比,黄芩苷可显著减轻癫痫持续状态后海马神经细胞的凋亡(CA1区:0.3984±0.0586 vs.0.7258±0.0235,P<0.05;CA3区:0.3593±0.0391 vs.0.6191±0.0686,P<0.05),降低海马中Bax mRNA的合成和Bax、caspase-3蛋白的表达(P<0.05),增加Bcl-2 mRNA及蛋白的表达(P<0.05)。结论黄芩苷能够减轻小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞的凋亡,其作用机制可能通过上调Bcl-2的表达和下调Bax、caspase-3的表达来发挥抗凋亡作用。

EphA4在海人酸诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡中的表达及天麻素的影响

目的:探讨EphA4在海人酸诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡过程中的表达变化,及天麻素对EphA4表达的影响。方法:提取新生大鼠大脑皮层神经元体外培养,7d后随机分为对照组、海人酸模型组、海人酸+天麻素干预组;采用倒置相差显微镜观察神经元形态学变化,Hoechst33258荧光染色、AO/EB荧光染色、LDH活性测定检测神经元凋亡和坏死情况,CY3荧光染色检测EphA4表达变化。结果:海人酸模型组较对照组神经元凋亡率显著升高(P<0.01),EphA4表达显著增高(P<0.01);海人酸+天麻素干预组较海人酸模型组神经元凋亡率显著下降,EphA4表达上调显著受抑。结论:海人酸诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡过程中EphA4表达增高,天麻素在这一过程中抑制EphA4表达,对神经元具有一定保护作用。

海人酸杏仁核点燃大鼠癫痫模型的建立和评价

目的:建立和评价海人酸杏仁核微量注射点燃癫痫动物模型。方法:选用雄性Wistar大鼠,以杏仁核外侧基底核为给药靶点,在立体定位仪下,微量注射海人酸1μg后进行大鼠的行为学和电生理学观察,并分别于第6、12、72 h和7、14、21 d对大鼠脑组织进行病理学观察。结果:海人酸微量注射后实验大鼠出现典型的癫痫发作过程,顶叶皮层脑电图依次出现多种形式的痫性放电,HE染色显示海马和颞叶皮层神经细胞的相应病理变化,点燃成功率为90%。结论:采用杏仁核海人酸微量注射方法成功建立了Wistar大鼠点燃癫痫模型,该模型适用于颞叶癫痫的相关研究。

海人酸诱发癫痫敏感性长期增强的形成与维持

用海人酸（ＫＡ）１０ｍｇ／ｋｇ给Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠皮下注射，注射后０－３０ｍｉｎ内，动物出现凝视和湿狗样抖动；３０－１２０ｍｉｎ出现时间依赖的癫痫行为；２ｈ后，出现自发反复癫痫发作，４ｈ减弱，８ｈ停止。然后，在上述急性癫痫发作后８，４，２，１周，及１－６ｄ时，分别用阈下剂量ＫＡ（５ｍｇ／ｋｇ）检测癫痫敏感性。结果在明，ＫＡ诱发动物急性癫痫发作后，其癫痫敏感性长期增强，且形成过程是在ＫＡ后５－７ｄ。

雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠神经元caspase3和caspase9蛋白表达的影响

目的 :通过检测海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达,探讨雷公藤内酯抑制神经元凋亡的机制。方法 :结晶紫染色观察海马神经元形态,免疫组化法检测海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平。结果 :结晶紫染色结果显示,海人酸组中,海马神经元变性或丢失,胞体皱缩,形态不规则。雷公藤内酯干预组中海马神经元的数量和形态与对照组相似,胞浆清晰淡染,核仁清楚。免疫组化染色显示,与对照组比较,海人酸组海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平显著增高(P<0.05);与海人酸组相比,雷公藤内酯干预组神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平显著减少(P<0.05)。结论 :雷公藤内酯可下调海人酸致痫大鼠海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达,从而抑制神经元凋亡。

