仿生消化法估测生长猪饲料有效能的准确性及可加性研究

旨在探讨仿生消化法估测生长猪饲料原料消化能(DE)、代谢能(ME)和净能(NE)的准确性和可加性,为快速获得生长猪饲料的有效能值提供参考。采用单因素完全随机设计,以生长猪仿生消化法测定12个能量饲料、9个蛋白质饲料,以及由上述21个饲料原料配制的17个饲粮的酶水解物能值(EHGE),每个处理5个重复,每个重复1根消化管。通过EHGE、粗蛋白(CP)和酸性洗涤纤维(ADF)估测DE、ME及NE值。比较饲料原料有效能(DE、ME、NE)估测值与GB/T 39235-2020中同本研究同名的17个饲料原料的能量利用率乘以总能(GE)实测值得出的体内有效能值的差异及相关性,以验证仿生消化法估测饲料有效能的准确性。根据饲料原料的有效能估测值计算饲粮有效能加权值,并根据饲粮EHGE估测有效能的数学模型获得饲粮的有效能值,比较两者的差异以验证仿生消化法估测饲料有效能值的可加性。结果表明,采用GB/T 39235-2020计算的17个饲料原料的DE、ME、NE对EHGE结合CP、ADF估测的有效能值线性回归模型的决定系数(R2)分别为0.774,0.778和0.870。回归诊断分析发现,米糠、小麦麸和玉米胚芽粕偏离了其他14个饲料原料样品体内值与估测值的线性关系■。剔除上述3个样品后,GB/T 39235-2020计算的体内有效能对估测值线性回归的决定系数高于0.93。17个试验饲粮的EHGE实测值对加权计算值,DE、ME和NE的估测值对加权计算值的线性回归与Y=X重叠(R2>0.95,P<0.01)。上述结果表明,仿生消化法可以满意地估测14个饲料样品的有效能值,但低估了米糠和小麦麸的有效能值,却高估了玉米胚芽粕的DE和ME。仿生消化法测定的EHGE及通过EHGE估测的DE、ME、NE均具有良好的可加性。

基于体外仿生消化法构建不同来源玉米、高粱原料的鸡有效能预测模型

本试验旨在以不同来源的玉米、高粱原料为试验材料,利用单胃动物仿生消化系统(SDS)测定玉米和高粱原料的酶水解物能值(EHGE),并结合前期研究测定的鸡表观代谢能(AME)和真代谢能(TME),建立基于EHGE的AME及TME预测模型。本试验采用单因素完全随机设计,利用SDS分别测定5种不同来源的玉米原料和5种不同来源的高粱原料的体外干物质消化率(IVDMD)、体外总能消化率(IVGED)及EHGE。本试验参照的鸡AME和TME值为前期使用同批次原料,以健康体成熟的海兰褐公鸡通过自由采食法结合全收粪法测定所得。结果表明:1)不同来源玉米的IVDMD、IVGED和EHGE存在显著差异(P<0.05),其中2号玉米的IVDMD、IVGED和EHGE分别为75.12%、80.89%和15.19 MJ/kg DM,显著高于1号玉米(P<0.05)。2)不同来源高粱的IVDMD、IVGED和EHGE存在显著差异(P<0.05),其中5号高粱的IVDMD、IVGED和EHGE最高,分别为79.28%、85.15%和15.73 MJ/kg DM,而2号高粱的IVDMD、IVGED和EHGE最低,分别为55.93%、58.28%和10.72 MJ/kg DM。3)高粱的EHGE与AME和TME之间存在显著的正相关(P<0.05),玉米的EHGE与AME和TME之间的相关系数均为0.80。4)基于EHGE建立的玉米和高粱AME预测模型分别为:AME=7.62+0.57×EHGE[R^(2)=0.64,相对标准偏差(RSD)=0.11,P=0.11]、AME=10.03+0.31×EHGE(R^(2)=0.80,RSD=0.38,P=0.04);基于EHGE建立的玉米和高粱的TME预测模型分别为:TME=7.58+0.58×EHGE(R^(2)=0.64,RSD=0.11,P=0.10)、TME=9.98+0.33×EHGE(R2=0.89,RSD=0.28,P=0.02)。由此可见,不同来源的玉米和高粱的EHGE差异明显,在本试验条件下高粱原料的EHGE与AME和TME之间存在较强的相关关系,使用SDS对高粱原料的AME和TME有更好的预测性。

小鼠肠道固有层单细胞悬液制备的酶消化法比较研究

目的探究小鼠小肠固有层单细胞悬液制备的最佳酶消化法。方法采集10根长度一致的小鼠小肠,随机分为两组,每组分别采用以胶原酶A或胶原酶VIII为主的酶消化法制备固有层单细胞悬液,比较这两种酶消化法对单细胞悬液细胞获得率、细胞活性和细胞表面抗原的影响,然后对较优酶消化法制备的单细胞悬液进行流式检测。结果与以胶原酶VIII为主的酶消化法相比,以胶原酶A为主的酶消化法可以获得更高的细胞产量(9.48±1.10)×10^(9) vs(4.18±1.02)×10^(9)、活细胞比例(86.36±3.32)%vs(61.62±10.93)%以及活性CD45^(+)细胞比例(57.19±5.11)%vs(26.01±11.44)%、活性CD3^(+)细胞比例(8.73±2.89)%vs(4.52±2.49)%、活性CD4^(+)细胞比例(6.19±2.09)%vs(3.22±1.91)%和活性B220^(+)细胞比例(15.06±4.27)%vs(5.07±2.20)%,为后续流式检测提供了高质量细胞。结论以胶原酶A为主的酶消化法更适合于小鼠小肠固有层单细胞悬液的制备。

改良酶消化法体外培养、纯化分离人颞下颌关节滑膜A型细胞

目的探讨获取人颞下颌关节滑膜A型细胞的较佳方法,为A型细胞的进一步研究奠定基础。方法分别用组织块法、传统酶消化法与改良的酶消化法培养滑膜细胞,观察培养3 d、7 d、2周、4周时细胞生长情况,记录首次传代时间。通过免疫组化检测衬里层细胞CD68、组织蛋白酶S的表达来检测A型细胞吞噬功能。结果滑膜组织块法接种约7 d后部分组织块周围有细胞游离出来,约4周后滑膜细胞长势接近80%融合密度,可进行首次细胞传代。传统酶消化法细胞贴壁缓慢,4周时才能观察部分细胞团形成,向周围呈放射状生长,约6周后才可首次传代。改良酶消化法接种3 d后,光镜下观察部分单个细胞贴壁,有一些胶原酶未消化完全而又能经过研磨透过滤网的微小组织块或细胞团块,在贴壁后迅速向周围增殖,约2周后可首次传代,3周后再次传代的细胞量与组织块法4周后首次细胞传代时间相同。免疫组化检测CD68有阳性表达,细胞位于靠近关节腔侧,组织蛋白酶S未见阳性表达。结论改良的酶消化法培养对比组织块法、传统酶消化法,在获得相同细胞量的基础上,缩短了原代细胞培养时间。改良酶消化法传代时A型细胞尚在存活期间,给后期A型细胞纯化分离奠定了基础。巨噬细胞标志物Cathepsin S在A型细胞上无表达,提示A型细胞由于体内局部环境的作用,已有别于巨噬细胞。

翻转消化法和灌注消化法分离培养兔耳缘静脉内皮细胞的比较

目的比较翻转消化法和灌注消化法对培养血管内皮细胞生长的影响,以探讨培养血管内皮细胞的最佳方法。方法采用胰蛋白酶用翻转消化和灌注消化分别获取和培养兔耳缘静脉内皮细胞,并记录各组细胞生长情况,取第3代细胞用第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定所获得的细胞。结果两种消化方法首次获得的血管内皮细胞数量差别不大,但培养5d、10d后,灌注法组的细胞生长情况要明显优于翻转法组的细胞(P<0.01)。免疫组织化学检测细胞胞浆内Ⅷ因子相关抗原呈阳性。结论采用胰蛋白酶灌注法获取的内皮细胞生长情况要比翻转法获取的细胞好。