杏仁核微量注射谷氨酸和海人酸对大鼠睡眠—觉醒的影响

目的研究杏仁核在睡眠—觉醒调节中的作用。方法多导睡眠描记术（ＰＳＧ）和杏仁核微量注射。结果Ｌ－谷氨酸引起觉醒（Ｗ）增多、慢波睡眠（ＳＷＳ）和总睡眠时间（ＴＳＴ）减少；注射海人酸后第１天引起失眠，第３天后Ｗ减少，ＳＷＳ和ＴＳＴ增多，而快波睡眠无显著变化。结论兴奋杏仁核神经元胞体可引起睡眠抑制，而损毁杏仁核神经元胞体则引起ＳＷＳ增多。

虎杖苷调节海人酸致痫鼠颞叶、海马区P-糖蛋白表达的实验研究

目的:观察虎杖苷对海人酸致癫痫鼠颞叶、海马区P-糖蛋白表达的影响。方法:通过脑立体定向技术,将海人酸(KA)1.5μg(3μL)注射至SD大鼠海马,制作颞叶癫痫模型,假手术组为同法于大鼠海马注射3μL生理盐水。将建模成功的26只癫痫大鼠随机分为虎杖苷处理组(n=13)、生理盐水处理组即对照组(n=13)。分别给予虎杖苷(100 mg/kg)、等体积生理盐水灌胃1次/天,均连续30天。观察记录大鼠发作频率、级别及持续时间,并采用免疫组化EnVision法检测大鼠颞叶、海马区P-糖蛋白(P-gp)表达水平。结果:观察期内虎杖苷组在干预后,发作频率及级别、平均持续时间较前明显减少(均P<0.05),而对照组未见差异(均P>0.05),对照组和虎杖苷组P-gp的表达强度均高于假手术组(均P<0.05),与对照组比较,虎杖苷组P-gp的表达水平有所下降(P<0.05)。结论:虎杖苷有一定的抗癫痫作用,下调P-gp的表达可能为其机制之一,为开发新的辅助抗癫痫药物提供思路。

雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠海马神经元的保护作用及相关PUMA蛋白表达的影响

目的探讨雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠海马神经元的保护作用及对海马神经元PUMA(P53上调的细胞凋亡调控因子)蛋白表达的影响。方法 30只SD大鼠随机分成3组,其中对照组10只,海人酸组10只,雷公藤内酯干预组10只。结晶紫染色观察海马神经元的形态变化,免疫组化染色法检测海马神经元PUMA蛋白的表达。结果结晶紫染色结果显示,海人酸组中,海马神经元变性或丢失,胞体皱缩,形态不规则。而雷公藤内酯干预组中海马神经元的数量和形态与对照组相似,胞浆清晰淡染,核仁清楚。免疫组化染色结果显示,海人酸组中海马神经元PUMA蛋白表达水平与对照组比较显著增多(P<0.05);雷公藤内酯干预组中海马神经元PUMA蛋白表达水平与海人酸组比较显著减少(P<0.05)。结论雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠海马神经元具有保护作用;其可下调海马神经元PUMA蛋白的表达,抑制海人酸致痫大鼠海马神经元凋亡。

瘦素在海人酸诱导小鼠颞叶癫痫海马损伤中的作用

目的探讨瘦素(Leptin)与颞叶癫痫发生、发展过程的关系。方法外源Leptin注射C57BL/6J小鼠后,右侧海马微量注射200 ng海人酸(kainic acid,KA)诱导颞叶癫痫,记录小鼠癫痫评分,1周后观察小鼠海马病理变化,包括Western blot检测Bax的表达水平,尼式染色(Nissl staining)观察海马Hilus区神经元丢失,免疫荧光检测Hilus区星形胶质细胞活化与增殖。结果在200 ng KA诱导的颞叶癫痫模型基础上,10 mg/kg外源Leptin预处理后,癫痫评分增加约52%,Bax表达水平升高约75%(P<0.05),海马Hilus区神经元丢失严重,星形胶质细胞过度活化。结论 Leptin增加了KA诱导的神经元凋亡,加重KA诱导的神经病理过程。

杏仁核电点燃及海人酸点燃难治性癫大鼠脑组织及外周血P糖蛋白的表达

目的探讨杏仁核电点燃及海人酸点燃难治性癫大鼠模型脑组织及外周血P糖蛋白(Pgp)过度表达的可能机制,并比较不同方法致难治性癫大鼠脑组织及外周血中Pgp的表达趋势。方法应用电刺激点燃及海人酸点燃方法对大鼠杏仁核进行点燃,制作难治性癫模型;将其分为A组(杏仁核电点燃,12只),B组(杏仁核海人酸点燃,12只),另设C组(杏仁核埋入电极而不点燃,且给予卡马西平灌胃,8只),D组(杏仁核注射生理盐水,且给予卡马西平灌胃,8只),E组(杏仁核埋入电极而不点燃,且给予生理盐水灌胃,8只),F组(杏仁核注射生理盐水,且给予生理盐水灌胃,8只);采用免疫组化方法分析两种模型大鼠脑组织及外周血Pgp的表达。结果A组、B组大鼠脑组织及外周血Pgp表达明显高于其余4组,差异有统计学意义(均P<0.05);C组、D组大鼠脑组织及外周血Pgp表达高于E组及F组,差异有统计学意义(均P<0.05);A组与B组大鼠脑组织及外周血Pgp的表达差异无统计学意义。结论脑组织及外周血Pgp的过度表达可能是未能控制的癫发作、服用抗癫药(AEDs)等多因素共同作用的结果;难治性癫发生1个月后,脑组织中Pgp高表达的大鼠外周血中Pgp的表达同样高于脑组织中Pgp低表达大鼠外周血Pgp的表达,提示难治性癫大鼠外周血及脑组织中Pgp的表达趋势具有一定的相关性。

海人酸致癫痫大鼠海马GABA_B受体亚单位GBR1amRNA表达的研究

目的 通过研究海人酸致癫痫大鼠海马 GABAB受体亚单位 GBR1a m RNA表达的变化 ,为进一步探明癫痫发病的受体分子生物学机制奠定基础。方法 在立体定位仪下 ,将海人酸注射至大鼠杏仁核制备癫痫模型。将大鼠随机分为正常组和海马致癫痫组 ,分别于不同时间取材 ,进行脑组织 GABAB受体亚单位 GBR1a m RNA原位杂交检测。结果 正常组海马各区均有极少量的 GABAB受体亚单位 GBR1a m RNA的分布 ;海人酸致癫痫组( 6 h,12 h,2 4h) GABAB受体亚单位 GBR1a m RNA水平显著高于对照组 ( P<0 .0 1)。结论 正常大鼠海马各区存在着少量的 GBR1a m RNA表达 ,海人酸致痫后 6 h,12 h,2 4h,GBR1a m RNA的表达水平上调。

海人酸颞叶癫痫模型的建立及其行为与病理学改变

目的探讨脑内局部给药建立颞叶癫痫(EP)模型方法及其行为与病理学改变.方法通过立体定向术向大鼠海马局部注射海人酸(KA)而建立颞叶EP模型,观察其行为学、脑电图和病理学改变情况.结果 KA注入海马后大鼠表现出凝视、湿狗样抖动、口的咀嚼运动、点头、肢体阵挛等表现.随着时间的推移,大鼠主要表现为阵发性旋转,并身体立起、向上窜跳、跌倒、四肢抽搐,约10 h后发作停止,逐渐恢复到正常大鼠状态,以后每周发作1～2次,主要为Ⅱ～Ⅳ级.结论大鼠脑内局部注入KA后EP发作明显,其行为症状、海马病理改变类似人类颞叶EP,可作为很好的研究颞叶EP的工具.