分次胶原酶消化法分离、培养成人肺微小动脉平滑肌细胞

目的:建立一种简便、高效分离和培养成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法并鉴定该方法培养的传代细胞生物学特性。方法:分次胶原酶消化法与传统胶原酶消化法进行细胞获得率、细胞存活率及培养成功率比较;绘制生长曲线对原代与传代细胞的生长特性进行分析;细胞形态学观察、平滑肌肌动蛋白(SMα-actin)测定及细胞免疫荧光化学法进行细胞鉴定及纯度计算;比较原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、染色体数量及形态。结果:分次胶原酶消化法优于传统胶原酶消化法,细胞获得率(3.10±0.29vs1.20±0.35)×108cells/L、细胞存活率(69%vs21%)及培养成功率(61.5%vs16.7%)(P<0.01);传代细胞长至融合时间7 d快于原代细胞21d;细胞显典型的"峰-谷"状生长,胞浆内表达SMα-actin,细胞纯度达98%以上;原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、二倍体数量(78.13%vs76.47%)及形态无明显差别(P>0.05)。结论:分次胶原酶消化法是一种简便、可行,获得高纯度、功能良好的成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法。经过此方法分离、培养的细胞在10代以内传代培养细胞生物学及遗传学特性稳定,可用于实验。

温胰蛋白酶消化法和冷消化法培养乳鼠心肌细胞的比较

目的探索一种经济、简单易行的心肌细胞培养方法。方法选用新生乳大鼠心肌细胞进行0.25%胰蛋白酶温消化法和冷消化法。结果与温消化相比,冷消化可获得较高的细胞存活率、24h生存率,而且在开始贴壁生长、出现搏动、形成所谓功能性合体细胞的时间和搏动频率等方面,冷消化法培养的心肌细胞都优于温消化法。结论虽然温胰蛋白酶消化法应用广泛,但冷消化能产生大量可存活细胞且较省力、经济、实验要求条件不高,故冷消化法优于温消化法。

碱消化法提纯大米淀粉的研究

蛋白质残留量是决定大米特性的主要因素,也是影响大米淀粉应用的关键因素。文中采用三因素正交实验设计,筛选了碱消化提纯大米淀粉的优化工艺条件:碱液浓度4g/L,提取时间4h,浆液浓度300g/L)。所得淀粉蛋白质残留量0·34%,低于Yamamoto法的0·42%;大米淀粉得率71%,比Yamamoto65%高6%。大米粉经碱消化去蛋白质提纯后,其膨润力和溶解度明显提高。

2种酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞生长特性的比较

目的：应用单纯胶原酶法、复合胶原酶法培养大鼠血管平滑肌细胞，比较其生长特性。方法：采用改良Lowry法测定了蛋白质含量，依照荧光指示剂法测定了细胞内[Ca2+］。结果：2种方法其生长曲线类似，均于7～8d至高峰，其蛋白质含量略有差异，也是在7～8d达最大，钙含量分别为（202．60±15．18）nmol／L和（153．20±11．34）nmol／L。结论：单纯胶原酶法相对经济，复合胶原酶法能更好地保护细胞，可根据具体情况选用。

胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.

植块法与酶消化法结合培养原代大鼠雪旺细胞

目的:探讨利用植块法与酶消化法相结合培养大鼠原代雪旺细胞的可行性,并研究其增殖规律。方法:取10只新生2～3d的SD大鼠双侧坐骨神经,剥除神经外膜,剪成约1mm3大小的碎块,用0.03%胶原酶和0.25%胰蛋白酶按1∶2对神经碎块消化12min,加入少量含10%胎牛血清的DMED培养基小心吹打细胞及组织块,再植于培养皿中培养。用S-100免疫组化染色鉴定雪旺细胞,结合Hoechst3342染色计算其纯度,在显微镜下确定细胞数量。结果:在植块培养24h后即有大量细胞迁出,2～6d细胞生长迅速,10d以后生长较为缓慢,其倍增时间为2.3d。经S-100染色证实所培养细胞为雪旺细胞,结合Hoechst3342染色可得其培养8d时纯度为95.1%,传代后纯度可达96.3%。10只新生鼠培养12d后可得细胞数约为4.8×106个。结论:利用植块法与酶消化法相结合的方法可以迅速获得大量高纯度的雪旺细胞,其增殖速度在前6d最快,倍增时间为2.3d。