依达拉奉对海人酸致颞叶癫痫大鼠海马神经元的保护作用

目的本实验观察依达拉奉对海人酸致痫大鼠海马神经元损伤的保护作用。方法选用成年健康雄性Wistar大鼠18只,体重260±20g。实验动物随机分为3组,①sham组(n=6):右侧海马CA3区注入等量的生理盐水;②KA模型组(n=6):右侧海马CA3区注入KA 4μg.kg-1(4μg/μl);③依达拉奉组(n=6):右侧海马CA3区注入KA 4μg.kg-1(4μg/μl)后,即刻给予依达拉奉10mg.kg-1.d-1腹腔注射。于大鼠注药或假手术后立即观察各组大鼠的行为学表现,于7d断头取脑,石蜡切片进行硫堇染色,于光学显微镜下观察注药对侧(左侧)海马CA1、CA3区及CA4门区组织形态学特征,并对其进行组织学分级。结果 Sham组大鼠注射对侧海马CA1、CA3和CA4门区无明显组织损伤,组织学分级多为0～1级,ND值为198±20.62和212±30.14;模型组KA致痫大鼠可见明显的组织损伤,组织学分级多为2～3级,ND值为79±13.72和90±14.98,与sham组相比,组织学分级显著升高(p<0.05),ND值显著降低(p<0.01)。依达拉奉组大鼠海马CA1区可见少量、散在性神经元坏死,组织学分级多1～2级,ND值为101±16.85和135±12.17。与模型组相比,组织学分级降低(p<0.05),ND值显著升高(p<0.05)。结论依达拉奉能够减轻KA致痫大鼠海马神经元的损伤,对神经元具有保护作用。

线粒体信号转导途径参与海人酸致痫大鼠海马神经元凋亡

目的:研究海人酸(KA)致痫大鼠海马神经元凋亡、线粒体功能和线粒体凋亡通路相关蛋白的表达,探讨线粒体凋亡通路在KA致痫大鼠海马神经元损伤中的作用。方法:40只雄性SD大鼠随机分为2组,分别为模型组:32只,采用一侧海马注射KA(2μg/Kg)制备;等渗盐水对照组,8只,一侧海马注射等量的等渗盐水。模型组根据点燃时间又分为6 h、1 d、3 d和7 d,每组8只。采用高效液相色谱(HPLC)测定大鼠海马组织CA3区中谷氨酸(glutamic acid,Glu)的含量;流式细胞仪及原位末端标记法(TUNEL)测定神经元凋亡情况;JC-1荧光检测线粒体膜电位;Fluo-3荧光染色检测细胞质内Ca2+浓度;Western blot检测各组海马细胞内细胞色素C(cyctochrome C)和caspase-9表达。结果:①模型组大鼠海马组织中Glu含量自KA注射后3d开始增加,第7d达到高峰。与对照组比,差异有显著性统计学意义。②KA注射6 h始海马神经元内Ca2+浓度升高,线粒体膜电位下降,凋亡细胞数增高,至第7 d最为显著。③对照组大鼠海马细胞色素C和caspase-9均有一定量表达,模型组KA注射后6 h,海马细胞色素C和caspase-9表达即显著增加,分别为对照组的1.78和2.14倍,与对照组比,差异有显著性统计学意义。至第7 d达到高峰,分别为对照组的4.37和3.20倍,与对照组比,差异有显著性统计学意义。结论:线粒体凋亡通路参与KA致痫大鼠海马神经元损伤。

扩散峰度成像在大鼠海人酸癫痫模型中的研究

目的:通过大鼠海人酸(KA)癫痫模型实验,探讨扩散峰度成像(DKI)应用于原发性癫痫研究的可行性。方法:将KA癫痫模型组(KA组)及正常对照组(NC组)各20只大鼠,在GE 3.0T磁共振仪上行常规MRI、DKI及3DMPRAGE等多序列扫描,在6个部位的灰质(基底节区、海马、杏仁核海马区、颞叶皮层、顶叶皮层、额叶皮层)和3个部位的白质(外囊区、前联合、胼胝体)内选取双侧对称部位的兴趣区(ROI),手动测量各向异性分数(FA)、平均扩散率(MD)、平均峰度值(MK)并进行统计学分析。结果:在KA和NC组间,FA值(双侧均值)差异有统计学意义的部位为杏仁核海马区(分别为0.20±0.04和0.22±0.02,P=0.0337)、前联合(分别为0.22±0.04和0.28±0.06,P=0.002)及胼胝体区(分别为0.21±0.05和0.26±0.03,P=0.0002);MD值(双侧均值)差异有统计学意义的部位为海马(分别为0.67±0.16和0.74±0.04,P=0.0275);MK值(双侧均值)差异有统计学意义的部位为基底节区(分别为0.10±0.26和0.83±0.06,P=0.0098)、海马(分别为0.83±0.15和0.73±0.09,P=0.0499)及胼胝体区(分别为0.93±0.22和0.81±0.07,P=0.036)。结论:扩散峰度成像可用于原发性癫痫的研究,有望成为应用于人类癫痫研究的新的影像学方法。