酶消化法和匀浆法获得河蟹游离精子的比较研究

在pH 7.4的条件下,以不同的温度(27℃,32℃,37℃,42℃和47℃)、酶浓度(0.05%,0.10%,0.15%,0.20%和0.25%)和酶作用时间(5 min,10 min,15 min,20 min和25 min),通过正交试验,研究了胰蛋白酶消化中华绒螯蟹精荚获得游离精子的最佳反应条件.以每克精荚获得的精子数量为判据,发现酶作用时间是主要的影响因子,其次是温度和酶浓度.酶消化的最适反应条件是:温度为37℃,酶浓度为0.20%,作用时间为5 min.酶消化法与机械匀浆法的比较研究发现,酶消化法从每克精荚中获得的精子量为7.41×108个,显著高于匀浆法,且精子的死亡率为4.75%,显著低于匀浆法.此外,用人工诱导顶体反应法进一步检测酶消化法以及机械匀浆法所获得精子的顶体反应能力,酶消化法获得精子的顶体反应率为62.3%,而匀浆法为64.5%,两者无显著性差异.结果表明,酶消化获得游离精子的方法明显优于机械匀浆法.

基于单胃动物仿生消化系统的鸡仿生消化法测定饲料酶水解物能值变异程度的研究

本试验旨在探讨仿生消化法测定鸡饲料酶水解物能值(EHGE)的变异程度,为确定该方法的测试精度与变异因素提供参考。采用单因素完全随机设计,从3套同型号的单胃动物仿生消化系统(SDS-2)中随机选择仪器测定玉米、菜籽粕、棉籽粕的干物质消化率(DMD)和EHGE。每个样品分3个批次重复测定,每个批次设5个重复,每个重复1根消化管。分析仿生消化过程中各变量的变异系数及其与DMD和EHGE的相关性。结果表明:1)玉米、小麦、棉籽粕的DMD和EHGE的批内、批间与总变异系数均不超过1.00%。菜籽粕DMD的批内、批间与总变异系数均不超过1.00%,但EHGE的批内、批间与总变异系数最大值达到1.64%。仿生消化中,上样量、残渣的干物质量、残渣总能量、残渣能量浓度的批内、批间及总变异系数均分别低于0.40%、4.16%、4.17%和2.08%。2)玉米、菜籽粕的干物质上样量与DMD无显著性相关关系(P>0.05),仅棉籽粕的干物质上样量与DMD存在低度相关性(|r|<0.6,P<0.05)。4种饲料原料的上样量总能值与EHGE均无显著性相关关系(P>0.05),而残渣的干物质量与DMD,残渣总能量与EHGE高度相关(|r|>0.95,P<0.05)。除菜籽粕外,其他3个饲料的EHGE与残渣能量浓度无显著性相关关系(P>0.05)。由此可见,基于SDS-2的仿生消化法在测定鸡饲料的DMD和EHGE时具有满意的精度。残渣的干物质量的变异是影响DMD与EHGE测值变异的主要因素。

改进的酶消化法培养新生大鼠Müller细胞

目的通过改进的酶消化法,简化Muller细胞的培养和纯化过程。方法采用将眼球培养前处理和机械吹打、贴壁后反复胰蛋白酶消化的方法培养新生大鼠Muller细胞,进行免疫组织化学染色和光电镜观察。结果培养的Muller细胞光镜下胞体较大,胞浆丰富,电镜下细胞器丰富,可见糖原和直径为10nm的微丝,免疫组织化学示95%以上细胞谷氨酰胺合成酶阳性,神经胶质纤维酸性蛋白阴性。结论改进的酶消化法是一种简单可行的Muller细胞培养方法。

改进酶消化法培养SD大鼠成骨细胞及其鉴定

目的:改进SD大鼠成骨细胞的体外分离、培养方法并进行功能鉴定。方法:将新生SD大鼠处死,无菌条件下取出颅骨,剔净骨膜后剪成1mm×1mm×1mm大小组织块。组织块经0.25%胰蛋白酶消化20min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化。观察细胞形态学,选用碱性磷酸酶Gomori钙钴法染色,钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行鉴定。结果:培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,在体外培养时可维持其在体内的功能,即合成碱性磷酸酶、形成矿化结节,Ⅰ型胶原染色阳性。结论:用改进后的酶消化法分离、培养SD大鼠成骨细胞,更能减少胰蛋白酶在消化过程中对细胞造成的损伤,所获成骨细胞量多、纯度高,操作简易可行,可作为骨组织工程种子细胞常规的培养方法。

改良酶消化法在人脑胶质瘤细胞快速原代培养中的应用

目的建立一种人脑胶质瘤细胞原代培养的改良酶消化法。方法基于文献并结合实际工作中经验,改良既往文献报道的酶消化法,对32例不同级别的胶质瘤进行消化后行原代细胞培养,通过倒置相差显微镜观察肿瘤细胞的形态学特点,传代时采用差速贴壁法对原代细胞进行纯化。采用细胞免疫荧光法对原代细胞进行鉴定,通过细胞增殖实验(CCK-8法)绘制生长曲线,研究体外培养细胞的增殖情况。结果采用改良的酶消化法成功培养28例,失败4例,成功率为87.5%。培养成功的细胞贴壁生长,细胞状态稳定,形态各异,生长状态良好,并可传代。细胞免疫荧光检测显示胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性,证明培养的细胞为胶质瘤细胞;细胞增殖实验显示细胞在体外增殖活跃,肿瘤病理级别越高,细胞增殖能力越强。结论改良的酶消化法用于人脑胶质瘤细胞原代培养具有简单、高效、成功率高等优点。

酶消化法培养Balb/c胎鼠下颌突未分化外胚间充质细胞

目的 :用酶消化法培养Balb/c胎鼠下颌突外胚间充质细胞 ,并与组织块法相比较 ,研究其形态和生长特性。方法 :采用 1.2 5 g/L的胰酶消化法获取E 12 .5dBalb/c胎鼠下颌突外胚间充质细胞 ,用含 10 6U/LLIF的D/F12 培养细胞 ,倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况 ,免疫组化鉴定细胞来源及分化状况。结果 :培养的细胞呈单层生长 ,长梭形 ,有 2～ 4个突起 ,抗HNK - 1、Vimentin、S - 10 0、NSE染色阳性 ,抗GFAP、NF、MA染色阴性 ,证实为未分化外胚间充质细胞。结论 :用酶消化法可在短期内获得大量的未分化外胚间充质细胞。

骨组织块法和酶消化法联合培养人成骨细胞

背景:成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的:探讨理想的人成骨细胞体外培养的方法。方法:取人髂骨松质骨,同时结合骨组织块法和酶消化法分离培养人成骨细胞。结果与结论:分离培养的人成骨细胞生长状态良好,纯度较高。细胞贴壁生长,形态多样化,多呈多边形、纺锤型、梭形、三角形,胞浆丰富向外伸展出生长突,具有典型的成骨细胞形态特征;细胞增殖良好,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性。说明联合骨组织块法和酶消化法可成功分离培养人成骨细胞,是进行人成骨细胞体外培养较为理想的方法。

一步酶消化法高效快速分离培养人头皮毛乳头细胞

目的寻求高效、快速体外培养人头皮毛乳头细胞的方法。方法将含有毛囊中下部的皮下脂肪剪碎,加入胶原酶Ⅰ进行消化,以吸管机械吹打帮助毛乳头游离后进行培养;对其贴壁率、细胞迁出率、工作强度、污染机会与显微解剖法、显微解剖加酶消化法进行比较。结果“一步酶消化法”能显著降低工作强度、减少污染机会,并保留了显微解剖加酶消化法促进毛乳头贴壁和细胞迁出的优点。结论“一步酶消化法”是一种高效、快速分离培养人头皮毛乳头细胞的方法。