天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用

目的探讨天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用及可能机制。方法提取新生大鼠大脑皮质神经元体外培养,7d后随机分为对照组、海人酸模型组、不同浓度天麻素干预组(12.5、25、50mg/L);采用倒置相差显微镜观察神经元形态学变化,AO/EB荧光染色检测神经元凋亡,LDH活性测定检测胞膜稳定性,CY3荧光染色检测EphA4表达变化。结果与海人酸模型组相比,各天麻素干预组神经元凋亡率、LDH活性显著下降(P<0.01),EphA4表达上调显著受抑(P<0.01),以25mg/L天麻素效果最明显。结论天麻素对海人酸诱导大鼠大脑皮质神经元损伤具有保护作用,以中浓度效果最佳,可能与抗凋亡、稳定细胞膜、抑制细胞活化蛋白EphA4的表达上调等因素相关。

建立海人酸颞叶癫癎模型的实验研究

目的建立用立体定向技术制作大鼠海人酸颞叶癫癎模型的方法,并对模型永久癫癎敏感性的原因进行研究。方法将海人酸通过立体定向手术注入大鼠的海马组织,于不同的时间观察大鼠的癫癎发作情况和海马组织的病理学改变。结果大鼠在经历“湿狗样抖动”、口唇和头的自运动症、前肢抽搐、后肢抽搐后,进入强直-阵挛性全身发作,之后,每周均有自行发作,表现与人类颞叶癫癎极为一致。海马神经元的缺失、胶质细胞增生是模型长期癫癎敏感性的基础。结论立体定向方法建立的大鼠颞叶癫癎模型的发作形式及病理学改变与人类的颞叶癫癎极为一致,并且具有长期的癫癎敏感性。另外,立体定向局部注药所用海人酸的量较系统给药明显减少,花费显著减少。因此,该模型即可靠又经济。

海人酸颞叶癫痫大鼠海马GAD65表达的动态变化

目的探讨GAD65在颞叶癫痫大鼠海马的表达变化及其意义。方法112只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=70)与对照组(n=42),实验组大鼠选用海人酸腹腔注射法建立颞叶癫痫模型,对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水。选取腹腔注射后3h、6h、12h、24h、48h、7d和30d为研究的时间点,颞叶海马的CA1区、CA3区、齿状回为研究部位。腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化,大鼠处死前进行EEG描记。用原位杂交方法检测不同时间点海马不同区域GAD65mRNA的表达,免疫组织化学法检测GAD65蛋白的表达。结果实验组大鼠海马GAD65mRNA及其蛋白的表达随时间呈逐渐增高趋势,致痫后48h￣30d,GAD65mRNA及其蛋白表达较对照组增高(48h,P<0.05;7￣30d,P<0.01)。结论颞叶癫痫慢性期海马GAD65表达的增高是癫痫发生后机体的一种内源性抗痫机制。

不同剂量海人酸海马注射建立大鼠颞叶癫痫模型的实验研究

目的通过比较建模成功率,找到建立大鼠海人酸(kainic acid,KA)颞叶癫痫模型的合适用药剂量。方法雄性SD大鼠80只,体重240-260g,随机分为4组,每组20只,分别向右侧海马注射KA1.0μl,0.7μl,0.4μl和生理盐水1.0μl,KA浓度0.5μg/μl,术后观察4h,按照Racine的癫痫大鼠发作时的行为学分级标准,连续3次达到Ⅳ-Ⅴ级发作者确定成功模型。结果观察结束时,生理盐水组大鼠全部存活且未见痫性发作。KA1.0μl组死亡14只,Ⅴ级发作6只。KA0.7μl组死亡2只,Ⅴ级发作15只,Ⅳ级发作3只。KA0.4μl组死亡1只,Ⅴ级发作1只,Ⅳ级发作6只,Ⅲ级发作9只,Ⅱ级发作3只。经统计学检验,KA0.7μl组大鼠颞叶癫痫模型的成功率最高。结论 0.7μlKA右侧海马注射较易获得大鼠颞叶癫痫模型。